高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類(lèi)化合物

1、高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類(lèi)化合物第37卷2009年9月分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究簡(jiǎn)報(bào)ChineseJournalofAnalyticalChemistry第9期13541358高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類(lèi)化合物趙淑杰韓梅韓忠明李彥穎楊利民(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,長(zhǎng)春130118)摘要采用高速逆流色譜(HSCCC)與其它色譜聯(lián)用的方法分離純化鹿藥中的化學(xué)成分,得到5個(gè)黃酮類(lèi)化合物:5,7,3,4一四羥基.3一甲氧基-8.甲基黃酮(1),8-甲基木犀草素(2),3一甲氧基木犀草素(3),木犀草素(4)和槲皮素(5),它們均為首次自該種及該屬植物中分離得到.HSCCC以(

2、氯仿):V(甲醇):(水)=4:3:2混合液為溶劑,上相為固定相,下相為流動(dòng)相,分離純化得到3個(gè)分別含化合物1,4和5的主要部分,經(jīng)HPLC檢驗(yàn)純度分別為98.3%,96.7%和95.3%;還有1個(gè)含有化合物2和3的較純部分,通過(guò)SephadexLH-20柱色譜,以(甲醇):V(水):1:1混合液洗脫將二者分離.通過(guò)理化性質(zhì)及紫外,紅外,質(zhì)譜,核磁等波譜分析確定化合物結(jié)構(gòu).關(guān)鍵詞鹿藥,高速逆流色譜,黃酮類(lèi)化合物,木犀草素,槲皮素1引言鹿藥為百合科鹿藥屬植物鹿藥(SmilacinajaponicaA.Gray)的干燥根莖,是我國(guó)民間常用中藥.中藥大辭典中記載,性味甘,苦,溫,無(wú)毒,具有補(bǔ)氣益腎,

3、祛風(fēng)除濕,活血調(diào)經(jīng)功能,用于治療風(fēng)濕骨痛,神經(jīng)性頭痛,乳腺炎,月經(jīng)不調(diào),癰癤腫毒及跌打損傷等.鹿藥屬植物全世界約有25種,我國(guó)有l(wèi)4種,2個(gè)變種j,幾乎全國(guó)各地都有所分布,資源十分豐富,許多種為藥食兩用植物,根莖人藥,地上幼嫩部分是受人們喜愛(ài)的山野菜.已有人從中分離出皂苷類(lèi)化合物,藥理研究表明其具有抗真菌和抗腫瘤活性.吉林省中西部地區(qū)分布有鹿藥,興安鹿藥(S.dahuricaTurcz.exFisch.etMey)和三葉鹿藥(S.trifoliaDesf),野生資源儲(chǔ)量很大,特別是鹿藥,但尚未得到有效的研究,開(kāi)發(fā)與利用.對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究,將為探明其藥用功效和開(kāi)發(fā)新藥源提供參考依據(jù).高速逆流

4、色譜(HSCCC)與傳統(tǒng)色譜相比,具有對(duì)樣品無(wú)不可逆吸附,儀器操作簡(jiǎn)單,分離量大,樣品易回收,重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備.本研究采用高速逆流色譜結(jié)合其它色譜,從鹿藥中分離出5,7,3,4一四羥基一3.甲氧基一8一甲基黃酮,8.甲基木犀草素,3一甲氧基木犀草素,木犀草素和槲皮素共5個(gè)黃酮類(lèi)化合物.2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器,試劑與材料DL.IO00E智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);TBE一300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司);N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司);1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);FFIR.8400S紅外光

5、譜儀,UV一1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);AV400核磁共振儀(瑞士Broker公司);MATLCQ電噴霧質(zhì)譜儀(美國(guó)Finigan公司).DIO1型大孑L樹(shù)脂(天津市海光化工有限公司);SephadexLH-20(Pharmacia產(chǎn)品);甲醇與乙腈為色譜純(美FisherChemAlertGuide公司);水為純凈水;其余試劑為分析純.鹿藥采自吉林省九臺(tái)市土門(mén)嶺地區(qū),經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊利民教授鑒定確認(rèn).將其洗凈后自然陰干,機(jī)械粉碎,備用.2.2樣品制備取粉碎的鹿藥根莖2.80kg,加5倍體積的90%乙醇超聲提取3次,合并濾液并減壓濃縮至無(wú)醇味;2009-02-26收稿;2

6、009-04-28接受本文系吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重大項(xiàng)目(No.20075022)資助E?mail:ylmh777126.conl第9期趙淑杰等:高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類(lèi)化合物1355將浸膏水溶后過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱,依次用水及30%,50%,70%和90%的乙醇洗脫,每次洗脫至流出液無(wú)色為止,將各洗脫部分濃縮至干,備用.取70%乙醇洗脫部分(12g)干法上硅膠柱(粒徑0.0980.05mm),(氯仿):V(甲醇)=9:12:8,梯度洗脫,得7個(gè)流份;選取其中流份I(0.993g)和流份(0.490g)作為樣品進(jìn)行HSCCC分離.2.3兩相溶劑的選擇選擇兩相溶劑系統(tǒng)是通過(guò)目標(biāo)化合物的分

7、配系數(shù)K來(lái)確定的.值通過(guò)HPLC檢測(cè)確定,步驟如下:取大約1mg樣品放入試管中,加人已平衡的兩相溶劑系統(tǒng),上,下相溶劑各2.0mL,充分振搖溶解后靜置分層,分別取上,下相用HPLC檢測(cè),上相和下相的峰面積分別為A和A,分配系數(shù)K=A/A.2.4高效液相色譜分析采用HPLC檢測(cè)流份I和的成分及經(jīng)HSCCC分離后各色譜峰的純度.HPLC分析條件:Dikmac色譜柱(200mm4.6mm,5Ixm);流動(dòng)相為乙腈一水,梯度洗脫:0min,30%乙腈;20min,35%乙腈;30min,40%乙腈;40min,50%乙腈.流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫30.2.5高速逆流色譜分離條

8、件按(氯仿):V(甲醇):V(水)=4:3:2將所有溶劑加入分液漏斗中,充分振搖后靜置24h分相;上相為固定相,下相為流動(dòng)相,上,下相超聲脫氣20min;主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r/min;流動(dòng)相流速為2.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分.分離所得化合物通過(guò)uV,IR,HNMR,CNMR和MS等方法檢測(cè)并確定其結(jié)構(gòu).3結(jié)果與討論3.1樣品的高效液相色譜圖流份I和流份的HPLC色譜圖(圖1)顯示,流份I中有4個(gè)主要峰,分別為化合物1,2,3和4;流份中有1個(gè)主要峰,為化合物5.3.2HSCCC溶劑系統(tǒng)選擇溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離效果的最重要因素.根據(jù)色譜理論,利用H

9、SCCC分離樣品的必要條件是樣品在兩相中具有合適的分配系數(shù)(0.5<K<2.0),可用HPLC,EC,TLC測(cè)定.本研究采用HPLC測(cè)定,共考察了5個(gè)溶劑系統(tǒng),結(jié)果見(jiàn)表l.表15個(gè)化合物在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)()Table1Partitioncoeflqcients(K)offivecompoundsindifferentsolventsystems溶劑系統(tǒng)坌里墨墼!Solventsystems(WV)12345Chloroformmethanolwater(4:3:2)0.711.050.770.821.23Chloroformmethanolwater(4:3:310.97

10、0.870.730.550.97Chloroformmethano1.water(5:3:21.321.181.221.o61.5OEthylacetateH.butano1.water(2:1:3)6.767.6110.5917.5815.11Ethvlacetatenbutanolwater(4:1:5)1.631.822.62.042.34本實(shí)驗(yàn)最終選擇了(氯仿):V(甲醇):V(水)=O1O20300102030t/mint/min圖1流份I(A)和流份(B)的HPLC色譜圖Fig.1HPLCchromatogramsofeluateI(A)andeluateII(B)4:3:2體系,

11、利用此體系分離樣品,各化合物分配系數(shù)合理,固定相保留率高達(dá)73%,分離效果好.HSCcc分離情況見(jiàn)圖2,流份I(200mg)經(jīng)HSCCC分離得a(10mg),b(2Omg),c(9.5mg)3個(gè)主要組分;流份11(200mg)經(jīng)HSCCC分離得b(3mg),c(10.2mg),d(8.2mg)3個(gè)主要組分.3.3純度檢驗(yàn)經(jīng)HSCCC分離所得主要峰通過(guò)HPLC檢驗(yàn)(圖3),峰a,c和d較純,分別含化合物1,4和5,純度分別為98.3%,96.7%和95.3%;峰b中含有化合物2和3,用峰面積歸一法確定分別占43.5%和56.4%,再通過(guò)SephadexLH-20柱色譜,用(甲醇):(水)=1:1

12、洗脫而被分離.1356分析化學(xué)第37卷圖2流份I(A)和流份1I(B)的HSCCC色譜圖Fig.2HSCCCchromatogramsofeluateI(A)andeluatelI(B)2O3OOlO2O300t/minlO2O300t|rainlO2030tmin圖3HSCCC主要峰的HPLC色譜圖Fig.3HPLCchromatogramoffractionsobtainedbyhighspeedcountercurrentchromatography(HSCCC)3.4結(jié)構(gòu)鑒定I3.4.1化合物1的鑒定黃色粉末;m.P.250252C;HC1一Mg粉反應(yīng)陽(yáng)性.uVA(nm):(MeOH)

13、261,274(sh),358,(MeOH+AIC13)281,424,(MeOH+A1C13+HCI)276,358.IR(KBr)/-max/cm:35253361(強(qiáng)寬峰,OH),2939,1647(共軛CO),1616,1514,1490,1436,1384,1355,1296,1276,1217,1161,1135,1118,1099,1012,900,850和802.HNMR(400MHz,CD3OD)6:7.773(1H,d,J=2.0Hz,H-2),7.668(1H,dd,J=8.39,2.0Hz,H-6),7.006(1H,d,J=8.39Hz,H一5),6.324(1H,s

14、,H一6),2.332(3H,s,C8一CH);A環(huán)有5,7一二OH取代結(jié)構(gòu),3.875(3H,s,C-OCH3);CNMR(100MHz,CDOD):180.58(C4),163.82(C一7),160.69(C-5),158.04(C-9),156.04(C一2),150.26(C_4),146.84(C一3),139.65(C一3),123.61(C一1),122.61(C-6),116.79(C-5),116.69(C-2),103.86(C一10),103.69(C一8)因連有一CH,C8化學(xué)位移向低場(chǎng)移9(10),99.4(C-6),6O.77(C3一OCH)顯示其應(yīng)連在芳環(huán)或雙鍵

15、碳上,且有兩個(gè)鄰位含氧取代基團(tuán),所以一0CH與C一3相連,8.00(C8一CH).ESIMSm/z:331M+1,316M+1一CH3,315MCH3,288MCH3一CO,273MCH3一COCH3,270MCH3一COH2O,242270一CO,167RDAA.+1和150AIOH,結(jié)合CNMR數(shù)據(jù)可推知化合物分子式為cH.O,A環(huán)有2個(gè)一OH,1個(gè)一CH,其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)9報(bào)道的3-0一甲基一8一C一甲基槲皮素一致,分析表明,確定化合物1為5,7,3,4一四羥基一3一甲氧基一8.甲基黃酮,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖化合物2的鑒定棕綠色粉末;m.P.271273(分解);HC1一Mg粉反應(yīng)

16、顯紅色;UVA/nm:(MeOH)253,272(sh),349,(MeOH+AICI)277,420,(MeOH+A1C1+HC1)275,298,354;ESI-MSm/z:301M+1,結(jié)合CNMR數(shù)據(jù)推知分子式為cH.2O6;IR(KBr)Vmax/(cm):3384(尖峰,OH),2966,1653,1617,1576,1559,1520,1418,1385,1360,1281,1258,1190,1122,1003,872,839,816,791,762.HNMR(400MHz,CDOD)6:7.538(1H,d,.,:1.8Hz,H一2),7.507(1H,dd,J=8.3,1.

17、8Hz,H-6),7.010(IH,d,J=8.3Hz,H-5),6.638(1H,s,H一6),6.352(1H,s,H一3),2.382(3H,s,c8一CH).CNMR(100MHz,CDOD):184.60(c4),166.50(C-2),163.97(C-7),160.91第9期趙淑杰等:高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類(lèi)化合物1357(C-5),156.98(C-5),151.26(C_4),147.39(C-3),124.33(C一1),120.54(C-6),117.15(C-5),114.43(C一2),105.54(C一10),104.15(C一8),103.76(C-3)

18、,99.67(C一6),8.08(C8一CH).綜合以上分析,確定化合物2為5,7,3,4一四羥基-8-甲基黃酮(即8-甲基木犀草素),其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖化合物3的鑒定黃色羽毛狀結(jié)晶;in.P.257259qC(分解);HC1一Mg粉反應(yīng)顯紅色;UVA/nm:(MeOH)255,274(sh),339;HOR1.Rt=OCH3;R2=H,R3=CH3,RH2.R=R=H,R=CH3,R=oH;OH3.R=R=R3=H,R4=OCH4.R=R=R3=H.R=OH:5R=R4=OH,R2=R3=H.圖4鹿藥中5種黃酮化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.4Chemicalstructuresoffiveco

19、mpoundsfromS.japonica1.5,7,3,4-四羥基-3一甲氧基.8一甲基黃酮(5,7,3,4-Tetrahydroxy-3一methoxy一8一methylflavone);2.8-甲基木犀草素(8一methylluteolin);3.3一甲氧基木犀草素(3-Methoxyluteolin);4.木犀草素(Luteolin);5.槲皮素(Quercetin).IR(KBr)max/Cm:3440(尖峰,OH),2997,2950,1653(共軛CO),1603,1561,1491,1450,1406,1360,1275,1217,1171,1117,1016,978,831,

20、789,638.ESIMSIn/z:301M+1,結(jié)合CNMR數(shù)據(jù)推知分子式為C6H12O6oIHNMR(400MHz,CD3OD)6:7.712(1H,d,J=1.8Hz,H-2),7.623(1H,dd,J=8.3,1.8Hz,H-6),6.991(1H,d,J=8.3Hz,H-5),顯示B環(huán)中有3,4-二氧取代;6.479(1H,d,J=1.6Hz,H一8),6.285(1H,d,J=1.7Hz,H),顯示A環(huán)為5,7.二羥基取代結(jié)構(gòu);6.342(1H,s,H.3),3.873(3H,s,一OCH);CNMR(100MHz,CD30D):184.60(C4),166.50(C-2),16

21、3.97(C-7),160.91(C-5),156.98(C一9),151.26(C-4),147.39(C一3),124.30(C一1),122.62(C-6),117.14(C-2),116.73(C-5),104.16(C.10),103.73(C-3),100.14(C-6),95.06(C一8),60.81(一OCH).CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)10基本一致.綜上分析,確定化合物3為5,7,4一三羥基-3-甲氧基黃酮(即3.甲氧基木犀草素),見(jiàn)圖化合物4的鑒定黃綠色小針晶;in.p.328330(2;HC1-Mg反應(yīng)顯紅色;ESIMSm/z:285M一1一,5712M一1一;其

22、HNMR和BCNMR與文獻(xiàn)11報(bào)道的木犀草素(Luteolin)數(shù)據(jù)基本一致.與木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC對(duì)照,在多種溶劑系統(tǒng)中R值一致,故確定化合物4為木犀草素,其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖化合物5的鑒定黃色粉末;in.P.312314;HC1一Mg反應(yīng)顯紅色;ESI-MSm/z:301M一1一,6032M一1一;其HNMR和CNMR與文獻(xiàn)12報(bào)道的槲皮素(Quercetin)數(shù)據(jù)基本一致.與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC對(duì)照,在多種溶劑系統(tǒng)中R值一致,二者混合熔點(diǎn)不變,故確定化合物5為槲皮素,其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4.以上5種化合物均為首次自鹿藥該種及該屬植物中分離得到.References1StateAdmini

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