九章節(jié)酶免疫技術(shù)

1、第九章第九章 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物二、酶標(biāo)記抗體或抗原二、酶標(biāo)記抗體或抗原三、固相載體三、固相載體第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類一、均相酶免疫測定一、均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理一、基本原理二、方法類型及反應(yīng)原理二、方法類型及反應(yīng)原理思考題思考題小結(jié)小結(jié)放射免疫技放射免疫技術(shù)術(shù)發(fā)光免疫技發(fā)光免疫技術(shù)術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn) 主要試

2、劑主要試劑: : 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)記的抗體或抗原 酶標(biāo)物特點(diǎn)：酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性免疫學(xué)活性 酶對底物的催化活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性酶高效催化反應(yīng)的專一性原理及特點(diǎn)原理及特點(diǎn)特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長時酶標(biāo)記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有操作簡便、對環(huán)境沒有污染。污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的衍生出適用范圍更廣的新方法新方法。原理：原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)（抗體）的特

3、異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析定性或定量的測定分析 原理及特點(diǎn)原理及特點(diǎn)標(biāo)記酶的要求：標(biāo)記酶的要求： 活性高活性高 性質(zhì)穩(wěn)定性質(zhì)穩(wěn)定 專一性強(qiáng)專一性強(qiáng) 酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量 方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉 一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（hrphrp） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)主酶與酶

4、活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心輔基是酶的活性中心rzrz值：值：403nm 403nm （輔基）（輔基）與與275nm275nm（主酶）（主酶） odod值之比值之比 rzrz值與酶活性無關(guān)，值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比酶活性單位比rzrz值值更為重要更為重要 elisaelisa中應(yīng)用最為廣中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶泛的標(biāo)記用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（apap） 菌源性菌源性ap ap 腸粘膜腸粘膜apap 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-gal-gal） 用于均相酶用于均相酶免疫測定免疫測定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物hrphrp的底物的底物

5、dhdh2 2+h+h2 2o o2 2 d+2h d+2h2 2o o hrphrp供氫體供氫體dhdh2 2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種 h h2 2o o2 2為受氫體，為受氫體，hrphrp對受氫體的專一性很高對受氫體的專一性很高 常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物hrphrp的常見底物的常見底物 鄰苯二胺鄰苯二胺 opdopd四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 tmbtmb5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-asa 5-asa 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 abtsabts常用底物

6、常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物opdopd反應(yīng)后顯橙黃反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，應(yīng)后呈棕黃色，測定波長測定波長492nm492nm。不穩(wěn)定，致癌性。不穩(wěn)定，致癌性。tmbtmb反應(yīng)后顯藍(lán)色反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色為黃色, ,測定波長測定波長450nm 450nm ，穩(wěn)定，無，穩(wěn)定，無致癌性，致癌性，elisaelisa中應(yīng)中應(yīng)用最廣泛的底物。用最廣泛的底物。 hrphrp的常見底物的常見底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物apap的的底物底物 -gal-gal的底物的底物 對對- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pnpp pnpp ）

7、4-4-甲基傘酮基甲基傘酮基-d-d半半- -乳糖苷乳糖苷（ 4mug 4mug ）經(jīng)經(jīng)apap作用后的產(chǎn)物為黃色對作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm405 nm。 酶作用后，生成高強(qiáng)度酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物熒光物 ，用熒光計(jì)，用熒光計(jì) 測測量。量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技術(shù)的核心組成部分酶免疫技術(shù)的核心組成部分 酶結(jié)合物酶結(jié)合物（conjugateconjugate）酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物 通過化學(xué)反應(yīng)或免通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的抗體或抗原形成的結(jié)合物結(jié)合物 二、酶標(biāo)記抗體或抗原二

8、、酶標(biāo)記抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完整抗原要求純度高，抗原性完整 抗體需要特異性好、效價高、親抗體需要特異性好、效價高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。生產(chǎn)，易純化。 制備方法要求制備方法要求酶標(biāo)記抗體或抗原酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法要求制備方法要求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定酶標(biāo)記物穩(wěn)定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶標(biāo)記抗體或抗原酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法制備方法過碘酸鈉法（直接法）過碘酸鈉法（直接法）常用于常用于hrphrp標(biāo)記抗體或抗

9、原標(biāo)記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)記抗體或抗原酶標(biāo)記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與別與hrphrp和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。 酶標(biāo)記抗體或抗原酶標(biāo)記抗體或抗原純化及鑒純化及鑒定定標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特或抗原聚

10、合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強(qiáng)度作用而降低特異性染色強(qiáng)度 常用的純化方法：常用的純化方法：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠g-200/g-150g-200/g-150過柱層析純化過柱層析純化50%50%飽和硫酸銨沉淀提純飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)記抗體或抗原酶標(biāo)記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面到固相載體的表面 三、固相載

11、體三、固相載體要求要求 結(jié)合抗體或抗原的容量大結(jié)合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原牢固地固定在其表面抗體或抗原牢固地固定在其表面 不影響免疫反應(yīng)性不影響免疫反應(yīng)性 利于反應(yīng)充分進(jìn)行利于反應(yīng)充分進(jìn)行 固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類種類塑料制品塑料制品 微顆粒微顆粒膜載體膜載體 固相載體固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附特異性吸附包被包被coatingcoating封閉封閉bloc

12、kingblocking包被與封閉包被與封閉第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類 酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均均 相相非均相非均相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的

13、活性和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理原理一、均相酶免疫測定一、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術(shù)最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)emitemitenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 cediacediacloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫測定均相酶免疫測定emitemit示意圖示意圖cediacedia示意圖示意圖分類：分類：液相酶免疫測定液相酶免疫測定 固相酶免疫測定固相酶免疫測定 以

14、聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（附試驗(yàn)（elisaelisa） 是目前最為常用的固相酶免是目前最為常用的固相酶免疫測定疫測定與均相不同與均相不同之處之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物二、非均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應(yīng)反應(yīng)加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原抗原和酶標(biāo)抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合在固相上使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離與未結(jié)合的分離1234一、基本原理

15、一、基本原理固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 酶反應(yīng)的底物酶反應(yīng)的底物 三個必要試劑三個必要試劑 二、方法類型及反應(yīng)原理二、方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：應(yīng)用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、hcghcg等等elisaelisa檢測抗原的方法檢測抗原的方法雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原+ +- -e ee ee ee ee

16、 ee ee ee ee e競爭法競爭法 方法：方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）物、激素等）elisaelisa檢測抗原的方法檢測抗原的方法競爭法測抗原競爭法測抗原+ +- -e ee ee ee ee ee ee e2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體原競爭與抗體結(jié)合結(jié)合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底

17、物不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面2 2、加待測物、加待測物和酶標(biāo)抗原，和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合體結(jié)合e e間接法間接法方法方法 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人iggigg（抗（抗抗體或二抗）加底物顯色?？贵w或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用應(yīng)用 常用于常用于hcvhcv抗體、抗體、hivhiv抗體和梅

18、毒螺旋體抗體等的測定抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定elisaelisa檢測抗體的方法檢測抗體的方法間接法測抗體間接法測抗體- -e ee ee ee ee ee ee ee ee e雙抗原夾心法雙抗原夾心法原理：原理：類似雙抗體夾心法類似雙抗體夾心法操作步驟操作步驟：類似類似 應(yīng)用：應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體乙型肝炎表面抗體elisaelisa檢測抗體的方法檢測抗體的方法競爭法競爭法原理：原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核心抗體(hbcab)(hbcab)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗體抗體(hbeab)(hbeab)的檢測的檢測 el

19、isaelisa檢測抗體的方法檢測抗體的方法捕獲法捕獲法 應(yīng)用：應(yīng)用： 病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的igmigm型抗體型抗體 甲型肝炎甲型肝炎hav-igmhav-igm抗體抗體 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心hbc-igmhbc-igm抗體抗體elisaelisa檢測抗體的方法檢測抗體的方法捕獲法捕獲法 原理：原理：抗人抗人igmigm鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測標(biāo)本中捕獲待測標(biāo)本中igmigm類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 捕獲法原理捕獲法原理+ +- -e ee ee ee ee e 1 1、固

20、相化抗人、固相化抗人igmigm1 1、固相化抗人、固相化抗人igmigm2 2、加待測物、加待測物特異性特異性igmigm與與非特異性非特異性igmigm和抗人和抗人igmigm結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結(jié)合性抗體結(jié)合4 4、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色合，加底物顯色2 2、加待測物、加待測物只有非特異性只有非特異性igmigm和抗人和抗人igmigm結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性抗、加特異性抗原，不能與非原，不能與非特異性特異性igmigm結(jié)合結(jié)合4 4、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，無抗原結(jié)合，加底物不顯色加底物不顯

21、色第四節(jié)第四節(jié) 酶免疫測定的應(yīng)用酶免疫測定的應(yīng)用均相酶免疫測定主要用于藥物和小分均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的elisaelisa應(yīng)用更為廣泛，應(yīng)用更為廣泛，elisaelisa廣泛用于廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、（甲肝抗體、“乙肝三對乙肝三對”、丙肝抗、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）?？乖?、前列腺特異性抗原等）。1 1酶免疫技術(shù)的要點(diǎn)？酶免疫技術(shù)的要點(diǎn)？2 2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理（elisaelisa）？）？3 3競爭法在酶聯(lián)免疫檢測應(yīng)用中的原理和應(yīng)用？競爭法在酶聯(lián)免疫檢測應(yīng)用中的原理和應(yīng)用？4 4常用的底物有哪幾類？特點(diǎn)？常用的底物有哪幾類？特點(diǎn)？5 5常用的酶有哪幾類？特點(diǎn)？常用的酶有哪幾