生物轉化小組技術報告課件

1、sdauPage 1sdau由NordriDesign提供 匯報人：張妍妍匯報人：張妍妍指導老師：張松指導老師：張松 劉新利劉新利匯報日期：匯報日期：2011-10-222011-10-22生物轉化小組技術報告生物轉化小組技術報告主要內容主要內容 一、薄層層析法（一、薄層層析法（TLC）二、硅膠柱層析分離二、硅膠柱層析分離sdauPage 3一、薄層層析法（一、薄層層析法（TLC）固固-液吸附色譜液吸附色譜優(yōu)點：設備簡單優(yōu)點：設備簡單，分析速度快，分析速度快； 高分辨能力，結果直觀高分辨能力，結果直觀。根據薄層層析硅膠型號分為：根據薄層層析硅膠型號分為： 硅膠硅膠 H、硅膠、硅膠 G、硅膠、硅

2、膠 HF254和和硅膠硅膠 GF254， 要求粒徑為要求粒徑為 540m。（氧化鋁）。（氧化鋁）用于小量樣品用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至幾到幾十微克，甚至0.01g）的分離的分離。 sdauPage 4TLC正相，極性大的物質先分離出來，極性小的后分離出來。正相，極性大的物質先分離出來，極性小的后分離出來。d1d2d12薄層色譜示意圖1： 比移值比移值Rf 小，極性強小，極性強2：比移值：比移值Rf 大，極性弱或非極性大，極性弱或非極性sdauPage 5（1）薄層板的制備薄層板的制備n 玻璃板：平整、光滑、洗凈后不附水珠。玻璃板：平整、光滑、洗凈后不附水珠。n 調漿：一般調漿：一般30g

3、硅膠加入硅膠加入100gCMC-Na水溶液（水溶液（0.3%0.5）順時針研磨，至無氣泡。順時針研磨，至無氣泡。 硅膠比例大，硅膠比例大，CMC-Na水溶液有沉淀，板易裂。水溶液有沉淀，板易裂。n 涂布：薄層要盡可能均勻光滑，厚度固定（根據實驗需要來確涂布：薄層要盡可能均勻光滑，厚度固定（根據實驗需要來確定）定）, 0.25 1mmn 存放：存放： 室溫晾干！硅膠板室溫晾干！硅膠板110活化活化30min，氧化鋁板在氧化鋁板在200 220烘烘4h ，放于干燥器中。，放于干燥器中。sdauPage 6（2）點樣）點樣n 樣品樣品的溶劑的溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯。甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙

4、酯。含水量越小越含水量越小越好。好。n 點樣：點樣斑點越小越好，點樣：點樣斑點越小越好，直徑一般以直徑一般以2 4mm為宜為宜，可重復，可重復點樣。點樣要輕，不可刺破薄層。點樣。點樣要輕，不可刺破薄層。n 點樣量：點樣量：樣品太少，斑點不清楚，難以觀察；樣品量太多，樣品太少，斑點不清楚，難以觀察；樣品量太多，往往出現斑點太大或拖尾現象，以至不易分開往往出現斑點太大或拖尾現象，以至不易分開。n 電吹風吹干或干燥器內晾干。電吹風吹干或干燥器內晾干。sdauPage 7（3）展開劑的選擇及配制）展開劑的選擇及配制n 展開劑的選擇：展開劑的選擇：Rf值在值在0.150.85之間。之間。n 常用溶劑及相

5、對極性：常用溶劑及相對極性：甲醇乙醇異丙醇乙氰氯仿乙酸乙酯二氯甲烷乙醚正己烷、石油醚甲醇乙醇異丙醇乙氰氯仿乙酸乙酯二氯甲烷乙醚正己烷、石油醚 強極性溶劑強極性溶劑 中等極性溶劑中等極性溶劑 非極性溶劑非極性溶劑 強極性：三氯甲烷強極性：三氯甲烷/甲醇甲醇 弱極性：丙酮弱極性：丙酮/石油醚石油醚n 混合溶劑極性高混合溶劑極性高/ /低低=1/3=1/3（V/VV/V）n Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, MeOH/ethyl a

6、cetate, CHCl3/ethyl acetatesdauPage 8n 展開劑的配制：展開劑的配制： 新鮮配制，新鮮配制，把各組成溶劑移入分液漏斗把各組成溶劑移入分液漏斗，使，使混合液充分混勻混合液充分混勻。n 展開劑的飽和：展開劑的飽和： 雙槽的展開缸雙槽的展開缸 缸內蒸氣飽和時間在缸內蒸氣飽和時間在30min左右，防止邊緣效應。左右，防止邊緣效應。 切勿使樣點侵入展開劑中。放板時動作要快。切勿使樣點侵入展開劑中。放板時動作要快。 展開劑前沿上升到樣點上方展開劑前沿上升到樣點上方8 10cm時取出薄層板時取出薄層板。sdauPage 9（4）溫濕度的控制）溫濕度的控制通常溫度越低分離越

7、好通常溫度越低分離越好，用空調或冰柜控制；，用空調或冰柜控制；濕度影響板的吸附能力，在另一展開槽放置相應濃度的硫酸。濕度影響板的吸附能力，在另一展開槽放置相應濃度的硫酸。（5）顯色（顯色劑：）顯色（顯色劑：通用、專屬通用、專屬）n 噴霧顯色：噴霧顯色：霧化器霧化器，均勻細霧狀，均勻細霧狀n 浸漬顯色：專用玻璃器皿或玻璃缸浸漬顯色：專用玻璃器皿或玻璃缸n 蒸氣熏蒸顯色：雙槽玻璃缸（碘蒸氣顯色）蒸氣熏蒸顯色：雙槽玻璃缸（碘蒸氣顯色）（6）檢視裝置）檢視裝置 三用紫外儀三用紫外儀253.7nm下觀察下觀察sdauPage 10薄層色譜定性定量方法薄層色譜定性定量方法n 定性方法定性方法1.利用利用R

8、f定性定性：用標準品對照：用標準品對照2.板上化學反應定性板上化學反應定性：根據所用的顯色劑及顏色：根據所用的顯色劑及顏色n 定量方法定量方法1.直接定量法直接定量法：比較樣品和標準品斑點的面積大小顏色及顏：比較樣品和標準品斑點的面積大小顏色及顏色深淺。目視或用薄層掃描儀。色深淺。目視或用薄層掃描儀。2.間接定量法間接定量法：摳下斑點，洗脫，用分光光度計比色洗脫液：摳下斑點，洗脫，用分光光度計比色洗脫液sdauPage 11二、硅膠柱層析分離二、硅膠柱層析分離n 原理：物質在硅膠上的吸附力不同，原理：物質在硅膠上的吸附力不同， 極性大的易被吸附，吸附解吸附。極性大的易被吸附，吸附解吸附。n 硅

9、膠硅膠H的處理：的處理： 活化：活化：110 烘箱干燥烘箱干燥 l h 脫氣：加入干硅膠體積一倍的脫氣：加入干硅膠體積一倍的溶劑溶劑 注：硅膠柱不能遇水，吸引水分子形成水膜，注：硅膠柱不能遇水，吸引水分子形成水膜， 影響分離效能。影響分離效能。sdauPage 12硅膠柱分離時洗脫劑選擇：硅膠柱分離時洗脫劑選擇：n 根據文獻報道，嘗試比例調整。根據文獻報道，嘗試比例調整。n 據據TLC展開劑比例再稀釋一倍！展開劑比例再稀釋一倍！氯仿：甲醇氯仿：甲醇=9:1（18:1）n 被分離物質為被分離物質為弱弱極性物質，一般選用極性物質，一般選用弱弱極性溶劑為洗脫劑極性溶劑為洗脫劑， 被分離物質為被分離物

10、質為強強極性成分，則須選用極性成分，則須選用強強極性溶劑為洗脫劑。極性溶劑為洗脫劑。n 極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；n 加一點點三乙胺，氨水等堿性物質來中和硅膠的酸性加一點點三乙胺，氨水等堿性物質來中和硅膠的酸性n 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。 sdauPage 13裝柱（最大影響因素?。┭b柱（最大影響因素！）n 濕法裝柱濕法裝柱和干法裝柱和干法裝柱，上表面一定要平整，上表面一定要平整，n 一次性傾

11、入。一次性傾入。要求填充均勻，無斷層、無縫隙、無氣泡要求填充均勻，無斷層、無縫隙、無氣泡n 硅膠的高度一般為硅膠的高度一般為15cm左右左右（長、粗）（長、粗）,據情況而定據情況而定 柱子徑高比一般在柱子徑高比一般在 1：510n 平衡柱子（平衡柱子（3-4個柱體積的洗脫劑）個柱體積的洗脫劑）sdauPage 14上樣上樣n 柱內的溶劑液面降至吸附劑表層柱內的溶劑液面降至吸附劑表層時開始上樣時開始上樣n 干法上樣：樣品溶解性差干法上樣：樣品溶解性差 樣品樣品+ +少量洗脫劑少量洗脫劑+ +少量硅膠少量硅膠 拌勻后烘干拌勻后烘干 優(yōu)點：樣品層較平整。優(yōu)點：樣品層較平整。n 濕法上樣：用濕法上樣：

12、用少量少量展開劑將樣品溶解，沿柱內壁均勻加入。展開劑將樣品溶解，沿柱內壁均勻加入。n 加完樣后在樣品層上再加入一層硅膠，防止沖散樣品層。加完樣后在樣品層上再加入一層硅膠，防止沖散樣品層。sdauPage 15洗脫并收集（洗脫并收集（TLC跟蹤）跟蹤）n 梯度洗脫：極性緩慢增大梯度洗脫：極性緩慢增大n 樣品收集：樣品收集： 如果如果被分離各組分有顏色，根據色層收集洗脫液。被分離各組分有顏色，根據色層收集洗脫液。 如果各組分無色，先等分收集如果各組分無色，先等分收集(自動收集器自動收集器)，然后用，然后用TLC逐一鑒定，再將相同組分的收集液合并在一起逐一鑒定，再將相同組分的收集液合并在一起，濃度。，濃度。 收集的例子：收集的例子：10mg上樣量，上樣量，1g硅膠硅膠H，0.5ml收一餾分；收一餾分；1-2g上樣量，上樣量，50g硅膠（硅膠（200-300目），目），20-50ml收一餾分。收一餾分。 sdauPage 16硅膠柱層析分離過程中，對洗脫液進行硅膠柱層析分離過程中，對洗脫液進行TLC檢測，如下：檢測，如下：sdauPage 17最后的處理：最后的處理： n 送譜分析前，用少量的