應(yīng)用RNAi抑制NSCs中NgR的表達(dá)來修復(fù)大鼠面神經(jīng)缺損

1、應(yīng)用RNAi抑制NSCs中NgR的表達(dá)來修復(fù)大鼠面神經(jīng)缺損目前，應(yīng)用神經(jīng)組織工程學(xué)的方法來促進(jìn)面神經(jīng)的再生和修復(fù)已成為當(dāng)今研究的新熱點(diǎn)，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞（，）移植到可吸收的神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)面神經(jīng)的缺損取得的不錯(cuò)的效果，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)來源于中樞的髓磷脂相關(guān)抑制物 （，），髓磷脂相關(guān)糖蛋白 （，），少突細(xì)胞髓磷脂糖 蛋 白 （，）是阻礙神經(jīng)再生的重要因素，這些因子都通過共同受體受體（，）起作用，因此，我們應(yīng)用抑制中的表達(dá)來探討修復(fù)大鼠面神經(jīng)缺損。材料與方法材料和試劑載體、感受態(tài)大腸桿菌α購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司、抗體購(gòu)自公司，各種胎牛血清、購(gòu)自公司，導(dǎo)管購(gòu)自上海天清生物公司，其規(guī)格為

2、內(nèi)徑，外徑。方法培養(yǎng)及鑒定 孕左右的大鼠，取其胚胎海馬組織，進(jìn)行的原代培養(yǎng)、半量換液，傳代。種植于涂有多聚賴氨酸的小玻片上，采用甲醛固定，血清封閉，分別加入相應(yīng)抗體等步驟后在顯微鏡下觀察染色情況。具體步驟見文獻(xiàn)。表達(dá)載體的構(gòu)建、擴(kuò)增及鑒定 根據(jù)的設(shè)計(jì)原則、載體的酶切位 點(diǎn) 以 及中的 編 碼 序 列（），參考文獻(xiàn)合成針對(duì)編碼區(qū)和（）（）為小發(fā)夾的靶向的片段。設(shè)計(jì)好的發(fā)夾送由上海生工有限公司定制合成，將人工合成的序列的兩條鏈，進(jìn)行等濃度的退火結(jié)合，加熱，然后降至室溫，形成具有粘性末端的互補(bǔ)雙鏈，后與酶切后載體產(chǎn)物在連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后將μ已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到瓊

3、脂培養(yǎng)液上，過夜培養(yǎng)，克隆產(chǎn)物測(cè)序鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染按照的說明書進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，于六孔板內(nèi)接種×細(xì)胞，加入 的進(jìn)行培養(yǎng)，將μ質(zhì) 粒 和μ先 分 別 用μ不 含 抗 生 素 和 血 清 的稀釋，后將稀釋的質(zhì)粒和混合，室溫孵育。把這μ混合物加入六孔板的培養(yǎng)液中，來回?fù)u晃以混勻。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒對(duì)照組。細(xì)胞于、 的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后更換為含抗生素和血清的培養(yǎng)液，后在熒光顯微鏡下觀察的表達(dá)，計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率。檢測(cè)中的表達(dá)分別取實(shí)驗(yàn)組和空質(zhì)粒對(duì)照組的，轉(zhuǎn)染后見明顯熒光，用冰預(yù)冷的洗次，加入細(xì)胞裂解液裂解抽提蛋白，按照實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作說明分別進(jìn)行蛋白定量，電

4、泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，及加入羊抗的抗體和兔抗羊的二抗進(jìn)行雜交、洗膜等操作后，把膜與化學(xué)發(fā)光底物室溫孵育，曝光光片，然后顯影定影。經(jīng)干擾后的分化干擾后把有明顯熒光的直接接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，置于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后加入的分化培養(yǎng)液，周后進(jìn)行干細(xì)胞的分化鑒定，用甲醛固定，血清封閉，分別加入抗體等方法進(jìn)行神經(jīng)元的鑒定，以未干擾的分化作為對(duì)照。在圖像分析軟件下在倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組觀察張蓋玻片，每張蓋玻片觀察個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算各組神經(jīng)元占總細(xì)胞數(shù)的比例，數(shù)據(jù)以珚±表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用檢驗(yàn)，以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干擾后移植入管，進(jìn)行場(chǎng)掃描電鏡觀察干擾后的生長(zhǎng)至培

5、養(yǎng)瓶的密度后，離心，去除上清液，加入培養(yǎng)液，吹打后，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞數(shù)約為（）×，取出細(xì)胞懸液μ加入細(xì)胞外基質(zhì)μ，形成混合液，將混合液注入培養(yǎng)液浸泡的管內(nèi)，將管置于培養(yǎng)皿中，移入培養(yǎng)箱。種植后后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁后加入干細(xì)胞的分化培養(yǎng)液，周后，送至同濟(jì)大學(xué)電鏡室進(jìn)行場(chǎng)掃描電鏡觀察。結(jié)果培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)左右可見數(shù)十個(gè)乃至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球，細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果示陽(yáng)性，誘導(dǎo)分化可見大量形態(tài)各異的神經(jīng)細(xì)胞，這些結(jié)果證實(shí)了所培養(yǎng)的細(xì)胞為。重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果及轉(zhuǎn)染結(jié)果構(gòu)建了個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒，分別命名為、，并經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)，所含目的基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，檢測(cè)

6、結(jié)果：轉(zhuǎn)染后，脂質(zhì)體組可抑制蛋白的表達(dá)，而裸質(zhì)粒組對(duì)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響（圖）。轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，、陰性對(duì)照組均可見較多細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，初步計(jì)算轉(zhuǎn)染效率為，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖）。轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元的分化結(jié)果：沉默了的，分化周后向神經(jīng)元分化的比例明顯高于未轉(zhuǎn)染組（圖），神經(jīng)元比例分別為±、±，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。場(chǎng)掃描電鏡觀察種植的管在分化周后可見導(dǎo)管壁上生長(zhǎng)著各種形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞（圖4）討論目前，面神經(jīng)斷傷后的再生與修復(fù)仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性難題。近年來組織工程修復(fù)神經(jīng)缺損已越來越受到重視，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中應(yīng)用移植到可吸收的神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)面神經(jīng)的缺損取得的不錯(cuò)

7、的效果，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)來源于中樞的、是阻礙神經(jīng)再生的重要因素，這些因子都通過共同受體起作用，現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)它們對(duì)損傷后中樞神經(jīng)的再生具有抑制作用，如果在基因水平下抑制的表達(dá)，可直接減輕髓磷脂相關(guān)抑制物的抑制作用。近年來發(fā)展迅速的小分子干擾技術(shù)，提供了這種可行性。干擾是指通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的小的雙鏈，誘導(dǎo)內(nèi)源性靶基因降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的，如何干擾成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。以實(shí)現(xiàn)基因沉默是將關(guān)于髓隣脂相關(guān)抑制因子的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為基因干擾策略，被認(rèn)為是目前的最佳干預(yù)靶點(diǎn)。等將可溶性的大鼠蛋白進(jìn)行膜內(nèi)注射，該蛋白融入了大鼠的區(qū)，觀察脊髓脊髓胸段半切斷的大鼠脊髓軸突變化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后軸

8、突再生明顯，而且功能明顯的。等的研究也發(fā)現(xiàn)基因缺陷小鼠脊髓全部橫斷周后行為學(xué)評(píng)估有了很大改善。在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中，有文獻(xiàn)報(bào)道坐骨神經(jīng)切斷后局部應(yīng)用可以減少損傷促進(jìn)能夠的恢復(fù)，但較少涉及到的表達(dá)。我們前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用移植修復(fù)周圍性面神經(jīng)的損傷，雖然實(shí)驗(yàn)證實(shí)有較好的神經(jīng)修復(fù)結(jié)果，但由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞來自于中樞的海馬組織，體內(nèi)外分化成膠質(zhì)細(xì)胞的比例要大于神經(jīng)元，髓磷脂相關(guān)抑制物的存在也進(jìn)一步抑制了神經(jīng)修復(fù)的結(jié)果。因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了表達(dá)載體質(zhì)粒，并通過穩(wěn)定的脂質(zhì)體介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染，的結(jié)果顯示干擾后中基因的表達(dá)較前減弱，轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元的分化比例也明顯高于轉(zhuǎn)染前，從而為我們下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供更好的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持?？傊狙芯砍晒Ω蓴_了中的表達(dá)，使向神經(jīng)元進(jìn)一步分化，能更有效促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，為促