高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選_食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文

1、高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選目 錄前言- 2 -1 材料與方法- 3 -1.1材料- 3 -1.2試劑- 3 -1.3儀器設(shè)備- 3 -1.4試驗(yàn)方法- 3 -1.4.1技術(shù)路線- 4 -1.4.2菌種分離- 4 -1.4.3菌株培養(yǎng)條件的研究- 5 -2結(jié)果與分析- 6 -2.1初篩結(jié)果- 6 -2.2復(fù)篩結(jié)果- 6 -2.3菌種形態(tài)觀察- 7 -2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果- 7 -2.4.1碳源對菌株產(chǎn)酶能力的影響- 7 -2.4.2氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響- 7 -2.4.3表面活性劑對菌株產(chǎn)酶活性的影響- 8 -2.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)果膠酶的影響- 8 -2.4.5發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)果

2、膠酶的影響- 8 -2.5正交試驗(yàn)結(jié)果- 9 -3 結(jié)論- 10 -參考文獻(xiàn)- 11 -致謝- 13 -高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選摘要：本試驗(yàn)采用平板分離法，從腐爛的水果（蘋果、梨、棗、甜瓜、籽瓜）中進(jìn)行高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選。同時(shí)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：菌種的最適碳源為葡萄糖，濃度為1.5%；最適氮源為蛋白胨，濃度為0.6%；最佳表面活性劑為吐溫-60，濃度為0.01%；最適pH值為3.8；最適發(fā)酵溫度為43。在此條件下菌株的產(chǎn)酶能力可以達(dá)到10758 u/.mL。關(guān)鍵詞：果膠酶，篩選，培養(yǎng)條件優(yōu)化前言果膠酶（pectinases）是指能分解果膠質(zhì)的多種酶

3、的總稱，不同來源的果膠酶其特點(diǎn)也不同，微生物來源的果膠酶主要有聚半乳糖醛酸酶(PG)，聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL）和果膠酯酶(PE)1。PG在果膠酶系中發(fā)現(xiàn)較早，它可以水解D-半乳糖醛酸-1,4糖苷鍵，產(chǎn)物為單半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸；PGL通過切斷果膠分子-1,4糖苷鍵，生成具有不飽和鍵的半乳糖醛酸酯；PMGL可以切斷果膠分子-1,4糖苷鍵，產(chǎn)物為28個(gè)糖醛酸單位的不飽和的甲基半乳糖酸低聚物；PE能夠使果膠中的甲酯水解，生成果膠酸和甲醇2。產(chǎn)果膠酶的菌種一般可以從腐爛的果蔬以及果園泥土中的微生物中利用果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中篩選出來。野生菌株的酶活力往

4、往很低，必須對其進(jìn)行誘變及發(fā)酵條件的優(yōu)化等以改善菌株的產(chǎn)酶性能。果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)均采用微生物發(fā)酵方法進(jìn)行。產(chǎn)生果膠酶的微生物如表1所示3。表1 常用產(chǎn)果膠酶菌種微生物產(chǎn)果膠酶菌屬霉菌Aspergillus、Penicillium、Rhizopus、Fusarium細(xì)菌Erwinia、Pseudomonas、Bacillus、Clostridium酵母Trichosporm、Kluyveromyces、Saccharomyces、Aureobasidium商品酶制劑的生產(chǎn)菌主要是一些真菌。包括Aspergillus Niger，Rhizopus oryzae，Rhizomucor meihei

5、等。Reddy(1997)概括了曲霉屬中產(chǎn)果膠酶的一些菌種，主要有A.flavus，A.niger，A.terreus，A.sydowii等。其中黑曲霉是國際公認(rèn)的安全菌株，它的代謝產(chǎn)物可以直接應(yīng)用于食品4。果膠酶在工業(yè)中的應(yīng)用十分廣泛，主要集中在果汁果酒的澄清、果蔬汁的提取5、對水果和蔬菜進(jìn)行浸解、液化以生產(chǎn)單細(xì)胞果汁和菜汁、果實(shí)脫皮、木材防腐、棉織物精煉加工等方面6。國內(nèi)對果膠酶的研究始于20世紀(jì)60年代。八十年代以來我國學(xué)者對果膠酶菌種選育進(jìn)行了廣泛的研究。田英華等選育了一株高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉突變株 HYA4，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下酶活力達(dá)1285 U/g7。全桂靜等利用平板菌落法，從腐爛的

6、南果梨樣品中分離篩選得到果膠酶高產(chǎn)菌株As2，果膠酶活性達(dá)到6 635U/g干曲8。Albert等人利用不同真菌之間的協(xié)同效應(yīng)將Aspergillus niger和Fusarium moniliforme進(jìn)行混合培養(yǎng)，產(chǎn)生的果膠酶的活性可以達(dá)到1，041.6units/g dry weight)，是單獨(dú)培養(yǎng)Aspergillus niger的1.7倍9。試驗(yàn)采用平板分離法，從腐爛的水果（蘋果、梨、棗、甜瓜、籽瓜）中進(jìn)行高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選。同時(shí)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為降低企業(yè)生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)果膠酶的國產(chǎn)化提供一定的技術(shù)支撐。1 材料與方法1.1材料蘋果、梨、棗

7、、甜瓜、籽瓜：市售。1.2試劑果膠（美國sigma公司），硝酸銨，硫酸鈉，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵，磷酸氫二鉀，硝酸鈉，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，可溶性淀粉，硫代硫酸鈉，碘，碘化鉀，可溶性淀粉，硫酸銨，馬鈴薯，蔗糖，葡萄糖等。1.3儀器設(shè)備微量移液器（Finnpipette，上海雷勃分析儀器有限公司），搖床（SHA-C，金壇市恒豐儀器廠），高壓滅菌鍋（YX-280B型，上海綠宇精密儀器制造有限公司），電磁爐，水浴鍋，燒杯，試管，培養(yǎng)皿，接種針，碘量瓶，酸式滴定管等。1.4試驗(yàn)方法1.4.1技術(shù)路線采樣富集培養(yǎng)初篩復(fù)篩培養(yǎng)條件優(yōu)化1.4.2菌種分離 培養(yǎng)基配方富集培養(yǎng)基：果膠2%，硝酸銨

8、0.2%，硫酸鈉0.05%。選擇培養(yǎng)基：果膠0.1%，蔗糖2.0%，硫酸鎂0.05%，氯化鉀0.05%，硫酸鐵0.001%，磷酸氫二鉀0.1%，硝酸鈉0.3%。菌種保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：橘皮粉4 g，硫酸銨2g，三水磷酸氫二鉀 0.3g，氯化鉀0.6 g，七水硫酸鎂0.55g。 篩選參考張浩森（2008）方法10，進(jìn)行產(chǎn)果膠酶菌株的篩選：（1）增殖培養(yǎng)：取采集的果園土及果蔬的腐爛部分少量，放入500mL裝有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，于30、180 rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，得增殖培養(yǎng)液。（2）菌株的初篩：取增殖培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法涂布于選擇培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)3天，

9、加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%十六烷基三甲基溴化銨(多糖沉淀劑)，靜止10min，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的為產(chǎn)果膠酶的菌株。（3）菌株的復(fù)篩：挑取Dp/Dc較大的幾個(gè)菌落，劃線接種于選擇培養(yǎng)基上于37條件下培養(yǎng)3d，測定粗酶液酶活。酶活測定參考孫越（1997）、陳靜（1999）方法11,12，進(jìn)行酶活測定：（1）酶液制備：將發(fā)酵液于4，8000r/min離心10min后取上清液作為粗酶液。（2）1%果膠溶液配制：取果膠粉1g，加熱溶解，煮沸，冷卻后過濾，調(diào)節(jié)pH值至3.5，定容至100mL。（3）酶活測定：取兩個(gè)100mL三角瓶，一個(gè)為酶液瓶(A瓶)，一個(gè)為空白瓶(B瓶)，并分別在A瓶、B瓶中各加

10、入10mL的1%果膠溶液，A瓶加5mL重蒸餾水和5mL酶液后調(diào)整pH值至3.5，B瓶中加10mL重蒸餾水，40水浴，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1h，立即加熱煮沸使酶失活，冷卻至室溫。取上述A瓶、B瓶中溶液各5mL，分別加入另外兩個(gè)三角瓶A1、B1瓶中，然后各加1mL濃度為1mol/L的碳酸鈉溶液搖勻，再各加5mL濃度為0.05mol/L碘-碘化鉀溶液于兩個(gè)三角瓶中，搖勻，加塞，放置20min，再分別吸取2mL濃度為1mol/L硫酸加入上述兩個(gè)三角瓶，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淡黃色時(shí)停止滴定，加入1mL濃度為0.5%的淀粉指示劑，此時(shí)溶液呈蘭色，繼續(xù)滴定至蘭色消失為止，記下消耗的硫代硫酸鈉體積：A1瓶

11、為AmL，B1瓶為BmL。（4）數(shù)據(jù)處理：在上述條件下，將每小時(shí)酶促催化果膠分解成1mg游離的半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活性單位，具體計(jì)算公式如下；活性單位數(shù)/毫升酶液=(B-A)M0.5120/(515)式中：B空白消耗硫代硫酸鈉溶液體積(mL) A試樣消耗硫代硫酸鈉溶液體積(mL) M硫代硫酸鈉摩爾濃度 0.511摩爾硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51g游離半乳糖醛酸 20反應(yīng)液體積(mL) 5吸取反應(yīng)液體積(mL) 1反應(yīng)時(shí)間(h)1.4.3菌株培養(yǎng)條件的研究 單因素試驗(yàn)（1）葡萄糖對菌株產(chǎn)果膠酶的影響分別以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%葡萄糖添加量作為發(fā)酵培

12、養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn), 同時(shí)測定酶活，以確定發(fā)酵碳源最適添加量。（2）蛋白胨對菌株產(chǎn)果膠酶的影響分別以0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%蛋白胨添加量作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn), 同時(shí)測定酶活，以確定發(fā)酵氮源最適添加量。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基中表面活性劑對菌株產(chǎn)果膠酶的影響分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%Tween-60表面活性劑，進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中添加表面活性劑最適添加量。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)果膠酶的影響調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別為3.5、4、4.5、5、5.5，進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)。測定各個(gè)pH值下的

13、菌株產(chǎn)酶能力。（5）發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)果膠酶的影響分別在30、35、40、45、50對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，測定各個(gè)溫度下的菌株產(chǎn)酶能力。正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對碳源葡萄糖（A），氮源蛋白胨（B），表面活性劑吐溫-60（C），發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH（D）和發(fā)酵溫度（E）五個(gè)因素進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，因素水平編碼值如表2。以果膠酶活力為評價(jià)指標(biāo)，確定菌株最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。表2 因素水平編碼表碼值因 素A(%)B(%)C(%)DE()44.44734.24524.04313.84

14、 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行處理2結(jié)果與分析2.1初篩結(jié)果初篩結(jié)果透明圈大小及Dp/ Dc值見圖1及表3。 圖1 初篩結(jié)果表3 菌株透明圈Dp/ Dc值菌株Dp(cm)Dc(cm)Dp/ DcA6A8A5A2A22.2復(fù)篩結(jié)果對Dp/Dc值最大的三株菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，測定其果膠酶活力。測定結(jié)果如表4。表4 復(fù)篩酶活力比較菌株酶活（u/mL）A17692.1A29632.5A36543.52.3菌種形態(tài)觀察 通過革蘭氏染色在顯微鏡下觀察到該菌株為革蘭氏陰性短桿菌。

15、2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果2.4.1碳源對菌株產(chǎn)酶能力的影響圖2葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖2可知，隨著葡萄糖含量的逐漸增加，菌株的產(chǎn)酶能力先急劇增強(qiáng)再緩慢下降，當(dāng)碳源葡萄糖的濃度為1.5%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力最高，達(dá)到7013 u/mL，因此可得，菌株的最佳碳源葡萄糖濃度為1.5%。2.4.2氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響圖3蛋白胨添加量對菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖3可知，隨著蛋白胨添加量的逐漸增加，菌株的產(chǎn)酶能力表現(xiàn)為先上升后下降的變化，當(dāng)?shù)吹鞍纂说臐舛葹?.6%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力最高，達(dá)到8791 u/mL，因此可得，菌株的最佳氮源蛋白胨的濃度為0.6%。2.4.3表面活性劑對菌株產(chǎn)酶活性的影響

16、圖4不同表面活性劑添加量對菌株產(chǎn)酶的影響圖4表面活性劑添加量對菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖4可知，隨著表面活性劑添加量的逐漸增加，菌株的產(chǎn)酶能力變化幅度不大，當(dāng)表面活性劑的濃度為0.03%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力出現(xiàn)峰值，達(dá)到9224 u/mL，因此選擇菌株發(fā)酵的最佳表面活性劑添加量為0.03%。2.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)果膠酶的影響圖5 pH值對菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖5可知，隨著pH值的逐漸升高，菌株的產(chǎn)酶能力表現(xiàn)為先升高再降低趨勢。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，菌株的產(chǎn)酶能力達(dá)到最大值為8653 u/mL，隨著pH值的進(jìn)一步升高，菌株的產(chǎn)酶能力逐漸下降。這主要是因?yàn)閜H值的改變首先導(dǎo)致培養(yǎng)基的成分發(fā)

17、生變化，不利于菌株的利用，另外是由于pH值升高超出了產(chǎn)物酶的最適pH值范圍，致使測定結(jié)果偏低。2.4.5發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)果膠酶的影響 圖6 不同溫度對菌株產(chǎn)酶的影響由圖6可知，隨著溫度的逐漸升高，菌株的產(chǎn)酶能力表現(xiàn)為先升高再降低的變化。當(dāng)溫度為45時(shí)，產(chǎn)酶能力達(dá)到最大值為9865 u/mL，隨著溫度的繼續(xù)升高，菌株的產(chǎn)酶能力表現(xiàn)為下降。2.5正交試驗(yàn)結(jié)果由表5可知影響菌株產(chǎn)酶性能的主次因子依次為DCE AB，即發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH表面活性劑吐溫-60發(fā)酵溫度碳源葡萄糖氮源蛋白胨。選取最佳組合為：A3B1C4D4E3，即葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐溫-60添加量0.01%，發(fā)酵培養(yǎng)基初

18、始pH值3.8，發(fā)酵溫度43。在此條件下菌株的產(chǎn)酶能力可以達(dá)到10758 u/mL。表5 正交試驗(yàn)結(jié)果處理因素試驗(yàn)結(jié)果（u/mL）ABCDE1111115888.32122223031.631333310040.34144443206.55212345771.76221436354.77234124547.48243216471.39313421399.2103243110552.311331242506.912342136762.813414235013.8144231410463.315432413381.416441326063.2K15541.6757600.4755203.27535

19、85.4506373.325K25786.2754518.2504736.8754255.9003760.350K36320.4255119.0005830.0006915.4507042.900K45305.3003082.2257093.5258106.8755487.1003 結(jié)論3.1由腐爛的大棗中篩選出的菌株初步鑒定為革蘭氏陰性短桿菌。3.2由單因素試驗(yàn)得出菌株的最佳碳源為1.5%葡萄糖，最佳氮源為0.6%蛋白胨，最佳表面活性劑為0.03%吐溫-60，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH4.0，發(fā)酵溫度45。3.3由正交試驗(yàn)得出菌株的最適發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐溫-60添加

20、量0.01%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值3.8，發(fā)酵溫度43。在此條件下菌株的產(chǎn)酶能力可以達(dá)到10758 u/mL。參考文獻(xiàn)1王璋,食品酶學(xué).北京輕工業(yè)出版社,1990,164-1752周人綱,白玉山,KGierschner.果膠裂解酶的分離、提純及特征,微生物學(xué)通報(bào),1990,17(2):88-923趙麗莉,微生物果膠酶研究及其在果蔬加工中的應(yīng)用進(jìn)展,2007,7(6):951-9534欽傳光,丹娃倫亭娜,丁諾狄安娜.果膠酶高產(chǎn)菌種的篩選J,中國釀造,2000,3(4):14-155趙允麟,趙莉.黑曲霉復(fù)合酶的調(diào)節(jié)與控制M.工業(yè)微生物,2001.9,31(3):19-226Sakai,Yozaki

21、.ProtoPectin Solubilizing enzyme that does not catalyze the degradation of Polygalacturonie acid.Agric.Biol.Chem,1988,52(4):1091一10937田英華,劉曉蘭,鄧永平.果膠酶高產(chǎn)菌Aspergillus niger HYA4的選育J;齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào),2005(1):14-16 8全桂靜.果膠酶高產(chǎn)霉菌的篩選及固體發(fā)酵條件的優(yōu)化.沈陽化工學(xué)院學(xué)報(bào),2008,22(1):36-409 Ivanka Stoilova & Albert Krastanov. Overprodu

22、ction of Laccase and Pectinase by Microbial Associations in Solid Substrate Fermentation.Appl Biochem Biotechnol,1988，52(4):1091-109310張浩森,繆靜,余曉斌.果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究,生物學(xué)雜志:2008,25(1)11孫越.果膠酶活性的測定方法J,食品科技,1997(3):37-3812陳靜,王淑軍,楊從發(fā),等.果膠酶產(chǎn)生菌的選育J,淮海工學(xué)院學(xué)報(bào), 1999(3):63-65Screening of Strain Producing Pectin

23、aseGong Yali (College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, 05 Class of Food Science and Engineering)Abstract：Strain（G-） producing pectinase highly was screened through plate method from rotten fruit including apple, pear, Jujube, seed watermelon. Single factor test and L16

24、(45) design were used to optimize the liquid submerged fermentation condition. The result showed that, carbon source concentration of fermentation 1.5%, nitrogen concentration 0.6%, surfactant concentration 0.01%;intial pH of fermentation 4.0 and fermentation temperature 40. The production under thi

25、s condition can reach 10758 u/mL.Key words: Pectinase, Screening, Optimizing of fermentation condition致謝本論文是在韓舜愈老師、祝霞老師、王媛師姐的悉心指導(dǎo)下完成的。他們從論文的選題到論文的審閱和定稿都付出了大量的心血。導(dǎo)師在科學(xué)探索中所表現(xiàn)出的敏銳洞察力和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度以及一絲不茍的敬業(yè)精神，給我留下深刻印象，在此特向?qū)熤乱陨钌畹木匆夂驼\摯的感謝。試驗(yàn)過程中還得到了刁望強(qiáng)等同學(xué)的親切指導(dǎo)和熱心幫助，在這里一并向四年來所有幫助與關(guān)心支持過我的老師和同學(xué)們表示衷心的感謝。9JWKffwvG#t

26、YM*Jg&6a*CZ7H$dq8KqqfHVZFedswSyXTy#&QA9wkxFyeQ!djs#XuyUP2kNXpR89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxG89AmUE9aQGn8xp$R#͑GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&

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