生化實驗技術(shù)講座

1、生物化學(xué)實驗技術(shù)理論講座生物化學(xué)實驗技術(shù)理論講座n工欲善其事，必先利其器工欲善其事，必先利其器n天津科技大學(xué)生物技術(shù)系天津科技大學(xué)生物技術(shù)系n劉常金劉常金n2007 12第一部分第一部分 色譜技術(shù)色譜技術(shù)n層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19061906年俄國植物學(xué)家年俄國植物學(xué)家michael tswettmichael tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為名為“色譜法色譜法”（ch

2、romatography) chromatography) 。n后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。n19441944年出現(xiàn)紙層析。年出現(xiàn)紙層析。n以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理層析法的基本原理n層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為力、分配系數(shù)等

3、），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。以不同的速度移動而達到分離的目的。n按層析過程的機理分類：按層析過程的機理分類：吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析離子交換層析

4、：利用不同組分對離子交換劑親和：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。力的不同。凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。分阻滯作用的不同。n按操作形式不同分類：按操作形式不同分類：柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。移動而達到分離。紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法

5、進行物質(zhì)的分離和鑒定。層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。第一節(jié)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)吸附層析技術(shù)一、基本原理一、基本原理吸附層析法（液吸附層析法（液- -固色譜法，固色譜法，lsclsc） 原理：原理： 利用固定相的固體吸附劑表面利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。 特點：特點：適合分離不同種類的化合物適合分離不同種類的化合物( (醇類醇類和芳香烴）。和芳香烴）。二、吸附劑二、吸附劑 吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的吸附劑是具有大表面積的活性多

6、孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。極性官能團作用。 常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等 羥基羥基磷灰石（羥基羥基磷灰石（haha）caca1010(po(po4 4) )6 6.(oh).(oh)2 2,可用于分離蛋可用于分離蛋白質(zhì)與核酸。白質(zhì)與核酸。其表面有其表面有caca2+2+和和popo4 43-3-兩種帶電基團；酸性和兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)可與中性蛋白質(zhì)可與caca2+2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與popo4 43-3-結(jié)合。結(jié)合。haha柱層析最重要的用途之一是分離單鏈柱層析最重要的用途之一是分

7、離單鏈dnadna和雙鏈和雙鏈dnadna，因為，因為它對雙鏈它對雙鏈dnadna的親和力大于單鏈的親和力大于單鏈dnadna。第二節(jié)第二節(jié) 分配層析技術(shù)分配層析技術(shù)分配層析法（液分配層析法（液- -液層析法，液層析法，llcllc）原理：原理：利用混合物利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的動相）之間的分配系數(shù)分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。分配系數(shù)：分配系數(shù)：當一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它當一種溶質(zhì)分

8、布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和流動相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系在固定相和流動相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)。數(shù)。 k=ck=c1 1/c/c2 2v分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動慢。因此分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動慢。因此可彼此分開。可彼此分開。特點：特點：液液- -液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體第三節(jié)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)凝膠過濾層析技術(shù)一、基本原理一、基本原理概念（概念（排阻層析，分子篩層析）

9、：當生物大分排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小分子大小不同而進行分離的技術(shù)。不同而進行分離的技術(shù)。原理：原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分被分離的混合物流離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢

10、，最后在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。被洗脫出來。二、凝膠的種類和性質(zhì)二、凝膠的種類和性質(zhì) 一一 、交聯(lián)葡聚糖凝膠（、交聯(lián)葡聚糖凝膠（sephadex)sephadex) 1) sephadex g 1) sephadex g g g 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的1010倍。倍。 g g 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。 2 2） sephadex lhsephadex lh2020，是，是sephadex gsephadex g2525的羧丙基衍生物，的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)溶

11、于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)p37p37。二二 、瓊脂糖凝膠（、瓊脂糖凝膠（sepharose ; pharmacia;bio-gel(blo-rad)sepharose ; pharmacia;bio-gel(blo-rad) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。狀結(jié)構(gòu)越密集。 三三 、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠

12、商品名為生物膠p p（bio-gel p).bio-gel p). 四四 、 聚丙乙烯凝膠（聚丙乙烯凝膠（styrogel) styrogel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。三、三、 凝膠過濾在試驗室中的應(yīng)用凝膠過濾在試驗室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化生物大分子物質(zhì)的分離純化2 2）分子量的測定）分子量的測定3 3）分級分離）分級分離4 4）溶液濃縮）溶液濃縮5 5）平衡常數(shù)的測定）平衡常數(shù)的測定6 6）細胞及顆粒的分離）細胞及顆粒的分離第四節(jié)第四節(jié) 離子交換層析法離子交換層析法原理原理: :根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的的親和力親和力不同而達到

13、分離的目的。不同而達到分離的目的。 將離子交換樹脂裝入層析柱。將離子交換樹脂裝入層析柱。 離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團分子中含有可解離的基團. .含有酸性可解離基含有酸性可解離基團的稱為團的稱為陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂，可解離出，可解離出h+h+，含有，含有堿性可解離基團的稱為堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂，可解，可解離出離出oh-oh-。離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理+若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與h+h+發(fā)生交發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上

14、。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質(zhì)可與荷的物質(zhì)可與oh-oh-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下此選用適當?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。來，達到分離純化的目的。+第五節(jié)第五節(jié) 親和層析法親和層析法原理：原理：利用生物大分子間利用生物大分子間特異的親和能力特異的親和能力來純來純化生物大分子化生物大分子 如：如：抗原和抗體抗原和抗體 ； 酶和底物酶和底物或輔

15、酶或抑制劑或輔酶或抑制劑 ； 激素和受體；激素和受體； rnarna和其和其互補的互補的dnadna等。等。 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來。把它從柱上洗脫下來。第六節(jié)第六節(jié) 高壓液相層析（高壓液相層析（hplchplc） 特點：特點：使用的固相支持劑顆粒很細，使用的固相支持劑顆粒很細，表面

16、積很大表面積很大, ,因而分辨率很高。因而分辨率很高。 溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。度增大。 許多類型的柱層析都可用許多類型的柱層析都可用hplchplc來代替，來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。凝膠過濾等。第二部分第二部分 離心技術(shù)離心技術(shù)n離心機的使用及注意事項臺式高、臺式高、超速離心超速離心機機0.6-10萬萬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分以上分以上離心機離心機制備性制備性分析性分析性分析性超速離心機分析性超速離心機普通離心機普通離心機冰凍離心機冰凍離心機臺式（或地臺式（或地面式）普通面式）普通離心機離心機大容量冰大

17、容量冰凍離心機凍離心機小于小于0.6萬萬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分高速冰凍高速冰凍離心機離心機0.6-2.5萬萬超速冰凍超速冰凍離心機離心機2.5-8萬或萬或更高更高( (分析性超速離心主要用于分析性超速離心主要用于檢測大分子物質(zhì)的沉降特檢測大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等征和結(jié)構(gòu)等) )概述概述二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇（一）離心管（一）離心管v 常見的玻璃離心管質(zhì)雖硬，但脆，不能承受超離心的常見的玻璃離心管質(zhì)雖硬，但脆，不能承受超離心的壓力。壓力。v 用于超離心機轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管用于超離心機轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管兩類。兩類。v離心時樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因

18、有氣泡而離心時樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故生事故 （二）離心管帽（二）離心管帽v 超離心機所用離心管一般都附有管帽，離心時離心管超離心機所用離心管一般都附有管帽，離心時離心管需戴上管帽。需戴上管帽。（三）轉(zhuǎn)子及選擇（三）轉(zhuǎn)子及選擇v 主要有角轉(zhuǎn)子（主要有角轉(zhuǎn)子（typetype）、水平轉(zhuǎn)子（）、水平轉(zhuǎn)子（swsw）、垂直轉(zhuǎn)子）、垂直轉(zhuǎn)子（v v）、區(qū)帶轉(zhuǎn)子（）、區(qū)帶轉(zhuǎn)子（c c）等幾種類型。）等幾種類型。1 1、角轉(zhuǎn)子、角轉(zhuǎn)子v 指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉

19、指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降距降越結(jié)實，分離效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積，稱為，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”。最適。最適合差速離心，強度大、方便，但加速或減速時，對樣品有合差速離心，強度大、方便，但加速或減速時，對樣品有攪動。攪動。 2 2、水平轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子v 轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)

20、的離心管，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約從垂直懸吊上升到水平位置（約200200800rpm800rpm）時。顆粒）時。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處降區(qū)帶橫過離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”，但受振動和變速攪亂后對，但受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小得多。

21、流現(xiàn)象小得多。3 3、垂直轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子v 角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時間，轉(zhuǎn)子顆粒移動距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時間，但速度劇變但速度劇變 容易產(chǎn)生對流擾亂。容易產(chǎn)生對流擾亂。4 4、區(qū)帶轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子 已破碎的細胞已破碎的細胞 沉淀（細胞核）沉淀（細胞核） 上清液上清液 沉淀（細胞膜碎片、沉淀（細胞膜碎片、線粒體、溶酶體）線粒體、溶酶體） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白體）沉淀（核糖核蛋白體） 上清液（可上清液（可溶性組分）溶性組分）500g,1010 000g,10

22、100 000g,3h第三部分第三部分 電泳技術(shù)電泳技術(shù)n電泳的概念電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。n電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（18081808年俄國年俄國物理學(xué)家物理學(xué)家reressss進行了世界上第一次電泳實驗）。進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在19371937年用濾紙作年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近幾為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近

23、幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。域得到了廣泛應(yīng)用。 電泳的分類電泳的分類原則上按電泳的原理來分，可分為二類：原則上按電泳的原理來分，可分為二類：n自由界面電泳：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。n區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在是指有

24、支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。按按支持介質(zhì)種類支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。析。醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜

25、電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。率高。 v以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。引引 言言淀粉凝膠電泳淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑

26、度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。實驗室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。測。其分辨率較高。v聚丙

27、烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)引引 言言第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理 電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。分離目的。 .若將帶凈電荷若將帶凈電荷q q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為：的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： f f引引=e q =e q （1）在溶液

28、中在溶液中, ,運動粒子與溶液之間存在阻力運動粒子與溶液之間存在阻力f f阻阻 f f阻阻=6=6r rv v 當當f f引引=f=f阻阻時時 eq= 6eq= 6r rv v v= v= 由上式可以看出由上式可以看出, ,粒子的移動速度粒子的移動速度( (泳動速度泳動速度v)v)與電場強度與電場強度(e)(e)和粒子所帶電荷量和粒子所帶電荷量(q)(q)成正比成正比, ,而與粒子的半徑而與粒子的半徑(r)(r)及溶液的粘度及溶液的粘度( () )成反比。成反比。非球形分子（如線狀非球形分子（如線狀dnadna）在電泳過程中受到更大）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關(guān)。

29、的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關(guān)。eqeq6 6r r（2）（3）（4） 電泳的基本原理電泳的基本原理 在一定在一定phph條件下，每一種分子都具有特定條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。 +- 由由（4 4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影

30、響，可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同，為使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同，為了便于比較，了便于比較，常用遷移率常用遷移率 m m（或稱泳動度，指帶電粒（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）子在單位電場強度下的泳動速度）代替泳動速度表示代替泳動速度表示粒子的泳動情況。粒子的泳動情況。 m = v/e = q/6m = v/e = q/6r r （5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)而與電場強度無關(guān)。量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)而與電場強度

31、無關(guān)。eqeq6 6r r（4）v= 電泳的基本原理電泳的基本原理 由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度隨溶液隨溶液phph變化變化而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移率率u u為遷移率為遷移率m m和當時條件下電離度和當時條件下電離度的乘積。的乘積。 u = m u = m （6 6） 將（將（6 6）式代入（）式代入（5 5）式得：）式得： u =u = （7 7） .q q.6 6r r 由由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影響溶液粘度凡能影響溶液粘度的因素的因素如如溫度溫度，影響分子帶電量，影響分子帶電量q

32、 q及解離度及解離度的因素如的因素如phph的的改變，都會對有效遷移率，產(chǎn)生影響。改變，都會對有效遷移率，產(chǎn)生影響。 電泳的基本原理電泳的基本原理 以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電電滲滲（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。電泳時應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 最后要考慮選用最后要考慮選用離子強度離子強度適宜的溶液

33、。離子強度影響粒子適宜的溶液。離子強度影響粒子的的電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔(dān)大電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。 總之，電泳受總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溶液粘度、溫度、溫度、phph、電滲及離子強度、電滲及離子強度多種因素的影響。多種因素的影響。 第二節(jié)第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel elect

34、ropho-polyacrylamide gel electropho-resisresis，pagepage）是以）是以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對穩(wěn)定，對phph和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體丙烯酰胺單體（acry- acry- lamidelamide，簡稱，簡稱acra

35、cr）和）和交聯(lián)劑交聯(lián)劑n n，n n- -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（methylane methylane bisacrylamidebisacrylamide，簡稱，簡稱bisbis）在催化劑作用下合成的。）在催化劑作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。一、概述一、概述chch2 2=ch=chc=oc=onhnh2 2

36、ch2=chch2=ch c=o c=o nh nh ch ch2 2 nh nh c=o c=o ch ch2 2=ch=ch-ch-ch2 2-ch-ch-chch2 2-ch-ch-n nchch2 2-ch-ch- c=o c=o c=o c=o nh nh2 2 nh nh ch ch2 2 nh nh c=o c=o-ch-ch2 2-ch-ch-chch2 2-ch-ch-n nchch2 2-ch-ch- c=o c=o c=o c=o nh nh nh nh2 2丙烯酰胺丙烯酰胺n,nn,n- -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝膠的制備二、聚丙

37、烯酰胺凝膠的制備 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1 1. .化學(xué)聚合化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑通常采用化學(xué)聚合的催化劑通常采用過硫酸銨過硫酸銨（ammonium persulfateammonium persulfate，apap），此外還需要加速劑），此外還需要加速劑temedtemed（n n，n n，n n，n n- -四甲基乙二胺），四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量它能以自由基的形式存在。微量temedtemed的加入，可使過硫酸銨形成的加入，可使過硫酸銨形成自由基：自由基： s s2 2o o8 82-2- 2so 2so4 4

38、- - 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。. 光聚合通常用光聚合通常用核黃素核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。temedtemed的存在，的存在，可以加速聚合?？梢约铀倬酆?。 上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響： （1 1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行）大氣氧能淬滅自由基，阻止

39、多聚體鏈長的增加。在進行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣?；瘜W(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。合。 （2 2）低溫、低）低溫、低phph都會減慢聚合反應(yīng)速度。都會減慢聚合反應(yīng)速度。 （3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)。2.2.光聚合光聚合 凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（于凝

40、膠總濃度（t t）和）和acracr與與bisbis兩者之比。兩者之比。凝膠總濃度（凝膠總濃度（t t）和交）和交聯(lián)度（聯(lián)度（c c）的計算公式分別為：的計算公式分別為：t= c= t= c= 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔凝膠濃度越大，孔徑越小徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。軟，不易操作，也易斷裂。當凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為當凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%5%時，時，凝膠具有最小孔徑，凝膠具有最小孔徑，超過超過5%5%或低于或低于5%5%時

41、凝膠孔徑都要增大。時凝膠孔徑都要增大。 三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系acr（g）+bis（g）v（ml）x100%acr（g）+bis（g）bis（g）x100% 在濃度為在濃度為7.5%7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%7.5% 凝膠稱為標準膠。對于凝膠稱為標準膠。對于一個未知樣品，常用一個未知樣品，常用7.5%7.5%的標準膠或的標準膠或4%-10%4%-10% 的凝膠梯度來測試，的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。而后選出適宜的凝膠