實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)

1、最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)的提取及檢測(cè)最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）n是染色體外小型（是染色體外小型（1-2001-200kbkb）的共價(jià)、閉合、的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），），能自主復(fù)制能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 n常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等酶、修飾酶等 n質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（質(zhì)

2、粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1 1 n n個(gè)個(gè)）松弛型復(fù)制（松弛型復(fù)制（2020個(gè)以上）個(gè)以上） 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體n是通過(guò)是通過(guò)DNADNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19pUC18, pUC19最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒提取的思路n質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNADNAn要去除的物質(zhì)：要去除的物質(zhì)：n蛋白蛋白n基因組基因組DNADNAn脂類及小分子雜質(zhì)脂類及小分子雜質(zhì)nRNA RNA 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)第一部分質(zhì)粒第一部分質(zhì)粒DN

3、A的提取的提取最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)一目的一目的n了解提取質(zhì)粒的原理。了解提取質(zhì)粒的原理。n學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。n細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增n菌體的收集裂解及質(zhì)粒菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離的分離n質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的純化的純化最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)二原理二原理n堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：拓?fù)鋵W(xué)上的差異：n在在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，

4、而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；仍為自然狀態(tài)；n將將pH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污和蛋白質(zhì)在去污劑劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒粒DNA（可省略）（可省略）。最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)

5、粒DNA的提取及檢測(cè)原理示意圖原理示意圖 返回目錄 返回原理最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一）儀器：恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（一）儀器：恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含（二）材料：含pUC18pUC18（或其他）質(zhì)粒的大腸桿菌、（或其他）質(zhì)粒的大腸桿菌、（三）試劑：（三）試劑： LBLB培養(yǎng)基（液體、固體）培養(yǎng)基（液體、固體）溶液溶液I I溶液溶液IIII溶液溶液IIIIIITE(pH8.0)TE(pH8.0)最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)溶液溶液 In50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖/1mg/mL溶菌酶溶菌酶n

6、25 mmol/L TrisCl (pH8.0)n10 mmol/L EDTA (pH8.0)n在在10 lbf/in2(6.895104Pa)高壓下蒸汽滅菌高壓下蒸汽滅菌15分鐘，分鐘，保存于保存于4。 n作用：裂解細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活作用：裂解細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)溶液溶液 IIn0.2 mol/ L NaOH(從從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋貯存液中現(xiàn)用稀釋)n1% SDSn作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)溶液溶液 IIIn5mol/L

7、 乙酸鉀乙酸鉀60mln冰乙酸冰乙酸11.5mln水水28.5mln所配成的溶液中鉀的濃度為所配成的溶液中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為，乙酸根的濃度為5mol/L。n作用：酸性條件下質(zhì)粒作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白復(fù)性，變性蛋白-SDS線線性性DNA沉淀，沉淀，K可中和可中和DNA最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)TE(pH8.0)n10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)nRNA酶（降解酶（降解RNA）n作用：穩(wěn)定作用：穩(wěn)定最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡(jiǎn)便、快捷特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡(jiǎn)便、快捷

8、應(yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克?。ù痔幔?yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克?。ù痔幔?測(cè)序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）測(cè)序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）質(zhì)粒提取試劑盒質(zhì)粒提取試劑盒常用方法：小量堿裂解法常用方法：小量堿裂解法滿足不同需要的試劑盒滿足不同需要的試劑盒純化原理：離子交換柱層析等純化原理：離子交換柱層析等小量制備質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒kit大量制備質(zhì)粒大量制備質(zhì)粒kit去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒kit可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟接含接含pUC18(pUC18(或或pET21a)pET21a)質(zhì)粒的單菌落于質(zhì)粒的單菌落于3 3ml LB Ampml LB Amp

9、+ +液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基中37370 0C C，190rpm190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜振蕩培養(yǎng)過(guò)夜取取1.5 ml菌液入菌液入1.5ml的離心管中的離心管中 60006000rpmrpm、離心離心2 2minmin，棄上清，收集菌體棄上清，收集菌體100100uLuL溶液溶液I I懸浮菌體（懸浮菌體（充分振蕩充分振蕩），室溫），室溫1010minmin加入加入200200uLuL溶液溶液IIII（輕輕混勻輕輕混勻），冰上靜置），冰上靜置5 5minmin裂解菌體裂解菌體最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)加入加入150150uLuL溶液溶液IIIIII（輕輕混勻輕輕混勻），冰上靜置），冰上靜置

10、1515minmin質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA復(fù)性復(fù)性1200012000rpmrpm，離心離心1515minmin，取上清取上清記錄體積記錄體積到一新管到一新管上清加等體積的酚：氯仿（上清加等體積的酚：氯仿（振蕩混勻振蕩混勻）1200012000rpmrpm，離心離心1515minmin，取上清記錄體積到一新管取上清記錄體積到一新管最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)上清加上清加2 2倍體積的無(wú)水乙醇（倍體積的無(wú)水乙醇（充分混勻充分混勻），冰浴），冰浴 30min 30min1200012000rpmrpm，離心離心1515minmin沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1 1mLmL洗滌兩次（洗滌兩次

11、（輕彈混勻、離心輕彈混勻、離心）1200012000rpmrpm，離心離心1010minmin晾干沉淀晾干沉淀沉淀用沉淀用2020ul TEul TE溶解溶解沉淀法沉淀法最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)吸附管用吸附管用BL 500ulBL 500ul平衡平衡取上清加入吸附管取上清加入吸附管5000rpm 5000rpm 離心離心5min5min加加PWPW漂洗液漂洗液500ul500ul，放置，放置2min2min10000rpm 10000rpm 離心離心5min5min，晾干，晾干加加3 30 0ul TEul TE，10000rpm 10000rpm 離心離心5min5min（收集到干

12、凈的（收集到干凈的EPEP管中）管中）吸附法吸附法最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)第二部分瓊脂糖凝膠電泳第二部分瓊脂糖凝膠電泳最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)相關(guān)知識(shí)相關(guān)知識(shí)n電泳：泳動(dòng)速度決定于？電泳：泳動(dòng)速度決定于？ n瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠天然瓊脂（天然瓊脂（AgarAgar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose Agarose ，約占約占8080）及瓊脂膠（）及瓊脂膠（AgaropectinAgaropectin）組組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸

13、性不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)瓊脂糖凝膠濃度與線性瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍分辨范圍 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝

14、膠電泳分離的關(guān)系 n不同構(gòu)型不同構(gòu)型DNADNA的移動(dòng)速度依次為：共價(jià)閉環(huán)超的移動(dòng)速度依次為：共價(jià)閉環(huán)超螺旋螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直線直線DNADNA（LDNALDNA，2 2條鏈條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNADNA（ocDNAocDNA，1 1條鏈發(fā)生斷裂）條鏈發(fā)生斷裂）。 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)影響遷移率的因素影響遷移率的因素nDNADNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNADNA的構(gòu)的構(gòu)象、所加電壓（一般象、所加電壓（一般5 5V/cmV/cm）、電場(chǎng)方向、嵌電場(chǎng)方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的

15、組成等。入染料的存在、電泳緩沖液的組成等。最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNADNA的方法和技術(shù)。的方法和技術(shù)。最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 nDNADNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。n核酸為兩性分子，在核酸為兩性分子，在pH3.5pH3.5時(shí)，整個(gè)分子帶正電時(shí)，整個(gè)分子帶正電, ,pH8pH8左右左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。 n在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈在堿

16、性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNADNA幾乎具有等量的幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。具有不同的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的相對(duì)分子質(zhì)量的DNADNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNADNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。可以近似用于估算分子的大小。n可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNADNA分子。分子。共價(jià)閉環(huán)超螺旋共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNADNA（cccDNAcccD

17、NA）直線直線DNADNA（LDNALDNA，2 2條鏈條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNADNA（ocDNAocDNA，1 1條鏈發(fā)生斷條鏈發(fā)生斷裂）。裂）。 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的3種形式泳動(dòng)速度種形式泳動(dòng)速度:超螺旋超螺旋線性線性開環(huán)開環(huán) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的存在形式有的存在形式有3種種:1、共價(jià)閉環(huán)共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、開環(huán)開環(huán)DNA:質(zhì)粒質(zhì)粒DNA兩條鏈兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力力,形成松弛的

18、環(huán)狀分子形成松弛的環(huán)狀分子 3、線性線性DNA:因質(zhì)粒因質(zhì)粒DNA的兩的兩條鏈在同一處斷裂而造成條鏈在同一處斷裂而造成.開環(huán)開環(huán)超螺旋超螺旋線性線性最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)三、儀器、材料與試劑儀器、材料與試劑 n（一）儀器：穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（一）儀器：穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀n（二）材料（二）材料1.1.自已提取的質(zhì)粒自已提取的質(zhì)粒DNADNA2.2.相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（三）試劑（三）試劑 1 15 5TBETBE儲(chǔ)液儲(chǔ)液(pH8.0)(pH8.0)使用時(shí)稀釋使用時(shí)稀釋 10 10倍，成倍，成1 1TBETBE。 2 2凝膠加樣緩沖液（凝膠加樣緩沖液（loading buffe

19、r） 3. 3. 1% 1% 瓊脂糖瓊脂糖 4. 10 4. 10mg/mlmg/ml溴化乙錠溶液（溴化乙錠溶液（EBEB），），44保存。用時(shí)稀釋成保存。用時(shí)稀釋成 5 5ug/mlug/ml的的EBEB。 最新實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)四操作步驟四操作步驟n瓊脂糖（瓊脂糖（1%）凝膠電泳）凝膠電泳n稱取一定量瓊脂糖凝膠，按稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中中100ml的量加入電泳緩沖的量加入電泳緩沖液，微波爐中加熱約液，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；，使瓊脂糖溶解；n溶液冷至溶液冷至60 ，加入，加入 EB至終濃度為至終濃度為0.5g/ml，混勻，注，混勻，注意戴手套操作；意戴手套

20、操作；n將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為0.3-0.5cm，迅，迅速插上梳子，檢查有無(wú)氣泡；速插上梳子，檢查有無(wú)氣泡；n待凝膠完全凝固后（約待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入電泳板置于電泳槽中，加入電泳buffer，讓液面高出膠面，讓液面高出膠面1mm；n在在DNA樣品（樣品（20ul）中加入）中加入6 loading buffer（4ul），），混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓100V ；n根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳;n在紫外燈下凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。在紫外燈下凝膠成像儀上觀察