大腸桿菌檢測(cè)方法

1、大腸菌群及檢驗(yàn)一、大腸菌群介紹大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè) 或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希 氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界廣泛存在。 調(diào)查研究表明，大 腸菌群細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)?；顒?dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地 方，人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)

2、境中則以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的， 主要是以該菌群的檢出情況來表 示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了 對(duì)人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸 道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致 病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測(cè)該 食品中存在著腸道致病菌污染的可能性， 潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須 看作對(duì)人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性。大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一， 目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于 食品衛(wèi)生工作中。二、大腸菌群檢驗(yàn)方法

3、：由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧、在37C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸 菌群的檢測(cè)一般都是按照它的定義進(jìn)行。目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測(cè)方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商 檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測(cè)程序上略有不同。(一)國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培 養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽 鹽發(fā)酵管。36C培養(yǎng)48i2h,觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36 1 T培養(yǎng)18-24h,觀察菌落形態(tài)。證實(shí)試驗(yàn)：挑取平

4、板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā) 酵管36C培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查 MPN表，報(bào)告每100ml (g)大 腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789.3-94中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢 驗(yàn)大腸菌群測(cè)定(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。本方法采用兩步法：推測(cè)試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36 培養(yǎng)48吃h，觀察是否產(chǎn)氣。證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB )肉湯管中，36C 培養(yǎng)482h,觀察是否產(chǎn)氣。以B

5、GLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報(bào)告每ml(g) 樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食 品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法三、說明：1. MPN檢索表：MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連 續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用 概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng) 降低或增加10倍。注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附 MPN表所用稀釋度是不同 的，而且結(jié)果報(bào)告單位也不相同。2. 初發(fā)

6、酵和證實(shí)試驗(yàn):無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法， 都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行 了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸 菌群的定義，即 在37C分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成 為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相 差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。3. 產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡 （有時(shí)比 小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。 實(shí) 驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全

7、部充滿氣體， 少者可以產(chǎn)生 比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)， 可以用手輕 輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試 驗(yàn)。4. 挑選菌落：國家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對(duì)初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離， 對(duì)典型和可 疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群 菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密 切相關(guān)。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基， 在該平板上，大腸菌群 菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系， 只挑取一個(gè)菌落，由于 機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑 取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。5. 抑菌劑：大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍 膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌， 特別是革蘭氏陽性菌的生 長。國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯