2003季高級生化技術(shù)教程

1、2003秋季高級生化技術(shù)教程 platform technologies of biology生物技術(shù)平臺的兩根支柱：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與單克隆抗體技術(shù) 水生所：水生所： 張張 奇奇 亞亞 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （一）簡介與回顧（一）簡介與回顧 1859年，法國解剖學(xué)家vulpian將蛙胚尾部組織放到水中進行“培養(yǎng)”， 觀察到生長和分化現(xiàn)象。 1885年，德國學(xué)者roux 用生理鹽水使雞胚髓板組織存活了幾天， 提出了“組織培養(yǎng)”的概念。 1897年，loeb 在有血漿凝塊的試管中培養(yǎng)兔肝、腎、甲狀腺和卵巢植塊， 這是最早的器官培養(yǎng)。 1907年，實驗胚胎學(xué)家harrison 在無菌條件

2、下，將蛙胚髓管接種于蛙淋巴液中，使之在體外培養(yǎng)了幾周。 提出細(xì)胞培養(yǎng)無菌與培養(yǎng)基營養(yǎng)等概念。 19121913年， burrows等采用動物(如雞)胚胎浸液等作為營養(yǎng)物， 成功培養(yǎng)了多種動物組織。一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （二）（二） 基本概念基本概念 1、體內(nèi)培養(yǎng)(in vivo culture): 體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)最大限度地模仿了活體結(jié)構(gòu)的自然生長環(huán)境。 最常見的體內(nèi)培養(yǎng)方式就是移植(transplantation)。 2、體外培養(yǎng) (in vitro culture) : 按結(jié)構(gòu)成分分為細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)、 組織培養(yǎng)(tissue culture) 器官培養(yǎng)(or

3、gan culture)。 3、細(xì)胞株(系)與克隆一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （二）（二） 基本概念基本概念 3、細(xì)胞系(株)與細(xì)胞克隆 原代培養(yǎng)(primary culture) 傳代培養(yǎng)(subculture) 細(xì)胞系(cell line): 原代培養(yǎng)經(jīng)傳代后形成的細(xì)胞群體, 由多個生物學(xué)性狀不同的細(xì)胞群體所組成, 分為: 有限細(xì)胞系 (finite cell line，多數(shù)是二倍體) 無限細(xì)胞系(infinite cell line多數(shù)為異倍體) 有的無限細(xì)胞系在具永生性同時也有致瘤性，稱為惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （二）（二） 基本概念基本概念 3、細(xì)胞

4、系(株)與細(xì)胞克隆 細(xì)胞株(cell strain): 具有特殊的生物學(xué)性狀或標(biāo)記，可分為: 有限細(xì)胞株(finite cell strain):不能連續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限。 連續(xù)細(xì)胞株(continuous cell strain):可連續(xù)傳代。 亞株(sub strain): 由原細(xì)胞株克隆形成、與原細(xì)胞株性狀不同的細(xì)胞群。 如hela細(xì)胞的亞株hela229、s3，均有相同染色體標(biāo)志，但對病毒敏感性不同。 細(xì)胞克隆(cell cloning)：從一個單一母細(xì)胞繁殖出來的細(xì)胞群體，細(xì)胞克隆 方法包括：稀釋鋪板法、飼養(yǎng)層克隆法、瓊脂克隆法等。無菌室 超凈工作臺恒溫培養(yǎng)箱 離心機例置相差顯微鏡

5、 水浴箱、解剖剪 鑷子（尖頭、平頭和有鉤鑷）燒杯 培養(yǎng)瓶離心管 吸管細(xì)胞記數(shù)板 酒精燈 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 1、常用設(shè)備和器皿、常用設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器

6、皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （三）（三）設(shè)備和器皿設(shè)備和器皿 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步驟1、細(xì)胞培養(yǎng)的條件： 1) 無菌操作2) 培養(yǎng)用液及配制 培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽、消化液、ph調(diào)節(jié)液等。(舉例如何配制？)3) 溫度 人和哺乳動物35-37； 溫水魚類25-30；冷水魚15-25。4) 生長基質(zhì) 在培養(yǎng)基中添加或在培養(yǎng)器皿表面包被的、 能促進細(xì)胞黏附和貼壁的物質(zhì)稱為生長基質(zhì)。 5) 器皿與器械的清洗消毒 物理方法：紫外線、壓力蒸汽、高溫干熱滅菌、過濾除菌、電離輻射滅菌。 化學(xué)方法：甲醛、環(huán)氧乙烷、乙醇、氯己定、戊二醛、碘伏與碘

7、酊一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步驟 2、動植物細(xì)胞的培養(yǎng)步驟： 切取擬培養(yǎng)的動物器官或大組織塊 洗去血污 剔除多余成分切成約1mm3大小的組織塊 將所有組織剪碎用于組織培養(yǎng) 蛋白酶溶液消化 機械方法吹打組織塊 離心、培養(yǎng)液懸浮 計數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 用于分離細(xì)胞培養(yǎng) 2、動植物細(xì)胞的培養(yǎng)例一：例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng) 準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作 a 培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺內(nèi)， 紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作. b 點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等a 采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死b 將小鼠進入盛有酒精的燒杯中數(shù)秒 c 置超凈工作臺內(nèi)

8、例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)a 打開消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開腹腔,充分暴露腹腔b 用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔背壁脊柱 例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)a 取下雙側(cè)腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中b 用吸管吸取pbs加入培養(yǎng)皿中,清洗腎臟3次,盡量去掉血污. c 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用pbs漂洗，去凈血液為例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化 將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的組織塊。 加入5-8倍體積的0.25%胰蛋白酶，蓋好放入37水浴中消化20-30分鐘,注意應(yīng)每隔

9、5分鐘振搖一次。 當(dāng)組織塊變得疏松,顏色略白時，取出置于超凈工作臺內(nèi)用吸管反復(fù)吹打組織塊,使大部分組織塊分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞狀態(tài) 加入1-2ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉,將上部的組織懸液移入無菌離心管中。例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)離心及計數(shù)離心及計數(shù) 以800-1000轉(zhuǎn)/分離心8-10分鐘,超凈工作臺內(nèi)開蓋,取上清加入適量培養(yǎng)液,細(xì)胞計數(shù)后分裝； 在細(xì)胞瓶(板)上標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期； 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后置37孵箱中培養(yǎng)例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞觀察細(xì)胞觀察 培養(yǎng)細(xì)胞每天觀察，檢查：a.污染與否? b.細(xì)胞生長

10、狀態(tài) 如見培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，為污染;如培養(yǎng)液為桔紅色，表明細(xì)胞狀況良好。在無污染時，24h內(nèi)有細(xì)胞貼壁，圓形懸浮狀的細(xì)胞延展成短梭狀。 培養(yǎng)3-4天，細(xì)胞生長繁殖，可見細(xì)胞島形成。細(xì)胞透明，顆粒少，界線清。 由于細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，co2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時應(yīng)換液。 例一 乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)2、動植物細(xì)胞的培養(yǎng)例二： 例二 魚類細(xì)胞培養(yǎng)魚類細(xì)胞培養(yǎng) 魚類原代細(xì)胞的培養(yǎng) a 斷尾（或剪腮）放血 b 用0.01高錳酸鉀溶液或70的乙醇浸泡消毒30分鐘。 c 70酒精棉球擦洗解剖部位 d 剖開腹腔，取出組織，清除粘膜和血液，剪碎， 維持液(ha

11、nks液)或緩沖液(pbs)洗。 e 用0.25胰酶消化(20，30或4， 過夜) f 離心(1000rpm, 10), 棄去消化液。 g 用培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，分裝培養(yǎng)(應(yīng)在2x104個細(xì)胞/ml 以上)。 當(dāng)原代細(xì)胞長成單層后，即可進行傳代培養(yǎng)。 傳代細(xì)胞的培養(yǎng) a 長成單層的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加胰酶edta，消化后棄去消化液 b 加培養(yǎng)基，吹打分散 c 分裝培養(yǎng) 甲醛固定法用于 細(xì)胞固定，適應(yīng)于一般培養(yǎng)細(xì)胞的固定操作步驟： 1、用psb洗 2、加固定液 3、處理5分鐘 4、用psb洗 伊紅(結(jié)晶紫)染色用于普通細(xì)胞染色，操作步驟: 1、用甲醛法固定細(xì)胞 2、配染色工作液 3、染5-10分鐘

12、4、用脫色液脫洗5分鐘 5、固定制片 培養(yǎng)細(xì)胞的常用固定與染色方法（舉例）培養(yǎng)的魚類傳代細(xì)胞及顯微觀察培養(yǎng)的魚類傳代細(xì)胞及顯微觀察結(jié)晶紫染色結(jié)晶紫染色熒光染料染色熒光染料染色活體細(xì)胞活體細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用舉例：病毒學(xué)研究的基本工具一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步驟 例三 植物原生質(zhì)體 的培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)的異同：（1）目的與結(jié)果一致，模擬體內(nèi)無菌生長條件，使動植物細(xì)胞在體外存活。（2）材料范圍有所不同：植物材料更多（3）營養(yǎng)條件有異：光照、濕度等。（4）生長方式不同：植物組織細(xì)胞有較強的生長、分裂及分化能力； 動物細(xì)胞不能重返全能的未分化特征。

13、一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步驟例三 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 原理：1920年提出的植物細(xì)胞的全能性理論。材料：器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體。例子：嘌呤/生長素的比率能調(diào)控 芽/根的分化 比率，芽形成； 比率，根形成。 莖尖可培育出無病毒株。如莖尖培養(yǎng)脫毒馬玲薯苗。條件： 基本與動物組培相同，無菌、營養(yǎng)、滲透壓、ph、溫度， 還需要： 光照、濕度、氣相(當(dāng)氧時形成胚; 反之成根)。光照對植物組織細(xì)胞的作用不是光合作用的能源， 而是誘導(dǎo)植物細(xì)胞脫分化與再分化。 例三 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)：植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)： 制備優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體，多選用根莖尖、嫩葉或生長期的愈傷組織為材

14、料。 花期短的花瓣組織鮮嫩，又具色素標(biāo)記，是較好的材料。 花瓣表面為排列緊密的表皮組織，不易酶解，用尖頭鑷子撕去表皮 a 將暴露的花肉組織浸泡在酶液里。 b 排列相對疏松的花肉細(xì)胞很容易被酶液消化。 在酶液消化過程中，由于實驗材料的個體差異，酶解時間不固定。因此要用顯微鏡隨時檢查酶解情況。 例三 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)：植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)： 酶解好的原生質(zhì)體經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾到離心管中，除去未消化的大塊組織。 例三 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)：植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)： 1000rpm離心5分鐘,使原生質(zhì)沉淀，棄上清，加培養(yǎng)液吹打懸浮，再離心洗去酶液，并懸浮在培養(yǎng)基中,置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 例三 植物原生質(zhì)體

15、的培養(yǎng)：植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)：顯微鏡下觀察、計數(shù)，加適宜體積的培養(yǎng)基，分裝到細(xì)胞瓶中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)例三 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)：植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)： 3 3 細(xì)胞傳代方法和步驟：細(xì)胞傳代方法和步驟： 細(xì)胞培養(yǎng)34天后，將培養(yǎng)液吸掉，加入pbs緩沖液洗細(xì)胞表面，再將pbs完全吸掉。 加入trypsin-edta，置37數(shù)分鐘，使單層細(xì)胞從瓶面脫落。 加入培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞，在4下，以4,000rpm離心1分鐘。 棄上清液，再將細(xì)胞懸浮移至內(nèi)含培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，于37培養(yǎng)。一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步驟一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （四）方法與步驟（四）方法與步

16、驟4. 細(xì)胞的保存與復(fù)蘇細(xì)胞的保存與復(fù)蘇a 液氮中長期保存的液氮中長期保存的方法步驟方法步驟： 取培養(yǎng)2天的細(xì)胞，加trypsin-edta使細(xì)胞胞懸浮在培養(yǎng)液中再離心。 棄上清液，加保存液(90%培養(yǎng)基+10%dms0)懸??； 分裝保存管中，再移至液氮罐內(nèi)保存。b 低溫中短期保存：低溫中短期保存：c 液氮中保存細(xì)胞的復(fù)蘇液氮中保存細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮罐中取出細(xì)胞，迅速置37水浴中解凍。 4下以4000 rpm離心20秒，棄上層含dmso的培養(yǎng)液。 將細(xì)胞懸于培養(yǎng)液(dmem+5%fcs)中，移至培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)。 通過動物細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的疫苗、單抗酶、生長因子等，已成為醫(yī)藥生物

17、高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。 眾多研究焦中在優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量。 問題 1 細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子、乳酸、的積累 細(xì)胞死亡與凋亡 培養(yǎng)基與細(xì)胞系 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程監(jiān)控 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （五）問題與討論（五）問題與討論 b細(xì)胞漿細(xì)胞分泌抗體；單一b細(xì)胞有其專有抗體(單抗,mcab)二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （一）原理與概念（一）原理與概念 1975年， 英國劍橋大學(xué)學(xué)者kohler 和milstein將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠脾細(xì)胞進行融合，形成既能產(chǎn)生抗綿羊紅細(xì)胞抗體、又能進行分裂繁殖的雜交瘤細(xì)胞，創(chuàng)立了雜交瘤抗體

18、技術(shù)，獲1984年nobel獎。 1984年通過基因工程技術(shù)，初次建立了人-鼠雜交瘤。 1987年單抗制劑開始用于臨床試驗。 單抗技術(shù)，解決了抗體不純的問題，標(biāo)志著抗體制備從機體水平進入了細(xì)胞水平。由此而建立的單鏈抗體庫技術(shù)和噬菌體抗體庫技術(shù)等，則使抗體制備技術(shù)邁進分子水平。 二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （一）原理與概念（一）原理與概念單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù)： 將b淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立能分泌均質(zhì)抗體的雜交瘤細(xì)胞系的生物技術(shù)。也稱為雜交瘤技術(shù)。二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （一）原理與概念（一）原理與概念 雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵是如何篩選雜

19、交瘤細(xì)胞，雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵是如何篩選雜交瘤細(xì)胞， 使用使用hat選擇性培養(yǎng)基解決了此技術(shù)問題。選擇性培養(yǎng)基解決了此技術(shù)問題。 hathat： h h (hypoxanthin)次黃嘌呤 a a (aminopterin)氨基喋呤（正常細(xì)胞dna合成的阻斷劑） t t (thymidine)胸腺嘧啶（供旁路途徑利用） 二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （一）原理與概念（一）原理與概念 正常細(xì)胞嘌呤和嘧啶的生物合成途徑可被氨基喋呤阻斷. 但細(xì)胞在提供了胸腺嘧啶和次黃嘌呤的情況下，依賴胸腺激酶(tk)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(hgprt)可合成dna。 sp2/0 sp2/0 細(xì)胞細(xì)

20、胞 是由有毒藥物(如8氮雜鳥嘌呤或5溴脫氧鳥嘧啶核苷)誘導(dǎo)而選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型小鼠骨髓瘤細(xì)胞，胞內(nèi)無tk或hgprt酶，因此在hat選擇培養(yǎng)基中會死亡。 在與具有tk和hgprt酶的脾細(xì)胞融合后，形成的雜交瘤細(xì)胞獲得了這些酶，因此在hat培養(yǎng)液中能存在并生長繁殖。 二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （一）原理與概念（一）原理與概念二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （二）實驗前的準(zhǔn)備（二）實驗前的準(zhǔn)備1). 器皿試劑器皿試劑 器皿、培養(yǎng)基必須預(yù)處理、嚴(yán)格無菌； 水源: 必須采用無離子水，電導(dǎo)率大（10-6以上）。 培養(yǎng)基：dmem、rp1640，l-谷氨酰胺、 小牛

21、和胎牛血清，8-氮雜鳥嘌呤，hat，ht。 試劑：雙抗，7.5%nahco3，peg100010000，dmso等 羊抗鼠ab、熒光素、堿性磷酸酶、過氧化物酶標(biāo)記物 兔抗鼠igg，iga，igm，輕鏈、等亞級分子。二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （二）實驗前的準(zhǔn)備（二）實驗前的準(zhǔn)備2). 抗原制備抗原制備 抗原越純、活性越高，就越好。 （1）病毒抗原：培養(yǎng)物、病料均要分離純化病毒。 （2）細(xì)菌抗原： 先進行克隆純化、鑒定，批量凍存確保菌株的可靠性 在對數(shù)生長期收獲菌體， 對菌體進行滅活。 （3）寄生蟲、原蟲抗原： 蟲體大，抗原復(fù)雜，要對蟲體成分進行必要純化。二、二、 單克隆抗體

22、制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （二）實驗前的準(zhǔn)備（二）實驗前的準(zhǔn)備4）常規(guī)免疫：）常規(guī)免疫： 免疫劑量：純抗原10-50ug/mouse，粗抗原100-200ug/mouse 佐劑：完全費氏佐劑或不完全費氏佐劑與免疫源等量混合乳化 免疫程序：首免加完全佐劑，腹注量在0.5ml以內(nèi)。5）非手術(shù)脾內(nèi)免疫：非手術(shù)脾內(nèi)免疫： 免疫劑量：10-50ug/mouse，0.05ml， 免疫方法：細(xì)胞融合前35天進行。 刮毛，消毒，見鼠脾位于腹左側(cè)，30度斜角將抗原(少于0.1ml)注入。 三免可用脾內(nèi)免疫代之。 經(jīng)抗原免疫的小鼠 代謝缺陷型小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 收集致敏的小鼠b淋巴細(xì)胞 收集培養(yǎng)的細(xì)胞 在pe

23、g作用下進行細(xì)胞融合 用hat培養(yǎng)基篩選雜交細(xì)胞 用免疫學(xué)方法篩選可分泌特異抗體的雜交細(xì)胞 雜交細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 再檢測、再克?。ㄖ貜?fù)23次，至100的雜交瘤生長孔陽性為止） 陽性克隆的擴增和凍存 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 收集陽性克隆培養(yǎng)上清液進行單克隆抗體性狀鑒定 單克隆抗體的生產(chǎn)和純化二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （三）單抗制備流程圖（三）單抗制備流程圖二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （四）雜交融合（四）雜交融合 1. sp2/0細(xì)胞的復(fù)蘇：細(xì)胞的復(fù)蘇： 2. 免疫小鼠的準(zhǔn)備：免疫小鼠的準(zhǔn)備： 3. balb/c小鼠免疫脾細(xì)胞的制備：小鼠免疫脾細(xì)胞的制備：

24、 (1) 頸動脈放血 (2) 取出脾臟 (3) 擠出脾細(xì)胞并用dmem培養(yǎng)基懸浮之 (4) 離心并松弛細(xì)胞團 (5) 氯化銨低滲，去除紅細(xì)胞 (6) sp2/0細(xì)胞離心、重懸在10ml dmem中備用 (7) 將經(jīng)氯化銨低滲，去除紅細(xì)胞的鼠脾細(xì)胞懸浮在dmem培養(yǎng)基中 (8) 細(xì)胞計數(shù) 二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （四）雜交融合（四）雜交融合4. 細(xì)胞融合細(xì)胞融合： (1) sp2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞按1:2至5例混合，混勻，離心并懸浮細(xì)胞團。 (2) 緩慢加入細(xì)胞融合劑（peg），同時不斷地旋轉(zhuǎn)離心瓶。 (3) 離心，棄上清，松弛細(xì)胞團。 將細(xì)胞重懸在15牛血清和hat的

25、全價選擇培養(yǎng)基。 (4) 按每毫升105 sp2/0細(xì)胞中做進一步稀釋，并移到一無菌的加樣槽中， 用8孔微量移液器，將細(xì)胞分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml (5) 58co2中培養(yǎng)到第五天， 每孔加0.1ml新鮮的hat培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)五天。二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （四）雜交融合（四）雜交融合 5. 檢測分析：檢測分析： （1）于第812天觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況， 雜交瘤細(xì)胞長至孔底1/2或培養(yǎng)基顏色偏黃時，在細(xì)胞板上做好標(biāo)記 (2) 分別將待檢的上清移到無菌處理的舊板內(nèi)， 每孔取0.1ml，然后進行抗體活性測定 (3) 第二批及第三批長大的細(xì)胞，按上述方法分批檢測

26、， 對有雜交瘤細(xì)胞生長細(xì)胞孔，生長時間超過12天的進行半量更液。 (4) 當(dāng)用于檢測的上清移走后，馬上加入等量新鮮的ht培養(yǎng)基。二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （五）（五）雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)與特異性分析雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)與特異性分析 1 陽性雜交瘤細(xì)胞的擴大培養(yǎng)：陽性雜交瘤細(xì)胞的擴大培養(yǎng)：2、陽性雜交瘤細(xì)胞的特異性分析：、陽性雜交瘤細(xì)胞的特異性分析：3、細(xì)胞克隆：、細(xì)胞克?。?(1)有限稀釋法克隆： (2)、軟瓊脂培養(yǎng)法克?。?(3)、甲基纖維素分離法： 4、單抗的生產(chǎn)、單抗的生產(chǎn) (1). 用組織培養(yǎng)的方法。 (2). 用接種動物體內(nèi)繁殖法生產(chǎn)單抗。 有報道顯示(2)比(1)的單抗含量要高1000倍。二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （六）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（六）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1、凍存：凍存： 1）離心收集混懸細(xì)胞 2）加入凍存劑混勻后置液氮中保藏 3）短期凍存(2-3個月)，-80冰箱直接保存2 2、復(fù)蘇：、復(fù)蘇： （方法已介紹）二、二、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) （七）（七）單抗研究進展及其應(yīng)用單抗研究進展及其應(yīng)用 單抗制備技術(shù)的改進單抗制備技術(shù)的改進： 選擇弱免疫原載體， 采用脾內(nèi)免疫、腹腔植入、淋巴結(jié)注射和足墊注射， 使用eb病毒、