細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三－線粒體的分離與觀察

1、上次實(shí)驗(yàn)總結(jié)上次實(shí)驗(yàn)總結(jié) 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)二 線粒體和液泡系的超活染色與觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果：全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 線粒體的分離與觀察線粒體的分離與觀察指導(dǎo)教師：何春梅 林建中1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?用差速離心法分離動(dòng)、植物細(xì)胞線粒體。 2 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理離體的線粒體（mitochondria）的分離是研究線粒體結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)。采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差迷離心制備線粒體。在一給定的離心場(chǎng)中(對(duì)于所使用的離心機(jī)，就是選用一定的轉(zhuǎn)速)，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。細(xì)胞器中最先沉淀的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其它更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。懸浮

2、介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意使樣品保持4，避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠B活染法。詹納斯綠B(JanusgreenB)是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。 3 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料,儀器和試劑儀器和試劑3.1 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 綠豆芽（菜市場(chǎng)購(gòu)買）綠豆芽（菜市場(chǎng)購(gòu)買） 顯微鏡顯微鏡3.2 實(shí)驗(yàn)

3、儀器實(shí)驗(yàn)儀器： 高速離心機(jī)、顯微鏡、小燒杯、紗布、研缽、載玻片、蓋玻片。顯微鏡顯微鏡離心機(jī)離心機(jī)研缽研缽3.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑實(shí)驗(yàn)藥品和試劑(1) 分離介質(zhì)：025 molL蔗糖，50 mmollTris-鹽酸緩沖液(pH74) ，3 mmolL EDTA，075mgml牛血清白蛋白(BSA)(2) 保存液：03molL甘露醇(pH74)(3) 超活染色液：1詹納斯綠B染液 4 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4.1 差速離心分離線粒體差速離心分離線粒體 選取綠豆芽，去掉下胚軸下部和根，保留下胚軸上部和子葉等。 加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿 用多層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)700g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。 取上清液10 000g離心10 min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。 沉淀為線粒體，可存于03molL甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在0-4進(jìn)行。綠豆芽材料的選取加入分離介質(zhì)研磨提取勻漿液差速離心4.2 線粒體的超活染色及觀察取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。 5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄和分析實(shí)