255亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助化療敏感性關(guān)系

1、亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助化療敏感性關(guān)系的研究探討 乳腺癌（breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)著上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計目前全世界每年死于乳腺癌的病例約為41萬人，約占女性全部癌癥死亡病例的14% ，居女性癌癥死因的首位或第二位。研究目的和意義研究目的和意義目的：目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶（研究亞甲基四氫葉酸還原酶（mthfrmthfr）基因）基因 c677tc677t、a1298ca1298c多態(tài)與乳腺癌患者對新輔助多態(tài)與乳腺癌患者對新輔助 化療敏感性的關(guān)系?；熋舾行缘年P(guān)系。 意義：意義：尋找可靠的預(yù)測指標指導(dǎo)尋找可靠的預(yù)測指標指導(dǎo)個

2、體化治療個體化治療, , 從而從而 為進一步實現(xiàn)乳腺癌為進一步實現(xiàn)乳腺癌規(guī)范化綜合治療規(guī)范化綜合治療提供參提供參 考依據(jù)?？家罁?jù)。 研究對象研究對象2008年1月至2009年4月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的61例乳腺癌患者新輔助化療新輔助化療惡性證據(jù)惡性證據(jù)可測量病灶可測量病灶術(shù)后病理術(shù)后病理 評定標準評定標準 化療療效的評定標準：化療療效的評定標準： 參照參照whowho實體瘤療效評定標準實體瘤療效評定標準 分為完全緩解分為完全緩解(cr)(cr)、部分緩、部分緩解解(pr)(pr)、無變化、無變化(sd)(sd)和進展和進展(pd)(pd)。以以cr和和pr為有效為有效 化療后病理反應(yīng)分級標準化

3、療后病理反應(yīng)分級標準 0級： 癌細胞沒有變化； i級： 癌細胞有輕度變化或有顯著變化但2/3的 范圍 ii級 癌細胞顯著變化達2/3或以上 iii級 癌細胞完全消失或壞死，被肉芽組織和(或) 纖維組織替代 把iiii級定為病理有反應(yīng)！ 實驗技術(shù)路線實驗技術(shù)路線 白細胞層白細胞層dna提取步驟提取步驟 mthfr c677t 多態(tài)性檢測方法多態(tài)性檢測方法 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 hinf i酶切酶切mthfr 677基因基因dna片段產(chǎn)物電泳圖片段產(chǎn)物電泳圖 mthfr a1298c多態(tài)性檢測方法多態(tài)性檢測方法 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 mbo 酶切酶切mthfr a1298c基因基因dna片段產(chǎn)物電泳圖片段

4、產(chǎn)物電泳圖試劑試劑: :w4 4dntpsdntps（寶生物工程（寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司)w引物（寶生物工程引物（寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司) )wtaq taq 酶酶( (北京博瑞科技有限公司北京博瑞科技有限公司) )w限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶hinf i(hinf i(寶生物工程寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司) )w1010buffer(buffer(寶生物工程寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司) )儀器儀器: :wpcr pcr 擴增儀兩臺擴增儀兩臺( (美國美國mjmj公司，德國公司，德國biometrabiome

5、tra公司公司) )w冷凍高速離心機冷凍高速離心機(0(016000r/min) (16000r/min) (德國德國eppendorfeppendorf公司公司) )w可調(diào)式移液器可調(diào)式移液器(0(02 2l, 0l, 0100100l, 0l, 010001000l)(gilsonl)(gilson公司公司) ) mthfr c677t基因多態(tài)性檢測方法基因多態(tài)性檢測方法pcr擴增mthfr 677基因片段 (198bp) mthfr 677基因型檢測 （hinf i酶切pcr擴增產(chǎn)物） 結(jié)果判斷 結(jié)果判斷結(jié)果判斷1）當為677c/c基因型時， pcr產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶hinf i 酶

6、所識別，pcr產(chǎn)物則不能被消化，瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)為198bp片段，可清晰見到198bp一條亮帶。2）當為677t/t基因型時，pcr產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶hinf i酶消化后可產(chǎn)生175bp、23bp二個新的片段。其中23 bp的片段由于太短而無法在凝膠上清楚的顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰的見到175bp一條亮帶。3）當為677c/t基因型時，可產(chǎn)生198bp、175bp、和23bp三個片段。其中23bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只清晰見到198bp和175bp兩條亮帶。 hinf i酶切酶切mthfr 677基因基因dna 片段產(chǎn)物電泳圖片段產(chǎn)物電泳圖wlane 1:

7、maker;wlane 2: c/c genotype; wlane 3: c/t genotype; wlane 4: t/t genotype. 198bp175bp試劑試劑: :w4 4dntpsdntps（寶生物工程（寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司)w引物（寶生物工程引物（寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司) )wtaq taq 酶酶( (北京博瑞科技有限公司北京博瑞科技有限公司) )w限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶mbo mbo （寶生物工程（寶生物工程( (大連大連) )有限公司有限公司) )w1010buffer(buffer(寶生物工程寶生物工程( (大連

8、大連) )有限公司有限公司) )儀器儀器: :wpcr pcr 擴增儀兩臺擴增儀兩臺( (美國美國mjmj公司，德國公司，德國biometrabiometra公司公司) )w冷凍高速離心機冷凍高速離心機(0(016000r/min) (16000r/min) (德國德國eppendorfeppendorf公司公司) )w可調(diào)式移液器可調(diào)式移液器(0(02 2l, 0l, 0100100l, 0l, 010001000l)(gilsonl)(gilson公司公司) ) mthfr a1298c基因多態(tài)性檢測方法基因多態(tài)性檢測方法 pcr擴增mthfr a1298c基因片段 (84bp) mthf

9、r a1298c基因型檢測 （mbo酶切pcr擴增產(chǎn)物） 結(jié)果判斷 結(jié)果判斷結(jié)果判斷1）當為1298a/a基因型時，pcr產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶mbo 消化后可產(chǎn)生56bp、28bp二個新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到56bp一條亮帶。2）當為1298a/c基因型時，可產(chǎn)生84bp、56bp、和28bp三個片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到84bp和56bp兩條亮帶。 mbo 酶切酶切mthfr a1298c基因基因 dna片段產(chǎn)物電泳圖片段產(chǎn)物電泳圖wlane 1: maker;wlane 2:

10、 product of pcr；wlane 3: a/a genotype;wlane 4: a/c genotype.56bp84bp mthfr mthfr基因型和新輔助化療療效的關(guān)系基因型和新輔助化療療效的關(guān)系( (表表1 1）genetypegenetypec677tc677ta1298c a1298c typetypet/tt/tc/tc/tc/cc/ca/aa/aa/ca/cc/cc/cn n181829291414444417170 0effects of chemotherapyeffects of chemotherapy cr+pr(%) sd+pd(%) cr+pr(%)

11、 sd+pd(%) 15(83.3) 3(16.7) 15(83.3) 3(16.7) 21(72.4) 8(27.6) 21(72.4) 8(27.6) 6(42.9) 8(57.1) 6(42.9) 8(57.1) 31(70.5) 13(29.5) 31(70.5) 13(29.5) 11(64.7) 6(35.3) 11(64.7) 6(35.3) 0 0 0 0 x x2 2 p p 0.72 0.40 0.72 0.40 5.54 5.54 0.020.02 0.19 0.67 0.19 0.67 mthfr mthfr基因型與乳腺癌新輔助化療病理反應(yīng)率基因型與乳腺癌新輔助化療病理

12、反應(yīng)率 的關(guān)系（表的關(guān)系（表2 2）genetypegenetypec677tc677ta1298c a1298c typetypet/tt/tc/tc/tc/cc/ca/aa/aa/ca/cc/cc/cn n181829291414444417170 0 reaction rate of chemotherapy 0(%) 0(%) (%)(%) 3(16.7) 15(83.3) 3(16.7) 15(83.3)10(34.5) 19(65.5)10(34.5) 19(65.5) 9(64.3) 5(35.7) 9(64.3) 5(35.7)13(29.5) 31(70.5)13(29.5)

13、 31(70.5) 9(52.9) 8(47.1) 9(52.9) 8(47.1) 0 0 0 0 x x2 2 p p 1.72 0.19 1.72 0.19 7.38 7.38 0.010.01 2.86 0.09 2.86 0.09一一.mthfr.mthfr基因多態(tài)性與化療敏感性之間有何關(guān)系？基因多態(tài)性與化療敏感性之間有何關(guān)系？ 5,10-mthf 5mthfmthfr同型半光氨酸同型半光氨酸蛋蛋 氨氨 酸酸s-s-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸蛋氨酸合成蛋氨酸合成酶酶甲基供體甲基供體 dnadna的低的低 甲基化甲基化dnadna修復(fù)修復(fù)能力降低能力降低化療敏感化療敏感性的變化性的變化 dna

14、dna的甲基化的甲基化 mthfr genovariation二二. .本研究的結(jié)果得出的結(jié)論？本研究的結(jié)果得出的結(jié)論？mthfr 677 tmthfr 677 tt t患者的化療療效患者的化療療效mthfr 677 tmthfr 677 tt ti iiiiiii級化療反應(yīng)率級化療反應(yīng)率mthfr 677 cmthfr 677 cc c患者的化療療效患者的化療療效mthfr 677 cmthfr 677 cc ci iiiiiii級化療反應(yīng)率級化療反應(yīng)率mthfr 677 cmthfr 677 ct t患者的化療療效患者的化療療效mthfr 677 cmthfr 677 ct ti iiii

15、iii級化療反應(yīng)率級化療反應(yīng)率 50.0p50.0pp0.05p0.05insignificant differencessignificant differencesmthfr c677tmthfr c677t基因多態(tài)基因多態(tài)與乳腺癌新輔助化療敏感性之間與乳腺癌新輔助化療敏感性之間存在著一定的相關(guān)性存在著一定的相關(guān)性 mthfr 1298a/c患者的化療療效患者的化療療效mthfr 1298a/a患者的化療療效患者的化療療效mthfr 1298a/ciiii級化療反應(yīng)率級化療反應(yīng)率mthfr 1298a/aiiii級化療反應(yīng)率級化療反應(yīng)率50.0p50.0pinsignificant differencesmthfr a1298c基因多態(tài)基因多態(tài)與乳腺癌新輔助化療敏感性之間與乳腺癌新輔助化療敏感性之間相關(guān)性不明顯相關(guān)性不明顯 有文獻報道有文獻報道1298基因多態(tài)對細胞內(nèi)葉酸分布的影響明顯低于基因多態(tài)對細胞內(nèi)葉酸分布的影響明顯低于677基因多態(tài)基因多態(tài), 故故 1298基因多態(tài)對化療敏感性的影響同樣低于基因多態(tài)對化療敏感性的