CRISPRCas9基因敲除原理及其應用

1、_CRISPR/Cas9 基因敲除原理及其應用CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。 在細菌及古細菌中， CRISPR 系統(tǒng)共分成 3類，其中類和類需要多種 CRISPR相關蛋白（ Cas 蛋白）共同發(fā)揮作用，而類系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件1 。目前，來自 Streptococcuspyogenes的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA

2、兩條單鏈。 Cas9首先與 crRNA及 tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM 序列結合并侵入 DNA ，形成 RNA-DNA 復合結構，進而對目的 DNA 雙鏈進行切割，使 DNA 雙鏈斷裂。由于 PAM 序列結構簡單（ 5-NGG-3 ），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應用。 CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應用于植物、 細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)1 。通過基因工程手段對crRNA 和 tracrRNA 進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（ singleguideRNA ）。融合的 RNA 具有與野生型 RNA 類似的活力

3、， 但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA 的原件與表達 Cas9 的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作2,3 。目前常用的CAS9 研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：Cas9 質粒構建pGK1.1設計 2 條單鏈 oligo 序列；退火形成雙鏈DNA將雙鏈 DNA 連接到載體中轉化 G10competentcell篩選陽性克?。粶y序驗證序列；質粒大提；電轉染靶細胞精品資料_在細胞內crRNA 識別靶位點， Cas9 對靶位點進行隨機剪切CruiserTM酶切細胞池， 計算突變率； CruiserTM酶切初篩陽性克隆； 將

4、陽性克隆測序驗證；做敲除序列比對分析。目前常見的CAS9 普通質粒有（漢恒生物提供cas9 質粒試劑盒） ：雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現(xiàn)解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見 addgene （ lentiCRISPRv2 ，lentiGuide-Puro ，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩(wěn)定的表達（漢恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝） ，但是由于慢病毒克隆能力有限而 CAS9 本身分子量比較大（大于 4kb ），且長期插入可能導致亂切， 脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢， 腺病毒克隆能力強， 獲得的病毒滴度也高。 同時相對于普通質粒來說，作用是時間也比較長， 可以達到更理想的敲除效果。