亞顯微學(xué)習(xí)總結(jié)

1、同濟(jì)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物教研室Tongji university Basic medical Cell biology teaching and research section細(xì)胞細(xì)胞顯微顯微與亞顯微技術(shù)與亞顯微技術(shù)課題課題結(jié)題結(jié)題論文論文伊紅染色伊紅染色時間對石蠟切片的影響探究時間對石蠟切片的影響探究團(tuán)隊成員：白正輝 1453176謝望程 1453180唐巖松 1453187秦偉1253305實(shí)驗(yàn)組號：第一組實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)樓指導(dǎo)老師：郭峰2016 年年 5 月月獨(dú)創(chuàng)性聲明獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)與優(yōu)良的科學(xué)道德， 本人聲明所呈交的論文是我們團(tuán)隊在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和理論教

2、學(xué)中研究所取得的成果。盡我所知，除了文中特變加以標(biāo)注和致謝的地方外， 論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或攥寫過的研究成果。論文團(tuán)隊簽字：日期：伊紅染色伊紅染色時間對石蠟切片的影響探究時間對石蠟切片的影響探究中文摘要中文摘要石蠟切片應(yīng)用于眾多的實(shí)驗(yàn)研究中， 對于切片觀察的效果往往受到切片過程中受到的壓迫，切片的厚度，切片染色的染料以及染色時間的長短的影響。有的時候，可能切片的效果受到的影響因素不單一，我們主要的研究內(nèi)容，控制切片的厚度一樣，通過不同器官組織的切片，觀察染色時間對切片染色效果的影響程度，并找出每種器官組織的最佳染色時間。關(guān)鍵詞： 石蠟切片不同器官染色時間染色效果AbstractParaf

3、fin section applied to numerous experiments, for the effect of sliceobservation often oppressed by slicing process, the thickness of slice, slicestaining of dye and the effect of the length of the dyeing time. Sometimes, itmay be no single slice the impact on the effect of factors, one of our mainre

4、search content, control the thickness of slice, sliced through the differentorgans and tissues, to observe the influence of dyeing time for slicing effect,and find out the best dyeing time of each organs and tissues.Keywords: Paraffin sectionDifferent organsDyeing timeEffect前期理論前期理論顯微和亞顯微技術(shù)主要包括各類顯微鏡

5、（暗襯顯微鏡、相襯顯微鏡、偏高顯微鏡、微分干涉顯微鏡、熒光顯微鏡倒置顯微鏡）的特點(diǎn)和使用方法，顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)（數(shù)值孔徑1、分辨率2、放大率3、焦深4、視場直徑5、覆蓋差6、鏡像亮度與視場亮度7） ，顯微鏡的光學(xué)部件，生物制片技術(shù)8，超薄切片技術(shù)和顯微攝影技術(shù)。1，數(shù)值孔徑又稱“鏡口率” ，簡寫 NA。數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，用來判斷兩者性能高低的重要標(biāo)志，其數(shù)值的大小，分別標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。2，分辨率又稱“鑒別率”是衡量顯微鏡性能的又一個重要指標(biāo)。顯微分辨率由=/NA，是光線的波長，NA 為數(shù)值孔徑。提高分辨率就需要減小的值。3，放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢物體經(jīng)

6、過物鏡放大再經(jīng)過目鏡放大后，人眼所看到最終圖像的大小和原物體大小的比值。4，焦深為焦點(diǎn)深度的簡稱。即在使用顯微鏡時，當(dāng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)某一物體點(diǎn)時，不僅位于該點(diǎn)平面上都可以看清，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看清楚，這個清晰部分的厚度就是焦深。5，視場直徑，顯微觀察時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場或視域，它的大小，是由目鏡里的視場光束所限定的。視場直徑就是顯微鏡下看到的圓形內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。6，覆蓋差由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生的折射后的光路與原設(shè)計不同，從而產(chǎn)生了相差。7，鏡像亮度是顯微鏡的圖像亮度的簡稱，指在顯微鏡下所觀察到的圖像的明暗程度；視場亮度指顯微鏡下整

7、個視場的亮度。8，生物制片技術(shù)包括石蠟切片，火棉膠切片法，冰凍切片，炭蠟切片，超微切片等等。石蠟切片的過程主要包括：選材-固定-沖洗與脫水-透明-浸蠟和包埋-切片-粘片-染色-封固。實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：石蠟切片是最基本的切片技術(shù)， 冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蘇木精與伊紅對比染色法是組織切片最常用的染色方法。這種方法實(shí)用范圍廣泛，對組織細(xì)胞的各種成分都可以著色，便于全面觀察組織結(jié)構(gòu)，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保持。經(jīng) HE 染色后，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。實(shí)驗(yàn)材料與器材：實(shí)驗(yàn)材料與器材：器材：切片刀，

8、切片機(jī)，恒溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針，解剖剪，解剖盤，培養(yǎng)皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，包埋紙盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，撥片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，水浴鍋等藥品：卡諾氏固定液、各種濃度的酒精二甲苯、石蠟、埃里希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液郝普特氏粘片、中性樹膠，1%番紅，1%固綠材料：小鼠實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1.取材：頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取5mm*5mm*2mm 或 10mm*10mm*2mm 大小的組織（肝、腎、心、脾、胃）注意事項：取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化；切片材料

9、應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要部位的部分。2. 固定：將切好的肝組織用生理鹽水洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，時間為3050min(卡諾氏固定液：無水酒精和冰醋酸 3：1 混合)。注意事項：一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下， 以免引起化學(xué)變化，失去固定作用有些混合固定液的成分之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，否則會失去固定作用固定材料時，固定液必須充分，一般為材料塊的 2030 倍材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。3

10、.洗滌：材料經(jīng)過固定后，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。因?yàn)闅埩粼诮M織中的固定液，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察。沖洗方法根據(jù)固定液的性質(zhì)而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用 50%70%乙醇沖洗。4.脫水：30%，50%，70%，80%，90%各級乙醇溶液脫水各 40min，放入 95%、100%各兩次，每次 20min。脫水作用：使材料變硬，形狀更加穩(wěn)定；除盡材料中的水分，才能使包埋劑額封固劑滲透到組織中。因?yàn)槲覀兯玫陌駝┖头夤虅┡c水不互溶。注意事項：脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分在更換高一級的脫水劑時，

11、最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液， 然后于皿中加入高一級脫水劑在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體在高濃度或純酒精中， 每級停留的時間也不宜太長， 否則使組織變脆， 影響切片脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁現(xiàn)象5.透明：純酒精、二甲苯等量混合液 15min,二甲苯 0.5h 須換一次二甲苯。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯能和兩者都溶，所以脫水后需要經(jīng)過二甲苯過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)。注意事項：使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。更

12、換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不讓材料塊干涸，另一方面使避免吸收濕氣在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。6.浸蠟：放入二甲苯和石蠟各半的混合液 15min,再放入石蠟 1、 石蠟 2 浸蠟 2030 分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑， 使石蠟浸透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。浸蠟時間根據(jù)組織的薄厚，大小來進(jìn)行。浸蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在 5560左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。注意事項：盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度浸蠟溫度要恒定操作要迅速， 力求在最短時間內(nèi)完成石蠟浸透過程， 以免引起組

13、織變硬】 變脆、收縮等。7.包埋：將經(jīng)過浸蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入包埋盒內(nèi)，然后包埋盒底部接觸冷水中，使其立刻降溫凝固成蠟塊。用于包埋的石蠟的熔點(diǎn)在 5060之間，包埋時應(yīng)根據(jù)組織材料， 切片厚度， 氣候條件等因素， 選擇不同熔點(diǎn)的石蠟。 包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置） ，再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢的平放在面盤，并立即使它沉入水中，使盒中包埋迅速凝固。待石蠟完全凝固（約 30min）后即可取出備用。8.修蠟和切片

14、切片之前要把包埋好的蠟快修成梯形， 然后將已修好的石蠟固定在臺木上裝在切片機(jī)的夾物臺上。將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成 15左右。調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為 410 微米一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟快切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，遙轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以 4050r/min。切成的蠟帶到 2030cm 長時， 右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起， 以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺額一面朝上。用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻

15、片上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上粘著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。9.貼片：取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。滴 12 滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于撥片上，并使之處于稍偏撥片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽。把撥片擺好片位置， 在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展或放置置于預(yù)先加熱的展片臺上（溫度保持在 4045）此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽。展片后把載玻片放在平盤上編好記

16、號置于 37溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。10.脫蠟復(fù)水：石蠟切片經(jīng)二甲苯 I、II 脫蠟各 510min，然后放入 100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液各 35min,再放入蒸餾水中 3min.11.染色染色： （本次實(shí)驗(yàn)的變量過程）（本次實(shí)驗(yàn)的變量過程）切片放入蘇木精中染色約1030min。 染色時應(yīng)根據(jù)染色劑成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。染色的具體情況染色的具體情況蘇木精染色：(一)橫向比較：同一染色時間下的最優(yōu)組織（文獻(xiàn)參考最佳時間 5min，最佳厚度 10 微米）(比較不同組織之間染色的差異性，類似組織和極差組織)(二)縱向比較：同一組織的最

17、優(yōu)染色時間（以最佳時間 5min 為標(biāo)準(zhǔn)） ，時間梯度為 3min，3.5min，4min，4.5min，5min，5.5min，6min，6.5min，7min水洗水洗:用自來水流水沖洗 15min.沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍(lán)（或放入堿性水中也可，但用促藍(lán)劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應(yīng)以流水沖洗使切片顯示藍(lán)色為宜）但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍(lán)為止。分化分化:就是將細(xì)胞質(zhì)的色褪去，使細(xì)胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸 1：70%乙醇 100）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒置十秒。漂洗漂洗:切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)

18、藍(lán)色。低倍鏡檢查見細(xì)胞核呈藍(lán)色，結(jié)構(gòu)清楚： 細(xì)胞 2 質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標(biāo)準(zhǔn)。 然后放入蒸餾水中漂洗一次。脫水脫水:切片入 50%乙醇-70%乙醇-80%乙醇中各 35min.復(fù)染復(fù)染：用 0.5%伊紅乙醇液對比染色 25min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核濃淡相配合。再脫水再脫水：放入乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中 35min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。透明透明:切片加入二甲苯-乙醇等量混合液中約 5min，然后放入純二甲苯 I、II 中各35min。二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。封固封固：切片經(jīng)染色后，要用封固劑將其封固起來。永久保存切片，便于鏡檢。準(zhǔn)備好蓋玻片、載玻片、鑷子、樹膠、酒精燈，將有標(biāo)本的載玻片自二甲苯中取出，用白布揩去標(biāo)本周圍二甲苯， 在標(biāo)本上加一滴樹膠， 將蓋玻片一端先于樹膠接觸，然后緩緩抽去鑷子，讓蓋玻片緩緩下降。 （加拿大樹膠溶于二甲苯，不須加熱，但是絕對不能混入酒精和水）實(shí)驗(yàn)結(jié)果及染色效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果及染色效果：1. 橫向比較：2. 縱向比較：參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：