氨基酸的薄層層析實驗報告

1、生物化學(xué)實驗報告姓 名： XXX 學(xué) 號： XXXXXX 專業(yè)年級： 臨床八年制 _ 組 別： 第二實驗室 實驗名稱(Title of Experimetn)氨基酸的薄層層析實驗日期(Date of Experiment)XX實驗地點(Lab No.)第二實驗室合作者(Partner)XXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(Total Score)教師簽名(Signature)批改日期(Date)一、實驗預(yù)習(xí)1.0 實驗?zāi)康膌 掌握薄層層析法的一般原理。l 掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。l 掌握如何根據(jù)移動速率（Rf值）來鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。1.1 實驗原理

2、1.1.1薄層層析原理：（是色譜分析技術(shù)的一種） 一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來） 1.1.2. 氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng) 茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加熱時被還原，此產(chǎn)物與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，以及另一分子水合茚三酮縮合生成藍(lán)紫色化合物而使氨基酸斑點顯色。 1.1.3基于相對遷移率Rf值判定混合氨基酸組分 層析中，物

3、質(zhì)沿溶劑運(yùn)動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。即：= 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。1.2 實驗材料1.2.1實驗樣品 丙氨酸：稱取丙氨酸溶于90%異丙醇溶液至。 精氨酸：稱取精氨酸溶于90%異丙醇溶液至。 甘氨酸：稱取甘氨酸溶于90%異丙醇溶液至。 混合氨基酸溶液： 將丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等體積制成混 合溶液。（上述溶液已由老師提前制備完成）1.2.2實驗試劑 吸附劑：硅膠G(C.P.)。 粘合劑：羥甲基纖維素鈉（CMCNa）：取羥甲基纖維素鈉溶于 蒸餾水中，煮沸，靜置冷卻，棄沉淀，去上清備用。 展

4、開溶劑：按80:10:10（V/V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸餾水，臨用前 配制。 茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）溶于無水丙酮（A.R.）至。 展層-顯色劑：按照10:1比例（V/V）混合展開劑和茚三酮溶液。1.2.3實驗主要儀器和器材 層析板（6cm15cm）；小燒杯；量筒(10mL)；小尺子；毛細(xì)玻璃管； 層析缸；烤箱；天平；藥匙。1.3實驗步驟1.3.1實驗流程制版點樣層析顯色處理與結(jié)果分析1.3.2實驗操作步驟步驟操作（1）制版調(diào)漿：利用普通天平，粗稱取3g硅膠，加入羥甲基纖維素鈉，調(diào)成均勻的糊狀涂布：取潔凈的干燥玻璃板干燥：將玻璃板水平放置，室溫下放置0.5h，自然晾干活化：70烘

5、干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。（2）點樣標(biāo)記：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點。每個樣品間相距1cm。點樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，輕輕接觸薄層表面點樣。加樣后原點擴(kuò)散直徑不超過2mm。自然晾干后，必要時可再重復(fù)點一次。（3）層析將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，（該實驗中超過板長度的即可）取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線。（4）顯色放置在烤箱中用85下烘干，即可顯出各層斑點。（5）數(shù)據(jù)處理利用小尺子，測量各氨基酸色斑中心至樣品原點中心距離和溶液前緣至樣品原點中心

6、的距離。計算RF值，從而判斷混合液的成分組成。1.3.3注意事項 吸附劑：實際實驗要求不高，學(xué)生不用考慮。 點樣：點樣的次數(shù)依照樣品的溶液的濃度而定，樣品量太少，有的成分不易顯示；樣品量太多，易造成斑點過大，互相交叉或拖尾。故：點樣后的斑點直徑一般為0.2cm。 避免污染：切勿用手直接接觸薄層板面，必要時戴上手套。二、實驗記錄2.1 實驗條件2.1.1制版過程：材料：3g的硅膠和羥甲基纖維素鈉 （實驗室提供試劑，利用普通天平稱取硅膠、利用10mL量筒量取CMCNa）并利用小燒杯混合攪拌均勻。實驗時間：約20min實驗技巧：將糊狀物倒至潔凈玻璃板正中間，形成連續(xù)的一條線，并馬上開始左右來回晃蕩，

7、使糊狀混合物向著玻璃板的兩邊蔓延。在邊緣的地方利用晃蕩和藥匙凃均勻后，再晃蕩幾次，使得全部糊狀物在玻璃板上均勻的形成涂層。實驗失誤：在實驗中，第一次由于糊狀物攪拌時間過久，變濃厚而不易使涂層變均勻，故導(dǎo)致制作的結(jié)果較差。2.1.2后續(xù)實驗過程：材料：上一次同學(xué)制作的層析板（根據(jù)后續(xù)實驗可知該板的質(zhì)量不高）、4瓶已經(jīng)配制好的溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、前3種的任一比例混合物）、已經(jīng)含有展層-顯色劑的層析缸及烤箱等。實驗時間：1h左右 實驗技巧：在點樣過程中，必須垂直點樣，使樣液能充分被吸收。 各實驗過程按照要求即可，注意劃線以處理后續(xù)實驗。實驗失誤：無2.2實驗現(xiàn)象2.2.1制版過程：在自然晾

8、干后，可見圖一所示的層析板。2.2.2后續(xù)過程：在點樣后，溶液干燥后不能再明顯分析斑點的外圍。在層析約30min后溶劑前沿到達(dá)層析板的2/3處左右，可以取出并烘干。溶劑前沿并不是一條直線，故可認(rèn)為該層析板制作質(zhì)量不太高。在利用烤箱烘干后，層析板上出現(xiàn)5個藍(lán)紫色斑點，相互分析。結(jié)果可見圖二。 圖一 層析板 圖二 實驗后的結(jié)果2.3 實驗原始數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)即為各氨基酸色斑中心至樣品原點中心距離和溶液前緣至樣品原點中心的距離記錄，如下表：表一 原始數(shù)據(jù)記錄表各斑點樣品原點中心距離前緣至原點中心距離丙氨酸3.60cm6.50cm精氨酸2.10cm6.40cm甘氨酸3.05cm6.40cm混合點12.01

9、cm6.40cm混合點23.50cm6.40cm說明：由于溶劑前沿并不是一條直線，故我們選取了各斑點垂直的實驗數(shù)據(jù)，以提高實驗的準(zhǔn)確率，減少實驗誤差。6.50cm3.60cm6.40cm3.50cm3.05cm2.10cm2.01cm三、結(jié)果與討論 3.1結(jié)果處理利用原始數(shù)據(jù)，根據(jù)實驗原理中的計算方式計算Rf值： = 可得表二如下：各斑點值氨基酸名稱丙氨酸0.554精氨酸0.328甘氨酸0.476混合點10.314精氨酸混合點20.547丙氨酸根據(jù)Rf值，我們可以測定并粗略地得到結(jié)果：在一定的系統(tǒng)誤差和實驗誤差的允許條件下，混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。 3.2討論 3.

10、2.1結(jié)果上的誤差原因 在實驗的結(jié)果中，我們可以發(fā)現(xiàn)混合點1（精氨酸）混合點2（丙氨酸）。原因可能有： 在整個實驗過程中，層析板的制作是基礎(chǔ)，硅膠分布的均勻與否直接影響了實際的實驗。而從溶劑前沿的彎曲可以知道，實驗所用的層析板質(zhì)量不是很好，一定程度上影響了實驗的數(shù)據(jù)測定，導(dǎo)致實驗的誤差。 人為誤差的存在，在判定斑點前沿和測量距離時，存在一定的誤差，導(dǎo)致了結(jié)果上的不一致性，但這類影響較小。操作過程中存在一定的誤差，如層析時間不足等都有可能導(dǎo)致。3.2.2對實踐的指導(dǎo)與應(yīng)用價值學(xué)習(xí)制作層析板的技巧，多做多練，在練好基礎(chǔ)技能的前提下，可以提高實驗的準(zhǔn)確率和成功率。提高并嚴(yán)格按照各項操作的標(biāo)準(zhǔn)做實驗，

11、在此基礎(chǔ)上對實驗結(jié)果進(jìn)行討論和分析 3.3結(jié)論 薄層層析法操作簡單，在實驗的結(jié)果上也比較的精確，能有效地分離出樣品各組分。運(yùn)用在本實驗，效果也較好。最終可以得到結(jié)果：混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。 3.4思考題3.4.1硅膠的吸附力與含水量的問題答：硅膠屬于極性吸附劑，根據(jù)活性級別越大，吸附能力越小的關(guān)系活性級別硅膠含水量（%）吸附力0不斷增強(qiáng)5152538 即硅膠的吸附能力與含水量呈負(fù)相關(guān)，含水量高，活度級數(shù)高，吸附力弱，反之亦然。3.4.2吸附實驗中吸附劑的選擇根據(jù)答：吸附劑的選擇一般需要根據(jù)實驗來確定。所選的吸附劑應(yīng)有以下幾個特點： 最大的表面積和足夠的吸附能力對待不同的分離組分應(yīng)有不同的吸附能力與溶劑和樣品成分不會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)顆粒均分，不會碎裂。一般的選擇標(biāo)準(zhǔn)可有：被測成分特點吸附劑選