生物免疫分析技術(shù)

1、第四章 生物免疫分析技術(shù) 免疫學(xué)方法在食品分析中正得到越來越廣泛的免疫學(xué)方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運(yùn)用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（運(yùn)用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）已經(jīng)在）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，它能夠用于測(cè)定人們希食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，它能夠用于測(cè)定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如現(xiàn)在人們所關(guān)注的食品安全性問題中一些物質(zhì)現(xiàn)在人們所關(guān)注的食品安全性問題中一些物質(zhì)的檢測(cè)：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長(zhǎng)素、的檢測(cè)：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長(zhǎng)素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加

2、劑。以及一些添加劑。 免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點(diǎn)；可對(duì)大量的樣品進(jìn)行常規(guī)分和低成本的優(yōu)點(diǎn)；可對(duì)大量的樣品進(jìn)行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠?qū)悠肺?；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠?qū)悠愤M(jìn)行定量測(cè)定以確定樣品中待測(cè)組分的含量。進(jìn)行定量測(cè)定以確定樣品中待測(cè)組分的含量。4.1 免疫的原理免疫的原理 ag + ab agab 特異性、靈敏性特異性、靈敏性 在在ag，ab反應(yīng)中，用容易示蹤的化學(xué)物反應(yīng)中，用容易示蹤的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記一種反應(yīng)物，以了解反應(yīng)是否發(fā)質(zhì)標(biāo)記一種反應(yīng)物，以了解反應(yīng)是否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對(duì)生，

3、發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對(duì)未知成分的樣品進(jìn)行定性、定位及定量未知成分的樣品進(jìn)行定性、定位及定量分析）。分析）。4.2 酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法n免疫酶技術(shù)：免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來。它的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來。它具有免疫熒光試驗(yàn)和放射免疫試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，具有免疫熒光試驗(yàn)和放射免疫試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，并克服上述兩種方法的缺點(diǎn)。并克服上述兩種方法的缺點(diǎn)。n酶標(biāo)記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長(zhǎng)，酶標(biāo)記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長(zhǎng)，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫試驗(yàn)，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫試驗(yàn)，可直接肉眼觀察也可借助簡(jiǎn)單的儀器作定可

4、直接肉眼觀察也可借助簡(jiǎn)單的儀器作定量測(cè)定，所得結(jié)果比較客觀。量測(cè)定，所得結(jié)果比較客觀。n酶免疫測(cè)定或免疫酶技術(shù)是指酶標(biāo)記抗體或酶酶免疫測(cè)定或免疫酶技術(shù)是指酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它主要包括兩它主要包括兩個(gè)方面：個(gè)方面：n免疫過氧化物酶法：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標(biāo)記，以過氧化物酶作為標(biāo)記，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學(xué)或電子顯產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學(xué)或電子顯微鏡觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的抗原或抗體。微鏡觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的抗原或抗體。n酶聯(lián)免疫吸附法：

5、酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保留其免疫活性，結(jié)溶性固相載體結(jié)合后，還保留其免疫活性，結(jié)合了作為標(biāo)記的酶催化作用。合了作為標(biāo)記的酶催化作用。 elisa的基本原理和方法的基本原理和方法 elisa的種類和變化的種類和變化 elisa的特點(diǎn)的特點(diǎn) elisa的應(yīng)用實(shí)例的應(yīng)用實(shí)例elisa4.2.1 基本原理基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體

6、也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：種必要的試劑：固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）標(biāo)記物）酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原

7、（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而氧化還原反應(yīng)而呈顏色。呈顏色。 顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反應(yīng)的深淺來定量抗比，因此可借助于顏色反應(yīng)的深淺來定量抗體或抗原。體或抗原。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。加以測(cè)定。 其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。4.2.2 酶及其底物酶及其底物 酶結(jié)合物

8、是酶與抗體或抗原酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是elisa成敗的關(guān)鍵試劑，它成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng)。，將得到不同的顏色反應(yīng)。酶酶 底底 物物顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng) 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-

9、乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍(lán)綠色藍(lán)綠色492460449425642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(pnp)(pnp)萘酚萘酚-as-mx-as-mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 abts+hrp+abts+hrp+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍(lán)色深藍(lán)色 405420 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4mug)(4mug)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(onp

10、g) (onpg) 熒光熒光黃色黃色 360,450420 4.2.3 elisa的種類和變化的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法（二）間接法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（三）競(jìng)爭(zhēng)法 （四）雙位點(diǎn)一步法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)（五）捕獲法測(cè)igmigm抗體抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的（六）應(yīng)用親和素和生物素的elisaelisa （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原步驟：步驟：a 將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；b 加入待檢標(biāo)本溶液，使溶液中的抗原與加入待檢標(biāo)本溶

11、液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；c 加入酶標(biāo)記特異性抗體，溫育后清洗；加入酶標(biāo)記特異性抗體，溫育后清洗；d 加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色的改變與所加的待檢標(biāo)本溶液中的抗原的改變與所加的待檢標(biāo)本溶液中的抗原量成正比。量成正比。間接法是檢測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接抗體，故稱為間接法。法。步驟：步驟：a 將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或?qū)⒁阎扇苄钥乖接谳d體（聚苯乙烯

12、板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；b 加入待檢稀釋血清，若血清中有相應(yīng)特異性抗加入待檢稀釋血清，若血清中有相應(yīng)特異性抗體存在則與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；體存在則與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；c 加入酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體，此時(shí)酶標(biāo)記抗抗加入酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體，此時(shí)酶標(biāo)記抗抗體與吸附的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，溫育后清洗；體與吸附的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，溫育后清洗；d 加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并顯色，用光電比色計(jì)測(cè)定底物顯色深淺，即可顯色，用光電比色計(jì)測(cè)定底物顯色深淺，即可推知抗體量。推知抗體量。（三）競(jìng)爭(zhēng)法（三

13、）競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于檢測(cè)小分子抗原。此法可用于檢測(cè)小分子抗原。步驟：步驟：a 將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；b 將可能含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)記的已知抗原將可能含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)記的已知抗原溶液以適當(dāng)比例混合，加入已包被的載體孔中，溶液以適當(dāng)比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；溫育后清洗；c 加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。色深表示加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。色深表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)記的結(jié)合的酶標(biāo)記抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)記的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原少

14、，而待檢溶液中抗原量多。少，而待檢溶液中抗原量多。 對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。較弱。 4.2.4 特點(diǎn)特點(diǎn)特點(diǎn)一：靈敏性特點(diǎn)一：靈敏性 該測(cè)定法的靈

15、敏度來自酶。眾所周知該測(cè)定法的靈敏度來自酶。眾所周知, 酶是一種酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。為酶放大體系。elisa實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量?？怂缴蠈?duì)其進(jìn)行定量。 例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為色法的敏感度為mg/ml水平，

16、酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為度約為510g/ml 。 特點(diǎn)二：特異性特點(diǎn)二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？蛊涮禺愋詠碜钥贵w或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？乖贵w反應(yīng)具有高度的特異性。 例如乙肝病毒中的表面抗原（例如乙肝病毒中的表面抗原（hbsaghbsag）、）、e e抗原（抗原（hbeaghbeag）和核心抗體（）和核

17、心抗體（hbcaghbcag），雖來源），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。需先分離待檢物。elisaelisa應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例 飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定 飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素， 簡(jiǎn)曲霉毒素簡(jiǎn)曲霉毒素 ） 飼料中有

18、害微生物的快速篩檢飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏（如沙門氏菌菌 ） 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對(duì)硫磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 elisa在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用elisa用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（例如殺暝松（ fn fn ）、）、 甲氟磷酸異已酶（甲氟磷酸異已酶（ soman soman ）、）、 草不綠（草不綠（ alachor alachor ）、）、

19、 西維因（西維因（ carbaryl carbaryl ）、）、 多菌靈及克菌丹（多菌靈及克菌丹（ captan captan ）等。）等。農(nóng)藥的檢測(cè)農(nóng)藥的檢測(cè)： elisa elisa檢測(cè)檢測(cè) “ “非典型肺炎非典型肺炎”冠狀病毒冠狀病毒 elisa elisa在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白a2a2（hnrnpa2hnrnpa2）/ /類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ptapta）3333抗體抗體elisaelisa在疾病診斷中的作用在疾病診斷中的作用 elisa elisa法檢測(cè)幽門螺桿菌抗體法檢測(cè)幽門螺桿菌抗體el

20、isaelisa試劑盒商業(yè)資訊試劑盒商業(yè)資訊elisa試劑盒試劑盒酶聯(lián)免疫井酶聯(lián)免疫井dnm-9602gdnm-9602g酶標(biāo)分析儀酶標(biāo)分析儀dnm-9602 dnm-9602 標(biāo)配酶標(biāo)分析儀標(biāo)配酶標(biāo)分析儀 dnm-9602adnm-9602a酶標(biāo)分析儀酶標(biāo)分析儀幾種酶標(biāo)分析儀幾種酶標(biāo)分析儀4.3 放射免疫法放射免疫法n放射免疫測(cè)定（放射免疫測(cè)定（radioimmunoassay，ria）是是1959年由年由berson和和yalow首先用于糖尿病患首先用于糖尿病患者胰島素含量的測(cè)定，是一種將同位素分析的靈者胰島素含量的測(cè)定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性這兩大特點(diǎn)結(jié)合起敏性

21、和抗原抗體反應(yīng)的特異性這兩大特點(diǎn)結(jié)合起來的免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)。來的免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)。n其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確性好、樣品其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確性好、樣品用量少，而且不需要復(fù)雜的提純步驟。缺點(diǎn)是需用量少，而且不需要復(fù)雜的提純步驟。缺點(diǎn)是需要特殊的儀器設(shè)備和一定的防護(hù)條件，而且有些要特殊的儀器設(shè)備和一定的防護(hù)條件，而且有些同位素標(biāo)記物的半衰期較短以及試驗(yàn)廢物難以處同位素標(biāo)記物的半衰期較短以及試驗(yàn)廢物難以處理，對(duì)環(huán)境造成放射性污染。理，對(duì)環(huán)境造成放射性污染。放射免疫測(cè)定法放射免疫測(cè)定法基本原理基本原理n放射免疫測(cè)定是建立在待測(cè)抗原和標(biāo)記抗放射免疫測(cè)定是建立在待測(cè)抗原和標(biāo)記抗原對(duì)有限量抗體進(jìn)行