CRISPRCas9基因敲除原理及其應(yīng)用

1、_CRISPR/Cas9 基因敲除原理及其應(yīng)用CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來(lái)自細(xì)菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機(jī)制。 在細(xì)菌及古細(xì)菌中， CRISPR 系統(tǒng)共分成 3類，其中類和類需要多種 CRISPR相關(guān)蛋白（ Cas 蛋白）共同發(fā)揮作用，而類系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件1 。目前，來(lái)自 Streptococcuspyogenes的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA

2、兩條單鏈。 Cas9首先與 crRNA及 tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過(guò)PAM 序列結(jié)合并侵入 DNA ，形成 RNA-DNA 復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)目的 DNA 雙鏈進(jìn)行切割，使 DNA 雙鏈斷裂。由于 PAM 序列結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單（ 5-NGG-3 ），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點(diǎn)，因此得到廣泛的應(yīng)用。 CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、 細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)1 。通過(guò)基因工程手段對(duì)crRNA 和 tracrRNA 進(jìn)行改造，將其連接在一起得到sgRNA（ singleguideRNA ）。融合的 RNA 具有與野生型 RNA 類似的活力

3、， 但因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)得到了簡(jiǎn)化更方便研究者使用。通過(guò)將表達(dá)sgRNA 的原件與表達(dá) Cas9 的原件相連接，得到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作2,3 。目前常用的CAS9 研究方法是通過(guò)普通質(zhì)粒,質(zhì)粒構(gòu)建流程如下：Cas9 質(zhì)粒構(gòu)建pGK1.1設(shè)計(jì) 2 條單鏈 oligo 序列；退火形成雙鏈DNA將雙鏈 DNA 連接到載體中轉(zhuǎn)化 G10competentcell篩選陽(yáng)性克?。粶y(cè)序驗(yàn)證序列；質(zhì)粒大提；電轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞精品資料_在細(xì)胞內(nèi)crRNA 識(shí)別靶位點(diǎn)， Cas9 對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)剪切CruiserTM酶切細(xì)胞池， 計(jì)算突變率； CruiserTM酶切初篩陽(yáng)性克?。?將

4、陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證；做敲除序列比對(duì)分析。目前常見(jiàn)的CAS9 普通質(zhì)粒有（漢恒生物提供cas9 質(zhì)粒試劑盒） ：雖然普通質(zhì)粒很多時(shí)候也能達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，但是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有效率低，作用時(shí)間短暫性等缺點(diǎn)。病毒的出現(xiàn)解決了質(zhì)粒這些問(wèn)題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質(zhì)粒見(jiàn) addgene （ lentiCRISPRv2 ，lentiGuide-Puro ，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)（漢恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝） ，但是由于慢病毒克隆能力有限而 CAS9 本身分子量比較大（大于 4kb ），且長(zhǎng)期插入可能導(dǎo)致亂切， 脫靶等，同時(shí)慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢(shì)， 腺病毒克隆能力強(qiáng)， 獲得的病毒滴度也高。 同時(shí)相對(duì)于普通質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，作用是時(shí)間也比較長(zhǎng)， 可以達(dá)到更理想的敲除效果。