纖維素酶離子液體兼容系統(tǒng)水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)

1、纖維素酶離子液體兼容系統(tǒng)水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)目錄目錄摘要摘要介紹介紹材料與方法材料與方法結(jié)果結(jié)果討論討論摘要 離子液體（ils）已經(jīng)被越來越多地作為一種新型的溶劑應(yīng)用于溶解和預(yù)處理纖維素。但是即使低濃度的離子液體存在，纖維素酶也會(huì)失活。為了更充分地利用離子液體，開發(fā)一種能夠有效溶解和激活木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，并且能使纖維素酶保持高穩(wěn)態(tài)和高活性的兼容的木質(zhì)素離子系統(tǒng)顯得尤為迫切。 本研究中，我們研究了商業(yè)上可獲得的纖維素酶混合在不同濃度的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽中的穩(wěn)定性和活性。介紹 從木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)的生物燃料和化學(xué)品是一種重要的替代傳統(tǒng)石油衍生品的選擇。然而，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)

2、雜性，酶很難將其有效水解。于是需要經(jīng)過必要的預(yù)處理。但是目前所有的預(yù)處理方法往往沒有選擇性，而且產(chǎn)生副產(chǎn)品抑制下游的單糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙醇和其他產(chǎn)品。介紹 最近，一些研究表明，離子液體可以有效地溶解的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，如柳枝稷，白楊樹和松樹木材，小麥秸稈和玉米棒子離子液體 離子液體是指全部由離子組成的液體 與典型的有機(jī)溶劑不一樣，在離子液體里沒有電中性的分子，100%是陰離子和陽離子，在負(fù)100至200之間 均呈液體狀態(tài)，具有良好 的熱穩(wěn)定性和導(dǎo)電性環(huán)境友好無有害氣體價(jià)格相對(duì)便宜易與產(chǎn)物分離對(duì)水具有穩(wěn)定性可反復(fù)多次循環(huán)使用優(yōu)點(diǎn)易回收易回收介紹 本研究考察了 1、在1- 乙基 - 3 - 甲基咪唑乙

3、酸鹽存在下市售纖維素酶和葡萄糖苷酶的混合物的穩(wěn)定性和活性。（1 - 乙基-3- 甲基咪唑乙酸由于具有低粘度，低熔融溫度，且能在相對(duì)溫和的條件下降解纖維素和整個(gè)生物體，從而被選為本次實(shí)驗(yàn)的離子液體。） 2、在15%1- 乙基-3- 甲基咪唑乙酸鹽緩沖溶液共溶混合物中微晶纖維素（一種典型地纖維素）的轉(zhuǎn)化率。材料與方法材料與方法2離子液體中北美鵝掌楸(yp)的水解4材料3 1微晶纖維素在離子液體中的水解3 31-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽離子液體中纖維素酶的穩(wěn)定性研究材料材料 離子液體(1-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽)，檸檬酸一水合物，3,5 -二硝基水楊酸（dns），氫氧化鈉，酒石酸鈉鉀，苯酚，偏亞硫

4、酸氫鈉，羧甲基纖維素（cmc），和微晶纖維素 ph-101（微晶纖維素含有超過97的纖維素和小于0.16的水溶性材料）均購自sigma-aldrich公司（圣路易斯，mo）。 離子液體用干燥劑干燥和在真空下存儲(chǔ)防止水的吸收材料 纖維素酶（celluclast 1.5l，里氏木霉產(chǎn)生的真菌纖維素酶） -葡萄糖苷酶（novozyme 188，來自黑曲霉） 纖維素酶混合物：纖維素酶(celluclast1.5 l)和纖維二糖酶(novozyme 188) 北美鵝掌楸：粉碎后，進(jìn)行一個(gè)提取處理（用乙醇除去非結(jié)構(gòu)性抽提物）注：纖維素酶的活力以每毫升原酶溶液的濾紙單位（fpu）來計(jì)算在1-乙基-3-甲基咪

5、唑乙酸鹽離子液體中纖維素酶的穩(wěn)定性研究 將體積為2ml的酶混合液與不同濃度的離子液體（0%（對(duì)照），5%，10%，15%，20%，30% 體積分?jǐn)?shù)）在檸檬酸鹽緩沖劑（50mm，ph4.8）中進(jìn)行反應(yīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取出等分在不同的反應(yīng)時(shí)間（1.5，3，24小時(shí)）試樣，測(cè)定殘留的酶活性。 通過3,5 -二硝基水楊酸（dns）法測(cè)定羧甲基纖維素產(chǎn)生的還原糖來確定纖維素酶的活性l標(biāo)準(zhǔn)d-葡萄糖溶液（0.25-2毫克/毫升）與不同濃度的離子液體（5-20%，0%作為對(duì)照）進(jìn)行混合，進(jìn)行dns檢測(cè)。確定纖維素酶活性的測(cè)定方法如下：將2體積dns試劑混合于檸檬酸鹽緩沖液50mm（ph 4.8）里，2%纖維素（

6、w/v）與纖維素酶反應(yīng)一小時(shí)微晶纖維素在離子液體中的水解1、微晶纖維素在離子液體中的預(yù)處理2、微晶纖維素酶法糖化在燒杯中將240mg微晶纖維素溶于15ml離子液體中制成1.6%（w/v）的微晶纖維素溶液，50中處理24h。 預(yù)處理后，將溶液用85ml檸檬酸緩沖液稀釋。酶加入后在50 180rpm反應(yīng)。0, 1, 3, 6, 9,12, 24 h時(shí)用dns檢測(cè)還原糖濃度，為更準(zhǔn)確，還用hplc檢測(cè)。未經(jīng)處理的微晶纖維素平行對(duì)照。微晶纖維素在離子液體中的水解3、木質(zhì)素對(duì)微晶纖維素水解的影響將30, 90和 150 mg 木質(zhì)素混合于 15ml含有240 mg 微晶纖維素的離子液體中，也就是0.2%

7、, 0.6%, 1.0%的木質(zhì)素和1.6%的微晶纖維素。72，其余預(yù)處理步驟一樣，用酶水解68h。檢測(cè)方法同上。離子液體中北美鵝掌楸(yp)的水解15ml離子液體中加入600 mg 北美鵝掌楸，制成4% (w/v)的北美鵝掌楸的溶液。該溶液60中攪拌72h。上述溶液用85ml檸檬酸緩沖液稀釋，加入纖維素酶，50，180rpm搖瓶培養(yǎng)。用dns法和hplc法如之前步驟檢測(cè)0，室溫（25），60，100下。與yp的酶法糖化檢測(cè)方法相同。yp的預(yù)處理yp的酶法糖化yp水解時(shí)，緩沖液溫度的影響結(jié)果1、離子液體中纖維素酶的穩(wěn)定性研究5%, 10%, 15%, 20%和30%離子液體，分別在4和50下1.

8、5h，3h，24h平行反應(yīng)。結(jié)果如下：41、1.5h，對(duì)應(yīng)的酶活保留96%, 90%, 87%, 82%,75%即使在30%濃度下，反應(yīng)2、24h，依然保持70%的活力50在50中反應(yīng)24h，離子液體濃度為5%、10%的酶活依然有86%、76%。當(dāng)濃度上升到20%時(shí)，酶活下降到63%。到濃度為30%時(shí)，就只有初始酶活的33%了2、微晶纖維素的酶法糖化1、50離子液體中處理過24h的微晶纖維素和未處理過的微晶體纖維素，分別加入纖維素酶，定時(shí)測(cè)定還原糖含量，如下：1、在15%離子液體中，在開始3小時(shí)就水解了76%纖維素。2、24h后，處理過的微晶纖維素反應(yīng)了91%，未處理過的只有49%2、微晶纖維

9、素的酶法糖化2、不同濃度的木質(zhì)素（(0.2%, 0.6%和1.0%)和1.6%微晶纖維素共1l，分別加入纖維素酶，定時(shí)測(cè)定還原糖含量，如b：24小時(shí)后測(cè)總還原糖如圖4：木質(zhì)素對(duì)纖維素的酶法水解沒有影響24小時(shí)后，測(cè)還原糖總含量1、同樣顯示：木質(zhì)素對(duì)纖維素的酶法水解沒有影響水解2、24小時(shí)后，91的微晶纖維素（對(duì)照組，）被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，微晶纖維素含有木質(zhì)素顯示類似的高轉(zhuǎn)化率分別為88，88和87，2、北美鵝掌楸的酶法糖化1、離子液體處理過和未處理過的yp的比較，以及不同溫度下，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，產(chǎn)生還原糖含量如下：與未處理yp糖化結(jié)果相比，用離子液體活化過的yp明顯改善。在前4小時(shí)，在處理過的yp中大概33%的纖維素被轉(zhuǎn)化成糖，而未處理的只有3%2、北美鵝掌楸的酶法糖化1、離子液體處理過和未處理過的yp的比較，以及不同溫度下，24h產(chǎn)生還原糖總含量，如下：1、室溫下，在24h反應(yīng)后，離子液體處理過的yp轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.3%而無處理的只11.3%。2、濃度分別為54%，45.3%，44.8%，48.8%