實驗報告-硝酸還原酶活性的測定

1、首都師范大學生命科學學院實驗報告課程名稱 植物生理實驗實驗時間2010331成績 姓名 唐倪文班級_3 學號1090800032實驗題目 硝酸還原酶活性的測定一、實驗原理硝酸還原酶是植物氮素作用中的關鍵性酶，硝酸還原酶作用于NO使之還原為NO。NO-+ NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2O產(chǎn)生的NO可以從植物組織滲透到外界溶液中，積累在溶液中。因此，測定反 應液中NO含量的增加即表明酶活性的大小。NO含量的測定-磺胺法NO 2-與磺胺和:-萘胺在酸性條件下生成粉紅色化合物，用比色法在520nm下讀 取光密度值。二、實驗用品1. 材料：完全營養(yǎng)的小麥苗，缺氮培養(yǎng)的小麥苗2. 儀

2、器和用具：722型分光光度計，剪刀，真空泵，電子天平，溫箱，燒杯，移液槍，tip 頭(兩種規(guī)格：1000卩I，200卩I )三、實驗步驟1. 分別配制反應液于小燒杯中(1) 0.1M 磷酸緩沖液5ml +蒸餾水5ml(2) 0.1M 磷酸緩沖液 5ml + 0.2MKNQ 5ml2. NO2-的獲得(1) 稱取新鮮葉片0.5g共四份,剪成小片，分別置于小燒杯內(nèi)的反應液中。(2) 在真空干燥器中抽氣20min,使葉片沉于溶液底部，溶液即可滲入組織內(nèi)取代其 中的空氣，內(nèi)部產(chǎn)生的NO可滲透到外部溶液中。3. 將小燒杯轉到30 T溫箱，使其不見光，保溫20min。4. 用5卩g/ml NaNO2母液配

3、制標準梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml。5. 吸取不同濃度的NaNOml于試管中，加入磺胺試劑2ml及a -萘胺試劑2ml，混合均勻，在60C水浴中保溫20min,于比色杯中，在520nm下進行比色，讀取光 密度，然后做出光密度一濃度曲線，以光密度為縱坐標，NaN染度為橫坐標。具體步驟及結果如下表和下圖所示。試劑管號12345678NaNO母液(ml)00.020.10.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）10.980.90.80.60.40.201%磺胺(ml)22222:220.2 % a -萘胺 (ml)22222222每管亞硝酸氮含量（卩g）00.1

4、0.51.02.03.04.05.0每管NaNO濃度（卩 g/ml）00.10.51.02.03.04.05.0光密度00.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493標準曲線:光密度值-亞硝酸鈉詼度光密度值線性（光密度值）y = 0. 0994 xR2 二 O 99965.吸取反應液各1 ml于試管中加入磺胺和:-萘胺各2 ml,60 C水浴20min,生成 粉紅色化合物.用比色法在520nm下讀取光密度值，從標準曲線上查得NO的含量, 結果如下表。小麥幼苗兀全培養(yǎng)液缺N培養(yǎng)液KNOKNO小麥鮮重（g）0.510.510.490.48光密度0.1780.1760.065

5、0.039亞硝酸鈉濃度（卩 g/ml）1.7911.7710.6540.392亞硝態(tài)氮含量（卩g）1.7911.7710.6540.392酶活性105.39104.1840.0424.506. 計算酶活性,以每小時每克鮮重所產(chǎn)生的 NO微克數(shù)表示(NQ-/h.g )X (pg)X V1 (ml) V2 (ml)樣品中酶活性=(NQyg Fwg-1時)樣品鮮重 x酶反應時間(h)公式中：X從標準曲線查出反應液中亞硝態(tài)氮總量(gg )VI提取酶時加入的緩沖液體積(ml)2酶反應時加入的酶液體積(ml)完全培養(yǎng)液，KNQ酶活性=(1.791/1)*10/0.51*(20/60)= 105.39完全培

6、養(yǎng)液，H20酶活性=(1.771/1)*10/0.51*(20/60)= 104.18缺N培養(yǎng)液，KNO酶活性=(0.654/1)*10/0.49*(20/60)= 40.04缺N培養(yǎng)液，H2O酶活性=(0.392/1)*10/0.48*(20/60)= 24.50將結果填入上表。四、實驗結果分析 在完全培養(yǎng)液和缺N培養(yǎng)液中，加KNO普遍都要比加H20的酶活性高，說明KNO 為酶促反應提供了底物，讓酶促反應進行徹底。在完全培養(yǎng)液和缺N培養(yǎng)液中，加KNO相互比較，加H0的相互比較，完全培養(yǎng) 液的酶活性都要高，說明N誘導了硝酸還原酶，使之活性增大。五、思考題1. 依據(jù)原理，測硝酸還原酶活性的實質(zhì)是

7、以什么物質(zhì)的含量來表示的？哪一步影 響 NO2- 的浸出量？答：實質(zhì)是以亞硝酸根（NO-）的含量來表示的。因為 NO可以從組織內(nèi)滲到外 界溶液中并積累，因此測定反應溶液中 NQ的含量的增加，即表明酶活性的大小。真空泵抽氣影響NO的浸出量。因為反復抽氣放氣，溶液可滲入葉組織取代 葉片空氣，葉片便沉于溶液底部，酶促反應可以相對完全的進行。2.為什么做兩組溶液，一組培養(yǎng)液中加入H0和一組培養(yǎng)液中加入KNO的作用是? 答：培養(yǎng)時做完全培養(yǎng)和缺 N培養(yǎng)是因為硝酸還原酶是誘導酶。實驗時一組加KNO一組加HH0是因為KNO為酶促反應提供底物，讓反應得 以徹底進行。3. 實驗前要使材料經(jīng)一定時間光照，其作用是? 答：讓材料進行一段時間光合作用，積累有機物4. 小燒杯置于30C，不見光保溫的原因是？答：酶促反應在暗反應下進行，以防光照下葉綠體形成還原型鐵氧還蛋白，促使 亞硝酸鎂把NO還原成NH。暗反應下反應可