細(xì)胞凋亡與疾病-高級病生

1、 何何 芳芳 教教 授授石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 20132013年年9 9月月 細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與疾?。╝poptosis and disease） 概述概述 凋亡時細(xì)胞的主要變化凋亡時細(xì)胞的主要變化 細(xì)細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控胞凋亡過程與調(diào)控 細(xì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生機制胞凋亡的發(fā)生機制 細(xì)胞凋亡常用的研究方法細(xì)胞凋亡常用的研究方法 細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與疾病一一. .概述概述n( (一一) )凋亡概念的提出凋亡概念的提出 19651965年澳大利亞年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實質(zhì)組織中有一門靜脈后，電鏡觀察到肝實質(zhì)

2、組織中有一些散在的死亡細(xì)胞，顯然不同于細(xì)胞壞死。些散在的死亡細(xì)胞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍的組織中脫落并被吞噬，機體無炎癥反應(yīng)。的組織中脫落并被吞噬，機體無炎癥反應(yīng)。19721972年年kerrkerr等等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念。凋亡的概念。n apoptosis ( (細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡) )：由體內(nèi)由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程稱為導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程稱為細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡，又稱又稱programmed cell death,pcd

3、( (程序性細(xì)胞死亡程序性細(xì)胞死亡) )( (二二) )細(xì)胞凋亡的研究歷史細(xì)胞凋亡的研究歷史1.1972-19871.1972-1987：細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物化：細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)研究階段學(xué)研究階段：1 1）利用光鏡和電鏡對形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)）利用光鏡和電鏡對形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)的研究。的研究。2 2）染色體）染色體dnadna的降解。的降解。3 3）rna/rna/蛋白質(zhì)大分子的合成。蛋白質(zhì)大分子的合成。4 4）鈣離子變化。）鈣離子變化。 5 5）內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。）內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。2.2.細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究階段細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究階段: :1 1）細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因

4、及調(diào)控）細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因及調(diào)控2 2）細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3 3）細(xì)胞凋亡的各種分子及其相互作用）細(xì)胞凋亡的各種分子及其相互作用3.3.細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段(三三)細(xì)胞凋亡生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡生物學(xué)意義確保正常發(fā)育、生長。確保正常發(fā)育、生長。維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。發(fā)揮積極的防御功能。發(fā)揮積極的防御功能。二二. .凋亡時細(xì)胞的主要變化凋亡時細(xì)胞的主要變化 ( (一一) )形態(tài)學(xué)改變形態(tài)學(xué)改變 正常正常細(xì)胞細(xì)胞凋亡小體凋亡小體吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞壞死壞死凋亡凋亡細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的比較細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的比較1) 細(xì)胞間連接喪失；細(xì)胞

5、間連接喪失；2）胞體固縮；）胞體固縮；3）細(xì)胞器完整；）細(xì)胞器完整；4）核固縮；）核固縮；5）染色質(zhì)邊集；）染色質(zhì)邊集；6）凋亡小體形成）凋亡小體形成1、凋亡的主要形態(tài)學(xué)變化、凋亡的主要形態(tài)學(xué)變化 表面的微絨毛消失，并逐步脫離與周圍細(xì)胞的接表面的微絨毛消失，并逐步脫離與周圍細(xì)胞的接觸。觸。 細(xì)胞體積逐漸縮小，細(xì)胞體積逐漸縮小，出現(xiàn)固縮出現(xiàn)固縮(condensation)(condensation)。 胞漿脫水，胞膜迅速發(fā)生胞漿脫水，胞膜迅速發(fā)生空泡化空泡化(blebbing)(blebbing)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張并與胞膜融合，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張并與胞膜融合，形成出芽出芽(buding)(buding)

6、現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 晚期出現(xiàn)晚期出現(xiàn)染色質(zhì)邊集染色質(zhì)邊集(margination)(margination)。 線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不大。線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不大。 形成凋亡小體形成凋亡小體(apoptosis body),(apoptosis body),這是凋亡細(xì)胞這是凋亡細(xì)胞 特征的形態(tài)學(xué)改變。特征的形態(tài)學(xué)改變。*2、細(xì)胞凋亡與壞死的比較細(xì)胞凋亡與壞死的比較壞壞 死死 凋凋 亡亡 誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)因素 強烈刺激，隨機發(fā)生強烈刺激，隨機發(fā)生 較弱刺激，非隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生 生化性質(zhì)生化性質(zhì) 病理性，非特異性病理性，非特異性 生理性或病理性，特異性生理性或病理性，特異性 特點

7、特點 被動過程，無新蛋白被動過程，無新蛋白 主動過程，有新蛋白合成，主動過程，有新蛋白合成， 合成合成, ,不耗能，不耗能， 耗能耗能 形態(tài)變化形態(tài)變化 細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、 胞膜及細(xì)胞器相對完整，細(xì)胞膜及細(xì)胞器相對完整，細(xì) 破壞、細(xì)胞腫脹破壞、細(xì)胞腫脹 胞皺縮，核固縮胞皺縮，核固縮 dnadna電泳電泳 彌散性降解，電泳呈彌散性降解，電泳呈 dnadna片段化片段化(180-200bp)(180-200bp)，電，電 均一均一dnadna片狀片狀 泳呈泳呈“梯梯”狀條帶狀條帶 炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng) 溶酶體破裂，局部炎溶酶體破裂，局部炎 溶酶體相對完整，局部無炎癥溶酶體相對完整，局

8、部無炎癥 癥反應(yīng)癥反應(yīng) 反應(yīng)反應(yīng) 凋亡小體凋亡小體 無無 有有 基因調(diào)控基因調(diào)控 無無 有有 3、 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋亡、pcd的區(qū)別的區(qū)別 特征特征 pcd pcd 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué) 細(xì)胞固縮，裂成小體細(xì)胞固縮，裂成小體 同左同左 膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 同左同左 線粒體線粒體 常有陣發(fā)的自噬作用常有陣發(fā)的自噬作用 無變化無變化 染色質(zhì)染色質(zhì) 凝聚，電子致密度加大凝聚，電子致密度加大 著邊著邊 自噬作用自噬作用 常有，但并非一定發(fā)生常有，但并非一定發(fā)生 無無 潛伏期潛伏期 幾小時幾小時 幾分鐘到幾小時幾分鐘到幾小時 蛋白質(zhì)合成蛋白質(zhì)合成 放線菌素放線菌素d d及放

9、線菌酮及放線菌酮 放線菌素放線菌素d d及放線及放線 阻斷死亡阻斷死亡 有時阻斷死亡有時阻斷死亡 胞漿生化變化胞漿生化變化 溶酶體酶活性有時增加，溶酶體酶活性有時增加， 溶酶體增加，溶酶體增加，c-myc,c-myc, 偶有熱休克蛋白、偶有熱休克蛋白、c-mycc-myc， c-fos?c-fos? c-fos c-fos 核核dnadna電泳電泳 無梯狀無梯狀dna dna 梯狀梯狀dnadna圖譜圖譜 首先的表現(xiàn)首先的表現(xiàn) 蛋白質(zhì)合成下降，方式改變蛋白質(zhì)合成下降，方式改變 內(nèi)源性核酸酶活化內(nèi)源性核酸酶活化4 4、細(xì)胞凋亡與脹亡的比較細(xì)胞凋亡與脹亡的比較脹亡脹亡 凋凋 亡亡 早期早期 細(xì)胞腫

10、脹波及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)細(xì)胞腫脹波及胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 細(xì)胞皺縮、體積縮小、胞漿濃縮細(xì)胞皺縮、體積縮小、胞漿濃縮 胞漿疏松化并且有空泡形胞漿疏松化并且有空泡形 及出芽改變及出芽改變 成體積增大成體積增大 形態(tài)變化形態(tài)變化 胞膜完整性破壞、胞膜完整性破壞、 胞膜及細(xì)胞器相對完整胞膜及細(xì)胞器相對完整 細(xì)胞器崩解細(xì)胞器崩解 dnadna電泳電泳 非特異性非特異性 dnadna片段化片段化(180-200bp)(180-200bp)，電，電 dnadna片段片段 泳呈泳呈“梯梯”狀條帶狀條帶 炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng) 周圍明顯炎周圍明顯炎 溶酶體相對完整，局部無炎癥溶酶體相對完整，局部無炎癥 癥反應(yīng)癥反應(yīng) 反應(yīng)反應(yīng) 凋亡小體凋亡

11、小體 無無 有有 1997年美國毒理病理學(xué)會細(xì)胞死亡命名委員會將細(xì)胞死亡年美國毒理病理學(xué)會細(xì)胞死亡命名委員會將細(xì)胞死亡途徑分為凋亡和脹亡（途徑分為凋亡和脹亡（oncosis）( (二二) )細(xì)胞凋亡的生化改變細(xì)胞凋亡的生化改變1.dna1.dna的片段化：判斷凋亡發(fā)生的客觀的片段化：判斷凋亡發(fā)生的客觀指標(biāo)之一指標(biāo)之一 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用引起的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用引起的dnadna斷裂產(chǎn)生斷裂產(chǎn)生的單鏈缺口優(yōu)先發(fā)生于核小體連接區(qū)，使的單鏈缺口優(yōu)先發(fā)生于核小體連接區(qū)，使dnadna斷斷裂成核小體倍數(shù)大小的片段裂成核小體倍數(shù)大小的片段, , 即即180-200bp180-200bp倍數(shù)倍數(shù)大小的片

12、段大小的片段, , 在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的階在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的階梯狀梯狀dnadna區(qū)帶。區(qū)帶。 1.1. 凋亡早期即發(fā)生；凋亡早期即發(fā)生；2.2. 核小體間連接部位斷裂成核小體間連接部位斷裂成180180200bp200bp整倍數(shù)片段；整倍數(shù)片段； 3.3. 染色質(zhì)染色質(zhì)dnadna單鏈斷裂。單鏈斷裂。2.2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用(ca(ca2+2+/mg/mg2+2+) ) dnase dnase、dnase (ph=6.2dnase (ph=6.2左右）左右） ,topo ,topo 、 topo topo （解旋）（解旋） （1 1）

13、caspases caspases 的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu):caspase:caspase成員都具有相似的氨基酸序成員都具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性，正常時它們都以酶原列、結(jié)構(gòu)和底物特異性，正常時它們都以酶原（30-50kd30-50kd）形式存在，包括三個結(jié)構(gòu)域：一個）形式存在，包括三個結(jié)構(gòu)域：一個n n末端原結(jié)構(gòu)域，一個大亞基（末端原結(jié)構(gòu)域，一個大亞基（20kd20kd），一個小亞），一個小亞基（基（10kd10kd）。）。3. caspases 3. caspases 激活激活（2 2）caspasescaspases特點：特點：活性中心半胱氨酸活性中心半胱氨酸在催化底物時，總

14、是在天冬氨酸殘基的在催化底物時，總是在天冬氨酸殘基的c c端裂解端裂解底物底物 caspases caspases酶原的活性很低，需要切除氨基端的酶原的活性很低，需要切除氨基端的一段序列才能被激活一段序列才能被激活活化的活化的caspasescaspases能夠特異水解一套蛋白底物能夠特異水解一套蛋白底物, ,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)caspasescaspases與其抑制劑總是共存，以免與其抑制劑總是共存，以免caspasescaspases酶原被意外激活，對正常細(xì)胞造成損傷酶原被意外激活，對正常細(xì)胞造成損傷（3 3）caspasescaspases分類：分類：根據(jù)大小

15、亞單位序列的同源性以及功能根據(jù)大小亞單位序列的同源性以及功能: :細(xì)胞因子處理組：細(xì)胞因子處理組：1 1，4 4，5 5，1111，1212，1313，1414凋亡起始組：凋亡起始組：2 2，8 8，9 9，1010凋亡效應(yīng)組：凋亡效應(yīng)組： 3 3，6 6，7 7，(4) (4) caspasecaspase的活化的活化: :前體的前體的n-n-端前肽和大亞端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除基之間的特定位點被水解去除n-n-端前肽，然后再端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有小亞基組成異源

16、二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。活性的四聚體。 （5 5）激活方式：）激活方式：自活化（自活化（autoactivationautoactivation）: :長長原原結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域( (caspases-8,10)轉(zhuǎn)活化（轉(zhuǎn)活化（transactivationtransactivation）: :短原結(jié)構(gòu)域短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7)連接調(diào)節(jié)亞單位激活連接調(diào)節(jié)亞單位激活: :(caspases-9)非非caspasecaspase蛋白酶的活化蛋白酶的活化 （activation by activation by non-caspase proteinasesnon-ca

17、spase proteinases）: :細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性t t淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞的顆粒酶胞的顆粒酶b(b(caspase -3,7,8,910 ） ，組織蛋白酶，組織蛋白酶g (g (caspase -7 ） apaf-1（5 5）激活方式：）激活方式：自活化（自活化（autoactivationautoactivation）: :長長原原結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域( (caspases-8,10)轉(zhuǎn)活化（轉(zhuǎn)活化（transactivationtransactivation）: :短原結(jié)構(gòu)域短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7)連接調(diào)節(jié)亞單位激活連接調(diào)節(jié)亞單位激活: :(caspases-9)非非casp

18、asecaspase蛋白酶的活化蛋白酶的活化 （activation by activation by non-caspase proteinasesnon-caspase proteinases）: :細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性t t淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞的顆粒酶胞的顆粒酶b(b(caspase -3,7,8,910 ） ，組織蛋白酶，組織蛋白酶g (g (caspase -7 ） （6 6）目前已知的）目前已知的caspasecaspase功能有：功能有： 滅活凋亡抑制蛋白。滅活凋亡抑制蛋白。 直接作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，裂解核纖層，使核纖直接作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，裂解核纖層，使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。層蛋

19、白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。 分解與細(xì)胞骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白其中包括凝分解與細(xì)胞骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白其中包括凝膠原蛋白（膠原蛋白（gelsingelsin）、聚合粘附激酶（）、聚合粘附激酶（focal focal adhesion kinase ,fakadhesion kinase ,fak）、）、p21p21活化激酶活化激酶（pakpak）等，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組、凋亡。）等，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組、凋亡。caspasecaspase可使一些與可使一些與dnadna修復(fù)、復(fù)制和修復(fù)、復(fù)制和mrnamrna縫縫結(jié)有關(guān)的蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)解離，瓦解核結(jié)構(gòu)結(jié)有關(guān)的蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)解離，瓦解核結(jié)構(gòu)，使細(xì)

20、胞降解為凋亡小體。，使細(xì)胞降解為凋亡小體。 (7)caspase(7)caspase的抑制劑：的抑制劑：病毒性抑制劑：病毒性抑制劑：n1)1)牛痘病毒蛋白牛痘病毒蛋白crmacrma（cytokine response cytokine response modifier amodifier a）：直接作用于成熟）：直接作用于成熟caspasecaspase活活性位點性位點 有效抑制有效抑制caspase1caspase1，4 4，6 6，8 8，對，對caspase2caspase2，3 3，7 7，1010效果差效果差n2)p35:2)p35:以競爭性結(jié)合的方式與靶分子形成穩(wěn)以競爭性結(jié)合的

21、方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體肽類抑制劑：肽類抑制劑：nac-devd.cho,acyvad.cho,z-vad.fmkbcl-2bcl-2蛋白家族：蛋白家族：其他其他:no:no及其相關(guān)分子，鋅及其相關(guān)分子，鋅3)3)桿狀病毒蛋白桿狀病毒蛋白iapiap（inhibitor of apoptosis inhibitor of apoptosis family proteinfamily protein，7 7種），不是活性位點特異性抑種），不是活性位點特異性抑制劑制劑4)v-flip4)v-flip：包含兩個：包含兩個dedded，與，與caspa

22、secaspase競爭結(jié)合死亡競爭結(jié)合死亡受體復(fù)合物受體復(fù)合物5)5)蛋白蛋白hbxhbx（乙肝病毒編碼）：（乙肝病毒編碼）： caspase-3caspase-3 4 4、大分子合成、大分子合成 n(1)(1)細(xì)胞凋亡需要細(xì)胞凋亡需要rnarna和（或）蛋白質(zhì)的合成，和（或）蛋白質(zhì)的合成，大分子合成抑制劑可阻斷細(xì)胞凋亡；大分子合成抑制劑可阻斷細(xì)胞凋亡；n(2)(2)細(xì)胞凋亡發(fā)生前所需生物大分子已存在于細(xì)細(xì)胞凋亡發(fā)生前所需生物大分子已存在于細(xì)胞內(nèi)，只是被分割開來或以無活性狀態(tài)存在，胞內(nèi)，只是被分割開來或以無活性狀態(tài)存在，其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些離子的存其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些離

23、子的存在在, ,除非有活化信號傳入，它們對細(xì)胞并不造成除非有活化信號傳入，它們對細(xì)胞并不造成損害，這種情況下細(xì)胞凋亡不受蛋白質(zhì)或損害，這種情況下細(xì)胞凋亡不受蛋白質(zhì)或rnarna合合成抑制劑的影響；成抑制劑的影響； n(3)(3)細(xì)胞內(nèi)已有凋亡所需的大分子物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)已有凋亡所需的大分子物質(zhì)，只是其功能被其它生物大分子（如只是其功能被其它生物大分子（如bcl-2bcl-2）的連續(xù)合成所抑制，此時蛋白質(zhì)或的連續(xù)合成所抑制，此時蛋白質(zhì)或rnarna合合成抑制劑能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。成抑制劑能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。n5 5、鈣離子的動員、鈣離子的動員內(nèi)鈣釋放外鈣內(nèi)流 ca2+i增加增加 內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)

24、流途徑鈣池ca2+引起細(xì)胞凋亡的機制引起細(xì)胞凋亡的機制線粒體線粒體肌漿網(wǎng)肌漿網(wǎng)損傷刺激損傷刺激肌漿肌漿caca2+2+鈣蛋白酶鈣蛋白酶染色質(zhì)染色質(zhì) 凝集凝集磷脂酶磷脂酶磷脂分解磷脂分解谷氨酰胺谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶骨架蛋骨架蛋白破壞白破壞核酶核酶染色體染色體 損傷損傷似秋葉的凋零，似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；告別生命之輝煌；那難以計數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，那難以計數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡線粒體把生命之光一點一點擰淡; ;危難中的

25、細(xì)胞啊，危難中的細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)不亂，你沉穩(wěn)不亂，dna片片切割，片片切割，化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命的凝重濃集在小體上；把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時光；再見了快樂美好的時光；這一切的一切又融入臨近的胞體，這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。騰出的空間再寫生命的篇章。 三三. .細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控凋凋亡亡誘誘導(dǎo)導(dǎo)因因素素受受體體campca2+神經(jīng)酰胺神經(jīng)酰胺凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)+dnase激活激活caspases激活激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行細(xì)胞凋亡的執(zhí)行死

26、亡信號死亡信號凋亡凋亡相關(guān)相關(guān)基因基因激活激活凋亡基因激活凋亡基因激活巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬分解吞噬分解凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞的清除凋亡細(xì)胞的清除( (一一) )細(xì)胞凋亡過程細(xì)胞凋亡過程凋亡過程凋亡過程受體受體campca2+神經(jīng)酰胺神經(jīng)酰胺凋亡相關(guān)凋亡相關(guān)基因激活基因激活信信號號轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)細(xì)胞膜細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)因素凋亡誘導(dǎo)因素+dnase激活激活caspases激活激活死亡信號死亡信號apoptosisapoptosis凋亡過程與調(diào)控凋亡過程與調(diào)控凋亡過程凋亡過程執(zhí)行凋亡執(zhí)行凋亡凋亡細(xì)胞的清除凋亡細(xì)胞的清除dnase激活激活caspases激活激活(二二)細(xì)細(xì) 胞胞 凋凋 亡亡 的的

27、 調(diào)調(diào) 控控1.1.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與抑制 2.2.細(xì)胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction) 多樣性多樣性 偶聯(lián)性偶聯(lián)性 同一性同一性 多途性多途性 死亡受體是一組死亡受體是一組tnftnf受體基因超家族的成員，受體基因超家族的成員，包括包括fas(cd95,apo1)fas(cd95,apo1)，tnfr1(p55,cd120a)tnfr1(p55,cd120a)，死亡，死亡受體受體dr3 dr3 、dr4dr4、dr5dr5等。其結(jié)構(gòu)特點為胞外區(qū)有一等。其結(jié)構(gòu)特點為胞外區(qū)有一半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(cyst

28、ein-rich domain)(cystein-rich domain)，胞，胞內(nèi)區(qū)有一死亡結(jié)構(gòu)域內(nèi)區(qū)有一死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, dd)(death domain, dd)。它們是。它們是一組膜蛋白，一組膜蛋白，與與faddfadd結(jié)合，而結(jié)合，而faddfadd的聚集則通過其的聚集則通過其死亡效應(yīng)區(qū)死亡效應(yīng)區(qū)(death effect domain,ded)(death effect domain,ded)激活激活caspase-8caspase-8。 (1)(1) 死亡受體途徑死亡受體途徑 fasfas配體配體( (凋亡信號凋亡信號) ) fas(dr)fas(dr) 細(xì)

29、胞膜細(xì)胞膜 fas(death domain)fas(death domain) fadd(fas-associated fadd(fas-associated death domain) death domain)caspase-8(2)線立體途徑線立體途徑:smase鞘磷脂鞘磷脂神經(jīng)酰胺神經(jīng)酰胺(ceramide)磷 酸 膽 堿磷 酸 膽 堿 (phosphocholine)tnf、糖皮質(zhì)、糖皮質(zhì)激素、電離輻射、激素、電離輻射、紫外線紫外線(3)(3)以神經(jīng)酰胺為第二信使介導(dǎo)的細(xì)胞以神經(jīng)酰胺為第二信使介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡凋亡 (4)dag/pkc系統(tǒng)系統(tǒng)n(5)camp /pka信號系統(tǒng)信號系統(tǒng)

30、 pkapka使關(guān)鍵的蛋白質(zhì)使關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分子發(fā)生不同程度的磷酸分子發(fā)生不同程度的磷酸化，進(jìn)而影響內(nèi)源性核酸化，進(jìn)而影響內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的活性，在研究糖內(nèi)切酶的活性，在研究糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡時，即發(fā)現(xiàn)亡時，即發(fā)現(xiàn)campcamp和內(nèi)源和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶與細(xì)胞凋亡性核酸內(nèi)切酶與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)的現(xiàn)象。呈正相關(guān)的現(xiàn)象。n(6)胞內(nèi)胞內(nèi)ca2+ 信號系統(tǒng)信號系統(tǒng)3.3.凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因(1)bcl-2(1)bcl-2及其相關(guān)基因：及其相關(guān)基因： b b 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞淋巴瘤/ /白血病白血病-2-2（b cell b cell lymphoma/leukemia

31、-2lymphoma/leukemia-2），）， 19841984年從濾泡性淋巴年從濾泡性淋巴瘤發(fā)現(xiàn)，存在于核膜和線粒體。瘤發(fā)現(xiàn)，存在于核膜和線粒體。19881988年首次證實年首次證實bcl-2bcl-2基因的高表達(dá)可引發(fā)腫瘤，基因的高表達(dá)可引發(fā)腫瘤，bcl-2bcl-2家族至少家族至少有有1515個成員。個成員。1)1)抑制凋亡抑制凋亡bcl-2bcl-2亞族：亞族：bcl-2bcl-2、mcl-1mcl-1、bcl-wbcl-w等等, ,存在于線存在于線粒體膜上。粒體膜上?？沟蛲龅闹饕獧C制是：抗凋亡的主要機制是： 直接的抗氧化直接的抗氧化 抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)抑制線粒體釋放促凋

32、亡的蛋白質(zhì) 抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白baxbax、bakbak的細(xì)胞毒的細(xì)胞毒作用作用 抑制凋亡蛋白酶抑制凋亡蛋白酶(caspases)(caspases)的激活的激活 維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定 2)促進(jìn)凋亡促進(jìn)凋亡bax亞族：亞族：bax、bak、bad、bik、bid等，存在于線粒體膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。等，存在于線粒體膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。bax與與bcl-2相關(guān)蛋白很高的同源性，編碼三個蛋白：相關(guān)蛋白很高的同源性，編碼三個蛋白：bax-、bax-和和bax-。bcl-2與與bax的比率不同也可影響細(xì)的比率不同也可影響細(xì)胞凋亡。胞凋亡。3)bcl-x： bcl-xl(241氨基酸

33、氨基酸):與與bcl-2同源性同源性74% bcl-xs(178,少少63) bcl-2家族成員家族成員p53p53基因基因wtp53wtp53 修復(fù)受損的修復(fù)受損的dnadna，如修復(fù)失敗則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如修復(fù)失敗則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡突變的突變的p53p53失活的失活的p53p53喪失監(jiān)視喪失監(jiān)視dnadna損傷的功能損傷的功能射線，毒素射線，毒素p53p53蛋白蛋白+細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡促進(jìn)凋亡基因促進(jìn)凋亡基因(mtp53）雙向調(diào)控基因雙向調(diào)控基因 c-mycc-myc是一種癌基因，是調(diào)控細(xì)胞周期的主要是一種癌基因，是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因。編碼的蛋白是基因。編碼的蛋白是dnadna結(jié)合蛋白，調(diào)控基

34、因轉(zhuǎn)結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在錄，在gfgf充足時主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因；充足時主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。反之激活凋亡基因。 c-myc促進(jìn)凋亡基因促進(jìn)凋亡基因抑制凋亡基因抑制凋亡基因 雙向調(diào)控基因雙向調(diào)控基因fas bax ice p53c-mycbcl-x eib、iap、bcl-2 凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因正常正常細(xì)胞細(xì)胞 調(diào)控細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞凋亡的某些基因間的相互某些基因間的相互關(guān)系關(guān)系ice 、w tp53 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 ice促進(jìn)促進(jìn) bax 、c-myc 、fas抑制抑制 bcl-2mtp53 凋亡凋亡 wtp53 bcl-2 bax 誘導(dǎo)和抑制誘導(dǎo)

35、和抑制細(xì)胞凋亡基細(xì)胞凋亡基因因四四. .細(xì)胞凋亡的發(fā)生機制細(xì)胞凋亡的發(fā)生機制( (一一) )氧化損傷在細(xì)胞凋亡中的作用氧化損傷在細(xì)胞凋亡中的作用( (二二) )鈣穩(wěn)態(tài)失衡鈣穩(wěn)態(tài)失衡(calcium dyshomeostasis)(calcium dyshomeostasis)( (三三) )線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用( (一一) )氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的可能機制是：氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的可能機制是： 氧自由基引起的氧自由基引起的dnadna損傷可激活損傷可激活p53p53基因?；颉?氧自由基引起的氧自由基引起的dnadna損傷可活化聚損傷可活化聚adpadp核糖

36、核糖 轉(zhuǎn)移酶，引起轉(zhuǎn)移酶，引起nadnad快速耗竭，快速耗竭，atpatp大量消耗。大量消耗。 氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸， 引起脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜的損傷可引起脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜的損傷可 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 氧化應(yīng)激可激活氧化應(yīng)激可激活caca2+2+/mg/mg2+2+依賴的核酸內(nèi)切酶，依賴的核酸內(nèi)切酶，也可產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象。也可產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象。 氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細(xì)氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細(xì)胞膜的通透性使胞膜的通透性使caca2+2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 自由基對線

37、粒體膜損害導(dǎo)致其通透性和膜電位自由基對線粒體膜損害導(dǎo)致其通透性和膜電位的變化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。的變化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子nf-kbnf-kb和和ap-1ap-1，可，可加速細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋加速細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。亡。( (二二) )鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)胞凋亡的可能機制：鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)胞凋亡的可能機制： 激活激活caca2+2+/mg/mg2+2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解依賴的核酸內(nèi)切酶，降解dnadna鏈；鏈； 激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的酰基激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的酰基 轉(zhuǎn)移，在肽鏈間

38、形成共價鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分轉(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分 子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成； 激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄； caca2+2+在在atpatp的配合下使的配合下使dnadna鏈?zhǔn)嬲梗┞冻龊诵◇w鏈?zhǔn)嬲?，暴露出核小體 之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于dnadna內(nèi)切酶切內(nèi)切酶切 割割dnadna。 bcl-2bcl-2 ( ()()() ) 線粒體線粒體 ptpptp開放開放 apaf+cyt.c caspase-9caspase-9酶

39、原酶原 caspaes-9caspaes-9 m下降下降 caspase-3caspase-3酶原酶原 caspase-3caspase-3 caspase抑制劑抑制劑 aif 蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解 無活性核無活性核酸酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 核酸核酸內(nèi)切內(nèi)切 酶激活酶激活 dna dna斷裂斷裂ca2+no缺血缺血缺氧缺氧活性氧活性氧（+）( () )（+）（+）（+）( () )（三）線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用（三）線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用20022002年年1010月月7 7日英國人悉尼日英國人悉尼布雷諾爾；美國人羅伯特布雷諾爾；美國人羅伯特霍霍維茨和英國人約翰維茨和英國人

40、約翰蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。20022002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者（圖片來自年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者（圖片來自http:/www.nobel.se/http:/www.nobel.se/）細(xì)胞凋亡檢測方法細(xì)胞凋亡檢測方法基于形態(tài)學(xué)觀察的染色法基于形態(tài)學(xué)觀察的染色法基于基于dna 片斷化的檢測法片斷化的檢測法膜聯(lián)蛋白檢測法膜聯(lián)蛋白檢測法caspase酶分析法酶分析法流式細(xì)胞儀定量分析法流式細(xì)胞儀定量分析法五五. .細(xì)胞凋亡常用的研究方法細(xì)胞凋亡

41、常用的研究方法（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究方法（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究方法1 1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1 1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落?？梢姷蛲鲂◇w。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2 2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。染色質(zhì)分

42、割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡常用的常用的dnadna特異性染料有：特異性染料有：ho 33342 (hoechst ho 33342 (hoechst 33342)33342)，ho 33258 (hoechst 33258), dapiho 33258 (hoechst 33258), dapi。三種。三種種染料與種染料與dnadna的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在dnadna的的a-ta-t堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。3 3、透射電子

43、顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡凋亡期（期（pro-apoptosis nucleipro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象cavitationscavitations）的空泡結(jié)構(gòu)的空泡結(jié)構(gòu)( (圖圖2)2)；a a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。生凋亡小體。 凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（掃描電鏡）凋亡細(xì)胞

44、超微結(jié)構(gòu)改變（掃描電鏡）凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（透射電鏡）凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（透射電鏡）核濃縮呈球形核濃縮呈球形染色質(zhì)邊聚染色質(zhì)邊聚呈新月形呈新月形壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞 鑒定細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)常用方法鑒定細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)常用方法特性特性 推薦使用手段推薦使用手段說明說明細(xì)胞表面改變細(xì)胞表面改變 胞漿改變胞漿改變 染色質(zhì)凝聚染色質(zhì)凝聚核裂解核裂解 超微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡掃描電鏡 相差顯微鏡相差顯微鏡 相差顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 透射電鏡透射電鏡 微絨毛消失，芽狀突起。微絨毛消失，芽狀突起。 見到凋亡小體見到凋亡小體細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜變形，胞細(xì)胞皺縮，

45、質(zhì)膜變形，胞 漿空泡漿空泡適用于組織切片適用于組織切片用結(jié)合用結(jié)合dna的染料的染料(pi) 標(biāo)記。適用于培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記。適用于培養(yǎng)細(xì)胞定量測定定量測定dna含量，測含量，測 量細(xì)胞的大小和蛋白。量細(xì)胞的大小和蛋白。 用于培養(yǎng)細(xì)胞用于培養(yǎng)細(xì)胞完整的細(xì)胞器，胞漿空完整的細(xì)胞器，胞漿空 泡，核染色質(zhì)凝聚核裂泡，核染色質(zhì)凝聚核裂 解，凋亡小體，適用于解，凋亡小體，適用于 組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞（二）（二）dnadna降解分析降解分析1 1、dna ladder:dna ladder:進(jìn)行進(jìn)行dnadna的凝膠電泳和溴化乙啶染的凝膠電泳和溴化乙啶染色（瓊脂糖凝膠電泳、色（瓊脂糖凝膠電泳、s

46、ds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、dnadna印跡、脈沖場電泳、單細(xì)胞電泳技術(shù)等）印跡、脈沖場電泳、單細(xì)胞電泳技術(shù)等）細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞dna電泳圖電泳圖1細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)誘導(dǎo)0 h2細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)誘導(dǎo)1 h3細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)誘導(dǎo)2 h4細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)誘導(dǎo)3 h5細(xì)胞色素細(xì)胞色素c誘導(dǎo)誘導(dǎo)4 h6陰性對照陰性對照7marker 2 2、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase termina

47、l -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunelmediated nick end labeling, tunel）原理：細(xì)胞凋亡中原理：細(xì)胞凋亡中, , 染色體染色體dnadna雙鏈斷裂或單鏈斷雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性裂而產(chǎn)生大量的粘性3-oh3-oh末端，可在脫氧核糖核苷末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（酸末端轉(zhuǎn)移酶（tdttdt）的作用下，將脫氧核糖核苷酸）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到衍生物標(biāo)記

48、到dnadna的的3-3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測檢測. .3 3、通過、通過fcmfcm進(jìn)行檢測進(jìn)行檢測（三）（三）酶學(xué)分析研究方法酶學(xué)分析研究方法1 1、caspase3caspase3活性測定活性測定（1 1）western blot western blot 分析分析procaspase-3procaspase-3的活化的活化caspase-3caspase-3正常以酶原（正常以酶原（32kd32kd）的形式存在于胞）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的caspase-3caspase-3由兩個大

49、亞基（由兩個大亞基（17kd17kd）和兩個小亞基）和兩個小亞基（12kd12kd）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（2 2）caspase-3caspase-3作用的特異底物作用的特異底物( ( 熒光測定免熒光測定免疫吸附法疫吸附法, fient ) , fient ) 乙?；於彼嵋阴；於彼? -谷氨酸谷氨酸- -纈氨酸纈氨酸- -天冬氨酰胺天冬氨酰胺, (ac-, (ac-devd),devd),設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽ac-devd-amcac-devd-amc。在共價偶。在共價偶聯(lián)時，聯(lián)時

50、，amcamc不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出amcamc，自，自由的由的amcamc才能被激發(fā)發(fā)射熒光。才能被激發(fā)發(fā)射熒光。而且而且caspase3caspase3活性的大小與活性的大小與ac-devd-amcac-devd-amc的分解量或自由熒光的分解量或自由熒光amcamc產(chǎn)生的熒光的強弱呈產(chǎn)生的熒光的強弱呈正比。本法可用于各種培養(yǎng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)研究。而且特異正比。本法可用于各種培養(yǎng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)研究。而且特異性強，靈敏度高，無交叉反應(yīng)。只要有性強，靈敏度高，無交叉反應(yīng)。只要有5%5%的細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞發(fā)生凋亡，用該方法即可檢測出來。，用該方法即可檢測出來。2 2、多聚（、多聚（adp-adp-核糖）聚合酶核糖）聚合酶polypoly（adp-riboseadp-ribose）polymerasepolymerase，