QTOF質(zhì)譜材料培訓

1、內(nèi)部資料 經(jīng)驗交流 僅供參考儀器原理介紹電噴霧電離源（ESI）套管的清洗、維護（如果需要可以演示操作）電噴霧電離源是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強的大分子有機化合物，如蛋白質(zhì)、肽、糖等。（對于非極性、揮發(fā)性的待測化合物，則不使用。）電噴霧電離源的最大特點是容易形成多電荷離子。這樣，一個分子量為10000Da的分子若帶有10個電荷，則其質(zhì)荷比只有1000Da，進入了一般質(zhì)譜儀可以分析的范圍之內(nèi)。根據(jù)這一特點，目前采用電噴霧電離，可以測量分子量在300000Da以上的蛋白質(zhì)。（因此由ESI電離源電離的質(zhì)譜儀在測量的分子量范圍上，理論

2、無上限，只需要調(diào)節(jié)條件，讓其帶上更多的電荷即可。）電離源幾個參數(shù)的意義1、 毛細管電壓 （3KV8KV） 控制合適的電壓，以便對于待測化合物有更好的電離度并且在這個條件下不會發(fā)生電化學反應，從而降低待測物質(zhì)的信號。在負離子模式下，由于電壓過高，電離源尖端會出現(xiàn)紫色的尖端放電現(xiàn)象，做樣品測試的時候要盡量避免，防止由于尖端放電，電壓過高使樣品發(fā)生裂解，從而不能得到較高豐度的分子離子峰。同時也會由于電流的產(chǎn)生，損毀離子源內(nèi)的元件。2、 去溶劑溫度（溶劑的最低的氣化溫度到最高的氣化溫度之間） 電離源溫度是溶劑氣化的重要參數(shù)。軟件添加附件之后可以將該參數(shù)設置到350。對于水比較多流動相而言，我們需要調(diào)高

3、電離源的去溶劑溫度以便水能最大程度液化，因為有時候未氣化的水會進入到質(zhì)譜儀器內(nèi)部，對一些閥門造成損壞。（當然，對于水而言，由于表面張力比較高，很難形成電噴霧，所以可以在不影響液相分離的情況下，盡量減少水的含量，避免信號的損失。）3、 錐孔電壓（根據(jù)靈敏度和分辨率進行數(shù)值優(yōu)化）錐孔也可以叫采樣孔，調(diào)節(jié)合適的錐孔電壓可以增強儀器的靈敏度，但是錐孔電壓過高會造成待測化合物的源內(nèi)裂解。造成非二級質(zhì)譜造成的碎片峰的產(chǎn)生，不利于譜圖的解析。4、 去溶劑氣去溶劑氣流量的選擇：經(jīng)驗法選擇去溶劑氣，一般流動相的流速為0.1mL/min時候，選擇100L/h的去溶劑氣流量，0.2 mL/min時選擇200L/h的

4、去溶劑氣流量，依次類推。去溶劑氣的流量必須穩(wěn)定，需將液氮分壓表的分壓控制在0.6左右，否則做出實驗的待測化合物的離子計數(shù)重現(xiàn)性很差。另外，當去溶劑氣流量升到1000L/h的時候，會發(fā)現(xiàn)去溶劑溫度的反饋值保持在300（如果預設為350），屬于正?，F(xiàn)象?？偠灾婋x源的最佳使用效果是要保證從電離源外觀看來，一定要產(chǎn)生錐形電噴霧。從圖譜上看，如果樣品量能保證在mg/mL,質(zhì)譜的響應值能達到103或者104數(shù)量級。如果未達到，分析思路：1、離子模式選擇是否正確。2、離子源、錐孔是否清潔。3、所設的離子源數(shù)值是不是沒有得到相應的反饋值。4、待測樣品是否適合用這種電離源進行電離。5、儀器的靈敏度是不是不

5、夠（在重新進行軟件的附件安裝之前，應該保存ms tune 方法參數(shù)，以防由于參數(shù)設置問題造成靈敏度下降）。四級桿檢測器兩種工作方式：1.全掃描scan：指定的兩個質(zhì)核比間掃描每個離子的豐度。 2.僅檢測被選擇的一個或多個離子的豐度。飛行時間檢測器原理質(zhì)荷比與時間的平方成正比，只要測定出飛行時間，就可換算成質(zhì)荷比。在檢測時，顯然是質(zhì)荷比小的先到達檢測器，質(zhì)荷比大的后到達。在通常情況下，離子的飛行時間為微秒數(shù)量級。飛行時間性能指標：1.分辨率：RP = M / DM （M:為測定的質(zhì)量， DM:半峰高的峰寬） 線性模式，分辨串較低；反射模式，分辨率可高達15000“延遲引出”（DE）技術或稱“脈沖

6、離子引出”（PIE）2.質(zhì)量范圍：目前的商品儀器般可測到幾十萬原子質(zhì)量單位（u）飛行時間在多肽，蛋白質(zhì)，糖，核苷酸有廣泛的應用，能使有機質(zhì)譜測試難得到信號的物質(zhì)得到理想譜圖。MCP檢測器微通道板與電子倍增器的作用類似，都是離子的物理型放大器。與電子倍增器不同的是，MCP有成像功能；但是在TOFMS應用中僅使用了電子倍增功能。在微通道板的每個通道的內(nèi)壁上都涂有一種能發(fā)射次級電子的半導體材料，當給微通道板加了一定電壓后，就會在每個通道中產(chǎn)生一個均勻的電場。這個電場是軸向的。所以能使進入電場的低能電子（光子或電子）與壁碰撞的時候能產(chǎn)生次級電子，并且在軸向電場的作用下次級電子被加速，這樣次級電子碰到壁

7、上又會產(chǎn)生更多的新的次級電子。這樣。對于一個入射粒子。在板的輸出端就會產(chǎn)生很多的電子。實際上我們很容易理解，每個通道就是一個光電倍增管，不過它沒有專門的光陰極，而且打拿極是連續(xù)分布的，另外入射電子不只限于光子，事實上任何載能電子，只要在通道壁上能打出次級電子，它都能響應，與光電倍增管外電路分壓器相比擬，它利用鉛玻璃自身的體電阻作為分壓電阻，一般極間總電阻為10歐，通道中的電勢梯度使次級電子得到加速，獲得能量，從而保證在下一次轟擊通道時有足夠大的二次發(fā)射系數(shù)。微通道板（MCP）是由內(nèi)壁鍍有半導體層的微管規(guī)則排列熔壓而形成的二維陣列，可以將微弱電子圖像或信號均勻放大到10000倍以上。保持端面的清

8、潔，不能用手觸摸。避免碰撞，擠壓造成機械破損。避免真空不高的情況下加高壓，以免引起通道內(nèi)孔放電。防止兩端面間高壓擊穿造成絕緣破壞。防止MCP一次性直接暴露在強粒子束中。二級質(zhì)譜原理在一級的基礎上，確定感興趣的母離子進行碎裂（借助四極桿進行篩選，使用碰撞池進行碰撞碎裂），碎裂機理為碰撞誘導解離。（CID）本實驗選擇在一級質(zhì)譜的基礎上選擇分子量為721的離子進行碰撞，可得到如下的質(zhì)譜圖，見其碎片峰。二級圖譜的碰撞電壓的選擇直接影響圖譜的形成，對數(shù)據(jù)的解析有很大的影響。最佳情況應該保證圖譜中存在5%10%的原母離子和碎片離子，若碰撞電壓設置過高，也會對碎片信息的獲得造成影響，碎片過碎，碎片難以解析。

9、二級質(zhì)譜的應用待測化合物的碎片獲得， 可以通過二級圖譜與已知化合物的二級碎片進行對比，進行待測化合物的確定。半定量的方法多肽測序代謝產(chǎn)物的鑒定新開機后儀器使用、調(diào)諧一：開機1. 打開質(zhì)譜：總按鈕，抽真空與控制電壓按鈕。2. 打開質(zhì)譜液相與電腦的中樞按鈕3. 打開電腦，MassLynx軟件注意：a.如果Mass Tune 界面是灰色的，而且沒有時上時下的峰，則說明電腦與儀器連接不良。 b.如果電腦與儀器長期連接不良，質(zhì)譜控制電壓按鈕一定要處于關閉狀態(tài)，以免質(zhì)譜內(nèi)電壓不受控造成質(zhì)譜燒毀。二：MCP檢測器的老化（老化應在真空24小時后完成，觀察壓力表在10-7兆帕，Vaccum中的表指針應在綠色區(qū)域

10、，避免未達到真空度，MCP雙板電極之間通電短路。避免MCP一次性暴露在強的粒子流中）1. 打開MS Tune 界面，點開Press for operate（變綠）2. 將Flight Tube電壓逐漸升至5630V。（每隔500V一升。）3. Options中點MCP Conditioning：Voltage：start（v）0 Stop（v）2300Time： start（mins）720 Stop（mins）13. 開始之后12小時Flight Tube中的MCP Detector為2300v5.關閉質(zhì)譜：將Voltage以200v為間隔降到0v，關閉Press for operate（變

11、紅）6.MCP電壓最高值是工程師調(diào)諧的，若實驗過程中發(fā)現(xiàn)精密度不高，也避免調(diào)MCP的電壓，以免對MCP造成損耗。三：質(zhì)譜校正校正溶液的選擇注意事項：選擇能夠產(chǎn)生離子簇的物質(zhì)，一般校正溶液的選擇與平時所測的物質(zhì)的分子量范圍有關。1.校正溶液異丙醇甲酸鈉的配制（本實驗室常用校正液）基本比例：以10ml異丙醇甲酸鈉為例A.9ml超純水放入容量瓶中，用甲酸標定，即得10%甲酸溶液。B.將0.5ml0.1mol/L氫氧化鈉溶液與0.5ml甲酸水溶液加入10ml容量瓶中C.將體積比為9:1的異丙醇加入到“2”中的容量瓶中標定，即得甲酸鈉溶液。注意：有機相，水相分別過膜。2. 打開質(zhì)譜1、 Press fo

12、r operate打開，點開兩個氣閥。2、 ES+ Source：capillary調(diào)成3350v（負離子模式為2600v，毛細管電壓可以根據(jù)不同化合物的性質(zhì)做出調(diào)節(jié)，總體范圍在2kv8kv之間） desolvation temperature 調(diào)到300(如果安裝附件可以到達350)3、 Time of Flight：Flight Tube以500v為間隔升到5630v MCP Detector以200v為間隔升到2300v。開啟質(zhì)量校正頁面后，質(zhì)量校正前請先確定目前儀器處于未校正的狀態(tài)，可以將flie文件中的UncalNo Calibration。3. 連接校正液與質(zhì)譜，打開校正液流速，待

13、質(zhì)譜有信號后按”Acquire”收集信號4. 一段時間后（3min左右）將質(zhì)譜方法停止，觀察spectrum,確定下分子量，在MS Tune中的Calibration中查詢標準物的準確分子量注意：由于經(jīng)常做的是天然產(chǎn)物，其分子量在400-500之間，所以要校正400-500之間的數(shù)值。（按m/z的需求對分子量進行選擇，若待測化合物的分子量在700左右，則選擇700左右的分子量進行校正。）5. 計算Leff值，將計算后的Leff值輸入到Option里的TDC setting中，之后再進行3-4操作，直到采集到的分子量與查表得到的分子量小數(shù)點后3位一致即可。6. 保存：A. 到spectrum中找

14、到processcentreareasTofokokfilesaveB. MS Tune中CalibrationFrom Files找剛存的文件名稱點“history”（acru mass）點最近那個時間ok RMS residual圖中的點若偏移太大則刪去。(校正后保證質(zhì)量偏差在10個10ppm)C. 再回到MS Tune calibrationfilesave as四、儀器靈敏度的調(diào)節(jié)一般情況下，每一種待測化合物都有最適合自己的電離條件，對于質(zhì)譜條件的優(yōu)化選用標準品進行，但是從科研角度而言，這樣的工作一般做的比較少的，除非是基于篩查的目的。進過標準品試液之后，通過調(diào)節(jié)毛細管電壓、電離源溫度

15、、去溶劑溫度、去溶劑氣、電離源與錐孔距離的調(diào)節(jié)可以對儀器靈敏度進行優(yōu)化。事實上，每一種化合物都有最佳的質(zhì)譜條件，普適的靈敏度調(diào)節(jié)可以用接近儀器最常使用的分子量范圍的校正液進行。五、儀器的分辨率的調(diào)節(jié)完成儀器的靈敏的調(diào)節(jié)之后可以對儀器的分辨率進行調(diào)節(jié)，本臺質(zhì)譜儀的分辨率為5000左右，相對于單四級桿的2002000的分辨率而言屬于高分辨質(zhì)譜儀，并且分辨率主要由于飛行時間管提供。但是相對于市場上高達50000分辨率的質(zhì)譜而言，分辨率就比較低了。單峰法，R=M/半峰寬，調(diào)節(jié)offset（微調(diào)）、毛細管電壓、錐孔電壓、MCP檢測器電壓等參數(shù)，但是比較繁瑣，建議由專業(yè)工程師進行調(diào)節(jié)。并且MCP檢測器電壓

16、的調(diào)節(jié)對其使用壽命影響較大，應該在專業(yè)工程師的引導下完成。實際樣品的上機測試樣品前處理1. 選用試劑將樣品溶解，難溶解的物質(zhì)可超聲處理。濃度不低于1mg/ml。溶液可以在電離源發(fā)生氣化，被真空系統(tǒng)抽走。所以應該選擇揮發(fā)性鹽溶液作為流動相，另外使用酸堿時，應盡量避免使用三氟乙酸，以防其抑制樣品信號。2. 溶解后的樣品需要過膜處理（但對于在膜上有吸附的化合物，應選用其他方法。）3. 若樣品經(jīng)過高速離心，即30000rpm，樣品溶液可以不過膜。流動相選擇1. 直接進樣的方式：樣品溶劑多選用甲醇，乙腈，異丙醇，乙醇和水等揮發(fā)性溶劑，為了使樣品在溶液中離子化，通常使用揮發(fā)性的酸或堿如乙酸，氨水等調(diào)節(jié)溶液

17、的pH。一般流動相要與樣品溶解的試劑保持一致。2. 常用的溶劑和緩沖液 a 水、乙腈及甲醇 LC-MS理想的溶劑 b 乙酸和甲酸 可降低LC流動相的pH值以提高分離度 c 氫氧化銨/氨溶液 可提高LC流動相的pH值 d 乙酸銨 是一種揮發(fā)性鹽，用于緩沖流動相，并改善色譜分離而不影響MS的性能。最大濃度不超過0.1mol/L。（盡量控制鹽溶液濃度，以防鹽析出堵塞毛細管）離子模式的選擇1.正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH3-4）或甲酸（pH2-3）對樣品加以酸化。2.負離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。（10mmol/L50mmol/L）3.有些酸堿性并不明確的化合物

18、，可優(yōu)先選用ESI（+）進行測定。元素組成分析高分辨質(zhì)譜應用元素分析（有l(wèi)ockspray的情況下）1.將液質(zhì)正常連好，在option中的Lock Spray勾上，在MS Method中Reference Scan中將voltage調(diào)成20v，frequency（sec）調(diào)成52.將標準溶液接入lock spray接口處，進行試驗。校正液的信號要低于待測物質(zhì)的信號。3.實驗完畢后，打開Chromatogram中TIC的BPI;將MS Tune的ProcesscenterTOFLock Mass，將標準的分子量輸入其中。注意：1.這里的Lock Mass是鎖定的分子量，不鎖定為02.先看Lock

19、 Spray中的哪一個峰離標準分子量最近，再在MS Tune中的Calibration中查詢標準物的準確分子量，將目標分子量輸入到Lock Mass中。4.再在ToolsElemental composition雙擊目標分子量OK。即得到目標分子的元素組成。5.無LockSpray的情況下，采用內(nèi)標法進行分析，操作見1-4.圖譜的解析拿到一張總離子流圖：首先看右上角TIC下面的數(shù)值，如果達到e4表明電離程度較好。但是并不用刻意追求這個數(shù)值，只要能檢出我們需要的峰，這個數(shù)值就不是問題。但是如果沒有，則需要考慮電離條件的問題。發(fā)現(xiàn)背景比較高 信號不是很明顯點擊“display”到“TIC”勾上 B

20、PI chromatogram 單擊“OK” 如下圖即可得到BPI圖譜我們可以發(fā)現(xiàn) 信號高的地方得到了放大 信號低的地方依舊沒有改變?nèi)绻胫v圖譜變得更加“好看（信噪比變大）”，需將baseline%改為5%。點擊“OK”我們可以發(fā)現(xiàn)基線變得更低了。對比一下“BPI”的數(shù)據(jù)處理工具可以幫助我們找到更多的信號峰，避免由于分離度不夠造成的峰識別困難。針對本總離子流圖的解讀對5.71分鐘的峰進行積分 得到其質(zhì)譜圖在100400m/z范圍內(nèi) 有很多峰 不能確定是否由于分離不好造成于是點擊chromatogram里面的progress下面的combine spectrum窗口將需要的峰右鍵選在Averag

21、e條框內(nèi)，將不需要的背景峰選在下面subtract條框內(nèi)。即可得到扣除背景之后的峰。質(zhì)譜圖變得干凈很多 但是仍有少量小分子量化合物 推測可能為樣品內(nèi)化合物或者樣品分子發(fā)生源內(nèi)裂解的產(chǎn)物。繼續(xù)觀察出現(xiàn)的453.2、464.7、904.8、926.8這幾個化合物之間是什么關系呢？這些化合物其實是同一化合物。因為453和904之間其實是M+1峰、2M+1峰的關系、2M+Na峰。（由于玻璃儀器、自然界中都含有豐富的NaK元素，所以常會形成加鈉或者加鉀峰，屬于正?，F(xiàn)象。）多電荷的判斷放大904的峰 可見其同位素峰分子量之間相差1 即帶1個電荷。如果分子量之間差0.5，則帶兩個電荷，差0.1則帶10個電荷。此為經(jīng)驗公式。日常維護及使用1.若質(zhì)譜中有100的分子量信號（若100為無關的雜質(zhì)峰）很強降不下去，可以在Acquire時將其中的masses的值改成105，避免分子量為100的峰。2.若質(zhì)譜中有雜質(zhì)用液相沖不下來，則可以將離子源拆下來清洗：A將離子源拆下來用分別蘸過甲醇與水的棉簽反復擦洗。B清洗錐孔，針管：將錐孔拆下來分別用超純水，甲醇，超純水各超聲15min。C安裝離子源，安裝完畢觀察軟件中的電壓與溫度是否能升上去，如果升不上去，重新安裝。3. 質(zhì)譜離子源電壓升到3350v，但顯示為3350*2v，可以將離子源拆下來重裝上去。4. 從TI