western-blot-副本

1、 蛋白質(zhì)印跡 （western blot) 蛋白質(zhì)印跡（western blot)的定義 蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡(western blotting)技術(shù)是將傳統(tǒng)的高分辨技術(shù)是將傳統(tǒng)的高分辨率率SDS(十二烷硫酸鈉十二烷硫酸鈉)一聚丙烯酰胺一聚丙烯酰胺(PAGE)電泳和靈敏電泳和靈敏度高、特異性強(qiáng)的免疫探測技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。是目前度高、特異性強(qiáng)的免疫探測技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)、分析研究中應(yīng)用最多的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)、分析研究中應(yīng)用最多的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 聚丙烯酰胺電泳分離蛋白質(zhì)具有很好的分辨率和實(shí)用性，聚丙烯酰胺電泳分離蛋白質(zhì)具有很好的分辨率和實(shí)用性，但要對各種蛋白質(zhì)作進(jìn)一

2、步分析但要對各種蛋白質(zhì)作進(jìn)一步分析(如表達(dá)信號的強(qiáng)弱如表達(dá)信號的強(qiáng)弱)就受就受 到限制，因?yàn)殡娪竞蟠蟛糠值鞍椎较拗?，因?yàn)殡娪竞蟠蟛糠值鞍?質(zhì)分子被嵌在凝膠介質(zhì)質(zhì)分子被嵌在凝膠介質(zhì)中，探針很難通過凝膠到中，探針很難通過凝膠到 達(dá)目標(biāo)蛋白，且探測過程中的達(dá)目標(biāo)蛋白，且探測過程中的擴(kuò)散現(xiàn)象會破壞鄰擴(kuò)散現(xiàn)象會破壞鄰 近蛋白條帶的特征。近蛋白條帶的特征。為解決這些技術(shù)問題，人們將電泳后凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)為解決這些技術(shù)問題，人們將電泳后凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種化學(xué)惰性的高分子支持物移到一種化學(xué)惰性的高分子支持物固相轉(zhuǎn)移膜上，固相轉(zhuǎn)移膜上，使蛋白質(zhì)分子更容易與探針結(jié)合，且機(jī)會均等；將蛋白使蛋白質(zhì)分子更容易與探

3、針結(jié)合，且機(jī)會均等；將蛋白質(zhì)富集濃縮在固相轉(zhuǎn)移膜上，以減少擴(kuò)散，提高了分析質(zhì)富集濃縮在固相轉(zhuǎn)移膜上，以減少擴(kuò)散，提高了分析的靈敏度，并能在轉(zhuǎn)移膜上進(jìn)行多種分析。的靈敏度，并能在轉(zhuǎn)移膜上進(jìn)行多種分析。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)原理： 混合樣品經(jīng)混合樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離，凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離，凝膠中的蛋白質(zhì)用電印跡方法被轉(zhuǎn)移到化學(xué)惰性的高分子轉(zhuǎn)移中的蛋白質(zhì)用電印跡方法被轉(zhuǎn)移到化學(xué)惰性的高分子轉(zhuǎn)移膜上。然后，將目的蛋白的特異性一級抗體膜上。然后，將目的蛋白的特異性一級抗體(一抗一抗)與轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移膜上的目的蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，再用標(biāo)記過膜上的目的蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，再用標(biāo)記過(如如HR

4、P)的二級抗體的二級抗體(二抗二抗)與一抗結(jié)合，用對二抗分子中標(biāo)記物的與一抗結(jié)合，用對二抗分子中標(biāo)記物的檢測證明目的蛋白的存在。檢測證明目的蛋白的存在。步驟： (1)電印跡電印跡電轉(zhuǎn)移：電轉(zhuǎn)移：Western blotting法首先是將分法首先是將分離的蛋白從離的蛋白從SDSPAGE凝膠上轉(zhuǎn)印到固相膜上。常用的凝膠上轉(zhuǎn)印到固相膜上。常用的幾種印跡法有：點(diǎn)印跡、擴(kuò)散印跡、溶劑流印跡和電泳印幾種印跡法有：點(diǎn)印跡、擴(kuò)散印跡、溶劑流印跡和電泳印跡。跡。 (2)封閉：蛋白質(zhì)分子從膠上轉(zhuǎn)移到膜上后，為減少探封閉：蛋白質(zhì)分子從膠上轉(zhuǎn)移到膜上后，為減少探針的非特異結(jié)合，用非反應(yīng)活性分子封阻轉(zhuǎn)移膜上未吸附針的非

5、特異結(jié)合，用非反應(yīng)活性分子封阻轉(zhuǎn)移膜上未吸附臻巍質(zhì)的區(qū)域，以降低檢測的背景信號。臻巍質(zhì)的區(qū)域，以降低檢測的背景信號。 (3)免疫結(jié)合反應(yīng)：用目的綴白的抗體與轉(zhuǎn)移膜上的目免疫結(jié)合反應(yīng)：用目的綴白的抗體與轉(zhuǎn)移膜上的目的蛋白的蛋白(靶蛋白靶蛋白)進(jìn)行特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，再用標(biāo)記過隨進(jìn)行特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，再用標(biāo)記過隨二抗與膜上的一抗反應(yīng)。二抗與膜上的一抗反應(yīng)。 (4)檢測：根據(jù)連接二抗標(biāo)識物的檢出，如：化學(xué)發(fā)光、檢測：根據(jù)連接二抗標(biāo)識物的檢出，如：化學(xué)發(fā)光、顯色和放射性同位素測定等，檢測出目的蛋白的存在。顯色和放射性同位素測定等，檢測出目的蛋白的存在。 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測肺癌組織上皮鈣粘蛋白的表

6、達(dá)：目的：探討上皮鈣粘蛋白目的：探討上皮鈣粘蛋白(E-cad)與肺癌及其病理類型之與肺癌及其病理類型之間的相關(guān)性。間的相關(guān)性。方法：應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)方法：應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測檢測30例肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織及例肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織及5例肺良性對照標(biāo)例肺良性對照標(biāo)本中本中Ecad的表達(dá)，并對部分表達(dá)陰性的標(biāo)本用免疫組的表達(dá)，并對部分表達(dá)陰性的標(biāo)本用免疫組化方法進(jìn)行驗(yàn)證?；椒ㄟM(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果結(jié)果:癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織E-cad的陽性率分別的陽性率分別為為367、70O、967。癌組織。癌組織Ecad陽性率陽性

7、率明顯低于癌旁組織明顯低于癌旁組織(P0017)，也明顯低于遠(yuǎn)癌，也明顯低于遠(yuǎn)癌(P0017)；癌旁組織；癌旁組織Ecad陽性率明顯低于遠(yuǎn)癌組織陽性率明顯低于遠(yuǎn)癌組織(P75為為4分；分；(2)陽性強(qiáng)度：無色為陽性強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為分，淡黃色為1分，棕黃色為分，棕黃色為2分，分，棕褐色為棕褐色為3分。分。 根據(jù)根據(jù)(1)(2)兩者的乘積判斷陽性等級。兩者的乘積判斷陽性等級。0分為陰性，分為陰性，14分為弱陽性分為弱陽性(+)，58分為陽性分為陽性(+)，912分為強(qiáng)陽性分為強(qiáng)陽性(+)。(+)以上者視為陽性。以上者視為陽性。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用，檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用，檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=005，兩兩，兩兩比較時(shí)，調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)比較時(shí)，調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)2n (n一一1)，本實(shí)驗(yàn)有，本實(shí)驗(yàn)有3組進(jìn)組進(jìn)行兩兩比較，所以檢驗(yàn)水準(zhǔn)行兩兩比較，所以檢驗(yàn)水準(zhǔn)=2005(32)即即0017，其中，其中20以上的格子理論頻數(shù)以上的格子理論頻數(shù)T5，或有，或有1個(gè)理論頻個(gè)理論頻數(shù)數(shù)T1時(shí)，采用確切概率法檢驗(yàn)。時(shí)，采用確切概率法檢驗(yàn)。結(jié)果：Western blot結(jié)果結(jié)果 1肺癌患者癌、癌旁及遠(yuǎn)癌組織肺癌患者癌、癌旁及遠(yuǎn)癌組織Ecad的表達(dá)情況的表達(dá)情況Ecad的電泳條帶出現(xiàn)在的電泳條帶出現(xiàn)在120 000左右，內(nèi)參左右，內(nèi)參GAPDH的電泳的電泳條帶出現(xiàn)在條帶出現(xiàn)在43 000左右

9、，與已知相對分子質(zhì)量相符，見圖左右，與已知相對分子質(zhì)量相符，見圖1。5例肺良性對照標(biāo)本全部表達(dá)清晰的例肺良性對照標(biāo)本全部表達(dá)清晰的Ecad條帶，見條帶，見圖圖2。所有標(biāo)本的內(nèi)參。所有標(biāo)本的內(nèi)參GAPDH都顯示清晰的條帶。都顯示清晰的條帶。 癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織E-cad的陽性率見表的陽性率見表l。經(jīng)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析卡方檢驗(yàn)分析Ecad的陽性率在癌組織、癌旁組織以的陽性率在癌組織、癌旁組織以及遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(卡方等于卡方等于2483，P005)。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較的，。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較的，E-cad在癌組在

10、癌組織分別與癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)織分別與癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義(卡方等于卡方等于670，P0017濟(jì)濟(jì)2=243，P0017)；E-cad在癌旁組織與遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異亦有統(tǒng)在癌旁組織與遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義計(jì)學(xué)意義(卡方等于卡方等于768，P0017)。 二、免疫組化結(jié)果 本組實(shí)驗(yàn)選取了本組實(shí)驗(yàn)選取了5例例Western blot結(jié)果顯示：結(jié)果顯示： 陰性的肺癌患者的癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織進(jìn)行免陰性的肺癌患者的癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織進(jìn)行免疫組化研究，同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性對照。免疫組化結(jié)疫組化研究，同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性

11、對照。免疫組化結(jié)果顯示，果顯示，5份癌旁組織有份癌旁組織有1例標(biāo)本例標(biāo)本Ecad表達(dá)陰性；表達(dá)陰性；5份癌份癌組織均表達(dá)陰性，其表達(dá)異常率為組織均表達(dá)陰性，其表達(dá)異常率為100，與，與Western blot結(jié)果相符合，見圖結(jié)果相符合，見圖3。 5例患者的遠(yuǎn)癌組織例患者的遠(yuǎn)癌組織Ecad均呈陽性表達(dá)，陽性部位主均呈陽性表達(dá)，陽性部位主要在胞膜表達(dá)，呈現(xiàn)出深黃至棕黃色顆粒，清晰，見圖要在胞膜表達(dá)，呈現(xiàn)出深黃至棕黃色顆粒，清晰，見圖4，提示細(xì)胞之間有功能良好的細(xì)胞間隙連接和細(xì)胞粘附存提示細(xì)胞之間有功能良好的細(xì)胞間隙連接和細(xì)胞粘附存在。陽性對照和陰性對照見圖在。陽性對照和陰性對照見圖5、6。討論：

12、Ecad是是I型鈣粘蛋白超家族的單鏈跨膜糖蛋白分子，型鈣粘蛋白超家族的單鏈跨膜糖蛋白分子，幾乎存在于所有上皮細(xì)胞表面，是細(xì)胞一細(xì)胞粘附分子幾乎存在于所有上皮細(xì)胞表面，是細(xì)胞一細(xì)胞粘附分子的主要類型。人類的的主要類型。人類的Ecad基因基因(CDHI)定位于定位于16q221，含，含16個(gè)外顯子，個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子，全長個(gè)內(nèi)含子，全長48 kb，編碼全，編碼全長長882個(gè)氨基酸，前體蛋白的相對分子質(zhì)量為個(gè)氨基酸，前體蛋白的相對分子質(zhì)量為135 000，前體蛋白合成后被迅速運(yùn)到高爾基復(fù)合體內(nèi)，經(jīng)加工、前體蛋白合成后被迅速運(yùn)到高爾基復(fù)合體內(nèi)，經(jīng)加工、糖基化修飾后形成糖基化修飾后形成120 000

13、的成熟的成熟Ecad。目前，目前，Ecad被認(rèn)為不僅介導(dǎo)細(xì)胞粘附，還直接或間接被認(rèn)為不僅介導(dǎo)細(xì)胞粘附，還直接或間接參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)減少或功能異常與腫瘤的參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)減少或功能異常與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 western blot具有敏感性和特異性高、不需特殊設(shè)備、具有敏感性和特異性高、不需特殊設(shè)備、可進(jìn)行半定量和定性分析、對組織標(biāo)本要求低、可用于可進(jìn)行半定量和定性分析、對組織標(biāo)本要求低、可用于冰凍失活組織細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外有學(xué)者應(yīng)用冰凍失活組織細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外有學(xué)者應(yīng)用Western blot探討肺癌細(xì)胞株中探討肺癌細(xì)胞株中E-ca

14、d表達(dá)情況，本研究應(yīng)用表達(dá)情況，本研究應(yīng)用Western blot檢測肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織中檢測肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織中Ecad的表達(dá)，并對部分表達(dá)陰性的標(biāo)本用免疫組化方法進(jìn)行的表達(dá)，并對部分表達(dá)陰性的標(biāo)本用免疫組化方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，驗(yàn)證，結(jié)果顯示，Ecad在肺癌組織存在明顯缺失和減在肺癌組織存在明顯缺失和減弱者占弱者占633，近期國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用免疫組化方法探討，近期國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用免疫組化方法探討Ecad在肺癌組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在肺癌組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Ecad在肺在肺癌組織中表達(dá)減少和缺失的比例為癌組織中表達(dá)減少和缺失的比例為321一一780。本研究結(jié)果

15、進(jìn)一步顯示本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示Ecad陰性表達(dá)情況在肺癌組陰性表達(dá)情況在肺癌組織織(633)、癌旁組織、癌旁組織(30O)和遠(yuǎn)癌組織和遠(yuǎn)癌組織(33)呈呈明顯的遞減趨勢，明顯的遞減趨勢，E-cad在癌組織與癌旁組織、癌組織與在癌組織與癌旁組織、癌組織與遠(yuǎn)癌組織、癌旁組織與遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)遠(yuǎn)癌組織、癌旁組織與遠(yuǎn)癌組織之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明意義，表明Ecad表達(dá)的減弱和缺失可能是肺癌發(fā)生發(fā)表達(dá)的減弱和缺失可能是肺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。展的重要因素之一。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織的本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織的Ecad表達(dá)均與肺癌的組織類型

16、沒有相關(guān)性。韓國學(xué)者表達(dá)均與肺癌的組織類型沒有相關(guān)性。韓國學(xué)者Choi等等H1通過對通過對141例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行研究，結(jié)果表明在鱗例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行研究，結(jié)果表明在鱗癌和腺癌之間癌和腺癌之間Ecad的表達(dá)有差異，而國內(nèi)學(xué)者喬貴賓的表達(dá)有差異，而國內(nèi)學(xué)者喬貴賓等通過對等通過對365例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行研究，表明例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行研究，表明Ecad在肺在肺癌組織中表達(dá)減少和缺失與病理類型無明顯關(guān)系，本研究癌組織中表達(dá)減少和缺失與病理類型無明顯關(guān)系，本研究結(jié)果與后者的結(jié)論相同。結(jié)果與后者的結(jié)論相同。Southern 印跡 原理：原理： 待測待測DNA樣品用限制性核酸內(nèi)切酶消化后將其片段樣品用限制性核

17、酸內(nèi)切酶消化后將其片段通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。變性后將其從膠上轉(zhuǎn)移至通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。變性后將其從膠上轉(zhuǎn)移至固相支持物上與標(biāo)記的探針固相支持物上與標(biāo)記的探針(DNA或或RNA)進(jìn)行雜交，進(jìn)行雜交，通過特定檢測方法可以確定雜交帶的位置。即如果顯示出通過特定檢測方法可以確定雜交帶的位置。即如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。中。 應(yīng)用：應(yīng)用： Southern印跡可以檢測樣品中的印跡可以檢測樣品中的DNA及其含量。了及其含量。了解基因的狀態(tài)解基因的狀態(tài)(如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等) Northern 印跡 原理：原理： 將待