質(zhì)粒提取步驟

1、煮沸法快速提取質(zhì)粒以及DNA酶解和瓊脂糖電泳一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、 掌握質(zhì)粒 DNA 分離，純化的原理 2、 學(xué)習(xí)煮沸法快速提取質(zhì)粒 DNA 的方法 3、 學(xué)習(xí) DNA的限制性酶切的基本技術(shù) 4 、 學(xué)習(xí)利用瓊脂糖電泳測(cè)定 DNA片段的長(zhǎng)度 二、 實(shí)驗(yàn)原理 在基因工程中， DNA 分子的切割是由限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)完成的。限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別特定的 DNA 序列，在一定的條件下切斷雙鏈 DNA 。限制性?xún)?nèi)切酶的作用效率是受多方面因素影響的，如反應(yīng)溫度，緩沖體系，離子種類(lèi)與濃度， DNA 的純度和甲基化程度等。對(duì) DNA 進(jìn)行酶切時(shí)，首先要選擇適合的緩沖液。對(duì)于單酶切，應(yīng)選用該酶的最適緩沖液；對(duì)于雙酶切或

2、三酶切，應(yīng)選用一種能使所有酶都充分作用的緩沖液。 DNA 的純度對(duì)于酶切的效果的影響也很大，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)。酚。氯仿。 SDS 等雜質(zhì)都會(huì)抑制限制性?xún)?nèi)切酶的活性。 瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定和純化 DNA 片段的常規(guī)方法。利用低濃度的熒光嵌入染料 - 溴化乙錠進(jìn)行染色，可確定 DNA 在凝膠中的位置。如有必要，還可以從凝膠中 回收 DNA 條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。長(zhǎng)度 100kb 或更大的 DNA ，可以通過(guò)電場(chǎng)方向呈周期性變化的脈沖電場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行分離。

3、在基因工程的常規(guī)操作中，瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用最為廣泛。它通常采用水平電泳裝置，在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下進(jìn)行電泳。 DNA 分子在凝膠緩沖液（一般為堿性）中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。 DNA 分子遷移的速率受分子大小，構(gòu)象。電場(chǎng)強(qiáng)度和方向，堿基組成，溫度和嵌入染料等因素的影響。 三 實(shí)驗(yàn)材料和試劑： 1 菌種： 含 pUC18 的大腸桿菌 JM107 菌株。 2 化學(xué)試劑和溶液 （1） LB 培養(yǎng)基： NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l 胰蛋白胨 10g/l 氨芐青霉素 50 g/ml （培養(yǎng)基滅菌后加入） pH7.0 （2） 70% 乙醇（ -20 ）及無(wú)水乙醇（ -20 ）

4、（3） STET 緩沖液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris ） （4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨） （5） 1.2M 氯化鈉 （6） TE 緩沖液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ） （7） 電泳緩沖液（ 50XTAE ） Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml 使用時(shí)用蒸餾水稀釋 50 倍。 （8） 樣品緩沖液（ 6X ） 0.25% 溴酚藍(lán)， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖 （9） 溴化乙錠

5、 10mg/ml （10） 瓊脂糖（電泳級(jí)） （11） 限制性?xún)?nèi)切酶 （12） 溶菌酶（ 50mg/ml ，溶于 10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ） 3.儀器設(shè)備: 臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱等。 Eppendorf 離心管， Tip 頭，三角瓶等滅菌備用。 電泳儀，電泳槽，樣品梳，微波爐，水浴鍋，移液器（ 20ul, 200ul 和 1000ul ），離心管， Tips(200ul,1000ul) 。 四 操作步驟： 1.質(zhì)粒提取 （1） 將 2ml 含相應(yīng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基加入到容量為 15ml 的試管中，接種一單菌落，用棉塞封

6、口，在 37 劇烈震蕩（ 250rpm ）培養(yǎng)過(guò)夜。 （2） 將 1.5ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)在 4 條件下離心 30 秒（ 12,000 g ）。 （3） 棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀物懸浮于 200 m l STET 緩沖液，用渦旋混合器充分混勻。 （4） 加入 4 m l 新鮮配制的溶菌酶液，混勻，置室溫下 5min 。 （5） 用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時(shí) 45 秒，取出后立刻離心 10min 。 （6） 用無(wú)菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB ，用混合器混勻后，高速離心 5min ，棄上清

7、液，用濾紙吸干離心管中的液體。 （7） 加入 1.2M 氯化鈉 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混勻后，離心 15min ，棄上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，離心 5min 。棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 緩沖液中， 混合器混勻 。 （9） 即成質(zhì)粒制備液，制備的質(zhì)粒供下一步實(shí)驗(yàn)使用 2.DNA的酶解 設(shè)置 DNA的酶切反應(yīng)，按下列順序加樣（體積： m l ）： 反應(yīng)管 對(duì)照管 置備的質(zhì)粒 DNA 2 2 酶反應(yīng)液（ 10 ）

8、 2 2 雙蒸水 15 16 限制性?xún)?nèi)切酶（ 5U） 1 0 總體積 20 20 加完反應(yīng)液，混勻，離心 1分鐘，置于37 0 C水浴中，反應(yīng)2小時(shí)。加入加樣緩沖液（10 ） 2 m l 3. 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳 1) 量取 100毫升TAE電泳液，加入0.7克瓊脂糖，混勻后，置于微波爐中，加熱 3分鐘，充分溶解瓊脂糖。 注意觀察，當(dāng)心煮沸的液體，溢出！ 2) 用滅菌后的橡皮膠，封閉清潔干燥的電泳板，并用少量的瓊脂糖液封邊。安放梳子，調(diào)整梳子的底部邊緣與電泳板之間的距離，一般以 1-2毫米為宜。 3) 當(dāng)溶解后的瓊脂糖液冷卻至 50 0 C左右時(shí)，加入溴化乙錠5 m l ，溴化乙錠的最終濃

9、度為1.0 m g/ml . 混勻后，將瓊脂糖液倒入電泳板中，靜止，切勿移動(dòng)。 4) 在凝膠完全凝固后（于室溫放置 30-45分鐘），輕輕地取出梳子，除去膠帶，將凝膠放入電泳漕中。 5) 電泳漕中，加入電泳液（ 1 TAE），使電泳液覆蓋在瓊脂糖膠面之上約1-2毫米。 6) 取上一實(shí)驗(yàn)制備的質(zhì)粒提取液（酶切），加入 1/5樣品緩沖液，充分混勻。用移液器將樣品小心地加入點(diǎn)樣孔。在不同的點(diǎn)樣孔中，分別加入DNA分子量標(biāo)記物（ marker ），對(duì)照以及質(zhì)粒提取液（酶切）樣品 7) 接通電源，在 90V下，電泳1小時(shí)，當(dāng)溴酚蘭顏料遷移至凝膠前沿時(shí)，切斷電源。 8) 取出凝膠，在紫外燈下，觀察 DNA的遷移位置，并討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 五、 注意事項(xiàng) : (1) 從細(xì)菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液時(shí)，一定要徹底，不能留有殘余。 (2) 用 70% 的乙醇溶液洗滌核酸沉淀時(shí)一定要十分小心，防止將核酸同洗液一起去掉。 (3) 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的器皿和吸頭等都要進(jìn)行高壓滅菌。 (4) 酶切時(shí)，應(yīng)盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體系減到最小。但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的十分之一，否