酶的固定化與固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

1、 酶的固定化 輔酶的固定化 細(xì)胞的固定化 固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 固定化酶的應(yīng)用 酶在使用中的不足酶在使用中的不足1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸、堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響），2.不能回收，無(wú)法自動(dòng)化、連續(xù)化生產(chǎn)，3.產(chǎn)物分離純化增加困難。一、什么是固定化酶？一、什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)化學(xué)偶聯(lián)酶酶固定化固定化間歇間歇可溶可溶交聯(lián)包埋吸附間歇間歇連續(xù)連續(xù)固定化酶固定化酶是是19711971年年在美國(guó)舉行的第一次世界酶會(huì)議在美國(guó)舉行的第一次世界酶會(huì)議上推薦確定的。又稱上推薦確定的。又稱水不溶性酶、固相酶。

2、水不溶性酶、固相酶。5050年代開(kāi)始。將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，再與羧年代開(kāi)始。將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，再與羧 肽酸、淀粉酶等結(jié)合制成最早的固定肽酸、淀粉酶等結(jié)合制成最早的固定 化酶化酶19691969年。年。 用固定化氨基酰化酶拆分用固定化氨基?；覆鸱諨L-DL-氨基。氨基。 第一個(gè)工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。第一個(gè)工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。優(yōu)點(diǎn)：n 不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；n 可反復(fù)使用；n 可連續(xù)化生產(chǎn)；n 穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：固定化過(guò)程中往往會(huì)引起酶的失活，增加酶的成本（1 1）作用模型）作用模型可以連續(xù)進(jìn)行催化可以連續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)（適宜的底物反應(yīng)（適宜的底物濃度、溫度、濃度、溫度、pHpH值值）

3、以以羧甲基纖維素羧甲基纖維素固定固定葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶水解水解淀淀粉生產(chǎn)葡萄糖粉生產(chǎn)葡萄糖為例說(shuō)為例說(shuō)明明。（2 2）反應(yīng)機(jī)理）反應(yīng)機(jī)理載體的作用載體的作用： 保持酶的立體結(jié)構(gòu)保持酶的立體結(jié)構(gòu) 保護(hù)酶的活性中心保護(hù)酶的活性中心 保證酶的連續(xù)催化反應(yīng)保證酶的連續(xù)催化反應(yīng)（1）保護(hù)酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)不變。（2）避免不溶性載體與酶的活性中心發(fā)生作用（3）在溫和條件下進(jìn)行，避免高溫、高壓、強(qiáng)酸堿等化學(xué)方法、物理方法、物理與化學(xué)結(jié)合法三種化學(xué)方法、物理方法、物理與化學(xué)結(jié)合法三種。1.載體結(jié)合法載體結(jié)合法 將酶結(jié)合于水不溶性載體的一種固定化方法。 根據(jù)結(jié)合的方式不同，又可分為物理吸附、離子結(jié)合和共價(jià)結(jié)

4、合三種。 作用力：氫鍵、范德華力 、疏水鍵等 吸附劑 無(wú)機(jī)吸附劑（高嶺土、皂土、硅酸、氧化鋁等）有機(jī)吸附劑（纖維素、膠原等）比較受重視。 優(yōu)點(diǎn)：酶活性中心不易被破壞，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，操作簡(jiǎn)便。 缺點(diǎn)：酶與載體的結(jié)合力弱，酶易脫落。 吸附技術(shù)：a. 混合浴或振蕩浴吸附法b.反應(yīng)器中直接吸附法c. 電沉積法載體載體固定化酶固定化酶活性炭活性炭 淀粉酶、淀粉酶、 淀粉酶淀粉酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖淀粉酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化鋁氧化鋁葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶碳酸鈣凝膠碳酸鈣凝膠亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨

5、肽酶纖維素纖維素胰蛋白酶、核糖核酸酶胰蛋白酶、核糖核酸酶麩素麩素淀粉液化酶淀粉液化酶硅膠硅膠磷酸化酶磷酸化酶 通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體的固定化方法。 吸附劑 離子交換纖維素，離子交換葡聚糖，離子交換樹(shù)脂等。 比物理吸附的結(jié)合力要強(qiáng)，操作方便，條件溫和，可再生后反復(fù)使用。 缺點(diǎn)吸附力弱，不適宜的pH,高鹽濃度，高底物濃度，高溫等都能把吸附的酶解吸下來(lái)。 1969年最早用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化氨基?；妇褪鞘褂肈EAE-葡聚糖凝膠固定的。 通過(guò)共價(jià)鍵，把與酶蛋白活性無(wú)關(guān)的氨基酸功能基團(tuán)連接在不溶于水的載體上。（1 1）酶與載體反應(yīng)的主要功能基團(tuán)）酶與載體反應(yīng)的主要功能基團(tuán)游離羧基

6、：肽鏈游離羧基：肽鏈C C末端的末端的 羧基，天冬氨酸羧基，天冬氨酸 ，谷氨酸的，谷氨酸的羧基羧基 游離氨基：肽鏈游離氨基：肽鏈N N末端的末端的 氨基，氨基， 賴氨酸賴氨酸 氨基氨基巰基：半胱氨酸巰基：半胱氨酸羥基：絲氨酸，蘇氨酸羥基：絲氨酸，蘇氨酸酚基：酪氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：組氨酸咪唑基：組氨酸重氮化法重氮化法：具有氨基的不溶性載體（：具有氨基的不溶性載體（R RNHNH2 2）。）。 以稀鹽酸和亞硝酸鈉作用形成重氮化合物。以稀鹽酸和亞硝酸鈉作用形成重氮化合物。 多糖類衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃多糖類衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷烷 化化 法法：鹵族的乙酰衍生物鹵族的乙酰衍生物（

7、氯乙酰纖維素、溴乙酰纖（氯乙酰纖維素、溴乙酰纖 維素、碘乙酰纖維素）維素、碘乙酰纖維素） 含鹵族的高聚物含鹵族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）（3 3） 將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH89)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。 含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等)在堿性條件下，與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。 此方法固定化后相對(duì)酶活力比較高，且相當(dāng)穩(wěn)定，同時(shí)操作也簡(jiǎn)便。是最受歡迎的一種方法. 在酶分子與載體間形成肽鍵的固定化方法。主要是含羧基載

8、體，轉(zhuǎn)變成酰基疊氮氯化物，異氰酸鹽等活化形態(tài)的衍生物，然后與酶的游離氨基反應(yīng)，從而形成肽鍵。纖維素纖維素+ +鹽酸甲醇鹽酸甲醇CMCCMC甲酯甲酯肼肼CMCCMC酰肼酰肼CMCCMC疊氮化物疊氮化物NHNH2 2酶酶亞硫酸鈉亞硫酸鈉鹽酸鹽酸固定化酶固定化酶 CHCH2 2CO-NHCO-NH酶酶CMCCMCCHCH2 2COOHCOOH制備酰肼制備酰肼疊氮化物疊氮化物羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序 一般常用三氯三嗪基試劑活化纖維素，然后偶聯(lián)酶,與酶的氨基、酚羥基、巰基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶（交聯(lián)葡聚糖，瓊脂糖，多孔玻璃等）。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：酶與載

9、體結(jié)合較牢固，不易脫落，有利于長(zhǎng)酶與載體結(jié)合較牢固，不易脫落，有利于長(zhǎng) 時(shí)間使用。時(shí)間使用。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：制備條件復(fù)雜；酶蛋白活性中心易破壞制備條件復(fù)雜；酶蛋白活性中心易破壞2 共價(jià)交聯(lián)法雙功能試劑雙功能試劑與酶蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基作用，使與酶蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)，凝集成固定化酶酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)，凝集成固定化酶. 常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H： 酪氨酸的酚基酪氨酸的酚基 胱氨酸的胱氨酸的SHSH巰基巰基 N N末端的末端的a a氨基。氨基。 常用的雙功能或多功能試劑常用的雙功能或多功能試劑： 戊二醛戊二醛 聚甲叉雙碘乙酰胺

10、聚甲叉雙碘乙酰胺 雙重氮聯(lián)苯胺雙重氮聯(lián)苯胺 反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低。盡可能地降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間有利于固定化酶比活性的提高。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 固定化后，往往顆粒小，機(jī)械性能差。 酶先吸附在載體上，或者包埋在膠內(nèi)，微囊內(nèi)，再交聯(lián)或者固定成酶膜，或者酶網(wǎng)顆粒 酶本身不參與反應(yīng)，僅用物理方法把酶包埋在酶本身不參與反應(yīng)，僅用物理方法把酶包埋在凝膠細(xì)小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中。凝膠細(xì)小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中。包埋方法有兩種包埋方法有兩種：格子型固定化酶格子型固定化酶微型膠囊法微型膠囊法（1 1）原理）原理 以以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂丙烯酰胺、硅膠、淀粉

11、瓊脂等材料，在酶存等材料，在酶存在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細(xì)小多孔的在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細(xì)小多孔的網(wǎng)狀格子中。反應(yīng)為厭氧反應(yīng)。網(wǎng)狀格子中。反應(yīng)為厭氧反應(yīng)。酶液酶液丙烯酰丙烯酰胺胺N N，N N雙丙烯雙丙烯酰胺酰胺引聚劑：引聚劑：過(guò)硫酸銨、核黃素過(guò)硫酸銨、核黃素光照光照聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)凝膠酶塊凝膠酶塊固定化固定化酶酶切切割割凝膠或膜凝膠或膜酶酶聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠、淀粉酶淀粉酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 淀粉淀粉膽堿酯酶膽堿酯酶瓊脂瓊脂青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶（1 1）原理）原理 把酶包在超薄半透性把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成的聚合物膜中，

12、制成球狀含酶微型膠囊。球狀含酶微型膠囊。微囊直徑幾微米幾百微米。微囊直徑幾微米幾百微米。低分子底物可以自由通過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)。低分子底物可以自由通過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)。與酶反應(yīng)后的生成物被排除在微囊外，與酶反應(yīng)后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物質(zhì)不能通過(guò)微囊而被留在微囊中，酶本身是高分子物質(zhì)不能通過(guò)微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi)外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi)缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 單體很活躍。在膠囊化過(guò)程中要充分注意防單體很活躍。在膠囊化過(guò)程中要充分注意防 治酶的失活和變性。治酶的失活和變性。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： A A 制備條件溫和，制得的膠囊不易變化。

13、制備條件溫和，制得的膠囊不易變化。 B B 能很好地保存天然酶的活性和特性。能很好地保存天然酶的活性和特性。 C C 大小可任意調(diào)節(jié)，制備時(shí)間短。大小可任意調(diào)節(jié)，制備時(shí)間短。 特性特性制備方法制備方法共價(jià)鍵共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合法離子離子結(jié)合法結(jié)合法物理物理吸附法吸附法包埋法包埋法制法制法難難易易易易難難酶活力酶活力高高高高高高低低底物特異性底物特異性易變易變不變不變不變不變不變不變結(jié)合能力結(jié)合能力強(qiáng)強(qiáng)中中弱弱弱弱再生再生不可不可可能可能可能可能不可不可交聯(lián)法交聯(lián)法難難中中易變易變強(qiáng)強(qiáng)不可不可輔基的固定化 對(duì)于必需輔基的酶，固定化酶時(shí)一般將輔基同時(shí)固定。一般輔基分子和載體之間要接入0.51.0nm長(zhǎng)

14、的間隔基。將輔基共價(jià)結(jié)合于載體上之前，要考慮在輔基分子的適當(dāng)位置引入功能團(tuán)，如引入羧基或氨基，使之易與載體偶聯(lián)。磷酸吡哆醛，F(xiàn)AD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等可利用分子本身所具有的功能團(tuán)。將具有功能團(tuán)的輔基先與間隔基結(jié)合，再與活化的載體偶聯(lián)；或先使間隔基與活化載體結(jié)合，再與輔基偶聯(lián)。 輔酶與酶蛋白的結(jié)合是松弛的，在固定時(shí)要保證能與兩種酶都能有最恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。 將輔酶固定于一高分子上，然后用微囊法將輔酶和兩種酶一同包埋于微囊內(nèi)。 高分子化一般的順序是先在輔酶的一定部位引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán)或間隔基，生成輔酶的衍生物，然后再與水溶性高分子共價(jià)結(jié)合。 一、什么是固定化細(xì)胞？一、什么是固定化細(xì)胞

15、？ 通過(guò)各種方法將細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過(guò)程 細(xì)胞固定化包括：1.微生物細(xì)胞固定化2.植物細(xì)胞固定化3.動(dòng)物細(xì)胞固定化4.原生質(zhì)體固定化1.優(yōu)點(diǎn):(1)省去了酶的分離手續(xù)為多酶系統(tǒng)，無(wú)須輔因子再生。(2)細(xì)胞生長(zhǎng)快、而且多、反應(yīng)快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，排除產(chǎn)物抑制和消耗。(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定。 2. 缺點(diǎn)：(1)保持菌體的完整，防止菌體自溶。(2)防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)需抑制胞內(nèi)其他酶的活性防止副產(chǎn)物的形成。(3)細(xì)胞膜、壁會(huì)阻礙底物滲透和擴(kuò)散。1 1 原理原理 將細(xì)胞包進(jìn)將細(xì)胞包進(jìn)多孔載體多孔載體內(nèi)，內(nèi)，小分子的底物和產(chǎn)物

16、均可小分子的底物和產(chǎn)物均可 自由出入自由出入，而，而細(xì)胞卻不會(huì)漏出。細(xì)胞卻不會(huì)漏出。2 2 方法方法常用的包埋材料常用的包埋材料是：是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂包埋材料包埋材料菌種菌種酶系酶系用途用途 瓊脂瓊脂大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌谷氨酸脫羧酶谷氨酸脫羧酶青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶制造制造-酪蛋白酪蛋白 生產(chǎn)生產(chǎn)6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-APA)(6-APA)明膠戊二醛明膠戊二醛 短乳桿菌短乳桿菌鏈霉菌鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶從葡萄糖生產(chǎn)高果糖從葡萄糖生產(chǎn)高果糖漿漿聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺大腸桿菌大腸桿菌天門冬氨酸酶天門冬氨酸酶醋酸纖維素醋酸纖

17、維素大腸桿菌大腸桿菌青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶（裂解）（裂解）青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶（合成）（合成）生產(chǎn)生產(chǎn)6 6APAAPA生產(chǎn)半合成青霉素生產(chǎn)半合成青霉素1 1 原理原理 將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下與載體吸附或形成絡(luò)合物將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下與載體吸附或形成絡(luò)合物固定在載體上。固定在載體上。2 2 常用載體常用載體硅藻土、多孔玻璃、離子交換纖維素、離子樹(shù)脂硅藻土、多孔玻璃、離子交換纖維素、離子樹(shù)脂、DEAEDEAE纖維素。纖維素。3 3 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、載體易于再生。方法簡(jiǎn)單、載體易于再生。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，細(xì)胞易脫落結(jié)合力弱，細(xì)胞易脫落。載體載體菌體菌體酶酶用途用途離子交換

18、纖維離子交換纖維素素絲狀菌孢子絲狀菌孢子 轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶蔗糖的轉(zhuǎn)化蔗糖的轉(zhuǎn)化陰離子樹(shù)脂陰離子樹(shù)脂放線菌放線菌葡萄糖異構(gòu)葡萄糖異構(gòu)酶酶制造果糖制造果糖DEAE-DEAE-纖維素纖維素巨大芽孢桿巨大芽孢桿菌菌青霉素酰胺青霉素酰胺酶酶制造制造6APA6APA 固定化對(duì)酶活性及酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 相對(duì)活力固定化酶活力/相同蛋白量的游離酶活力100% 酶結(jié)合效率（加入的總酶活力未結(jié)合的酶活力）/加入的總酶活力100% 酶活力回收率固定化酶總活力/加入的總酶活力100% 當(dāng)固定化方法對(duì)酶活力沒(méi)有明顯影響時(shí)，酶結(jié)合效率與酶活力回收率近似。 氨基酰化酶20mL固定化，反應(yīng)后濾液及洗滌液共50m

19、L。若原酶活力1000u/mL，洗滌液活力20u/mL。0.5g固定化酶活力為100u（共得50g固定化酶）。問(wèn)固定化酶的相對(duì)活力是多少？回收率及結(jié)合率是多少？1.構(gòu)象改變、立體屏蔽 構(gòu)象改變:固定化過(guò)程中酶和載體的相互作用引起了酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致酶活性下降的一種效應(yīng)。多出現(xiàn)于吸附法和共價(jià)結(jié)合法。 立體屏障：載體的孔隙太小，或固定化的方式與位置不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成了空間障礙，因而底物與效應(yīng)物無(wú)法和酶接觸，從而影響酶活性的一種效應(yīng)。出現(xiàn)于包埋、吸附和共價(jià)結(jié)合法。 分配效應(yīng)是固定化載體親水、疏水性質(zhì)對(duì)底物、產(chǎn)物在微環(huán)境和宏觀體系之間發(fā)生的不等分配，從而改

20、變酶反應(yīng)系統(tǒng)組成的平衡而最終影響酶反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。 載體與底物帶相同電荷，KmKm 固定化酶降低了酶的親和力。 載體與底物電荷相反，靜電作用，KmKm 上面的效應(yīng)可以通過(guò)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度減弱而消除 (3)采用疏水載體時(shí)，底物是極性物質(zhì)，Km固定化后會(huì)升高。采用疏水載體時(shí)，底物是疏水物質(zhì)，Km固定化后會(huì)降低。 外擴(kuò)散：底物從液相主體向固定化酶的外表面擴(kuò)散，或產(chǎn)物從固定化酶外表面向液相主體的擴(kuò)散，外擴(kuò)散發(fā)生在催化反應(yīng)之前或之后。 內(nèi)擴(kuò)散：對(duì)一有微孔載體的固定化酶，底物從固定化酶外表面擴(kuò)散到微孔內(nèi)部，或產(chǎn)物沿相反途徑擴(kuò)散。對(duì)底物來(lái)說(shuō)，內(nèi)擴(kuò)散與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。酶固定化后，原有的某些性狀會(huì)產(chǎn)生一定變化。酶固定化后，