分子生物學(xué)載體PPT課件

1、12 在基因工程操作中，把能攜帶外源在基因工程操作中，把能攜帶外源dna進入受進入受體細胞的體細胞的dna分子叫載體。分子叫載體。載體是載體是dna雙鏈分子。雙鏈分子。載體載體dna分子中是有一段生長擴增的非必需區(qū)，分子中是有一段生長擴增的非必需區(qū)，該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的dna，并可轉(zhuǎn)入，并可轉(zhuǎn)入宿主細胞中，使外源宿主細胞中，使外源dna與載體與載體dna共同擴增共同擴增。3載體的功能載體的功能4理想載體至少必備的條件理想載體至少必備的條件 能在宿主細胞中自主復(fù)制能在宿主細胞中自主復(fù)制 容易進入宿主細胞容易進入宿主細胞 容易插入外來核酸片段容易插入外來核酸片段

2、 容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作 具有合適的篩選標(biāo)記具有合適的篩選標(biāo)記 具有針對受體細胞的親緣性或親和性具有針對受體細胞的親緣性或親和性 （可轉(zhuǎn)移性）（可轉(zhuǎn)移性）5目前的主要載體目前的主要載體 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 單鏈單鏈dna噬菌體噬菌體m13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動物病毒（動物病毒（virus） 細菌人工染色體細菌人工染色體(bac) 酵母人工染色體酵母人工染色體(yac) 678并能被穩(wěn)定遺并能被穩(wěn)定遺 傳的一類傳的一類9質(zhì)粒質(zhì)粒dna的空間構(gòu)型的空間構(gòu)型 sc構(gòu)型構(gòu)型:兩條核苷酸鏈均保

3、持著完整的環(huán)形兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形 結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，dna呈現(xiàn)超螺旋。呈現(xiàn)超螺旋。 oc構(gòu)型構(gòu)型:兩條鏈中只有一條保持著完整的環(huán)兩條鏈中只有一條保持著完整的環(huán) 形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)缺口，稱之形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)缺口，稱之 為開環(huán)為開環(huán)dna。 l 構(gòu)型構(gòu)型: dna雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分 子。子。10111.1 質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性 攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori），它能獨），它能獨立于宿主細胞的染色體立于宿主細胞的染色體dna而自主復(fù)制。而自主復(fù)制。 質(zhì)粒能利用寄主細胞的質(zhì)粒能利用寄主細胞的dna復(fù)制系統(tǒng)進行復(fù)制

4、系統(tǒng)進行自主復(fù)制。自主復(fù)制。12，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性不相容性含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒。含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： cole1、pmb1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 psc101、f、rp4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15a及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性13質(zhì)粒的不相容性分子機制質(zhì)粒的不相容性分子機制14質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性質(zhì)粒的生物學(xué)基本特

5、性157. 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒dnadna上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性：重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)抗性：重金屬離子、毒性陰離子、有機物 物質(zhì)合成：抗生素、細菌毒素、有機堿等。物質(zhì)合成：抗生素、細菌毒素、有機堿等。這些標(biāo)記基因?qū)@些標(biāo)記基因?qū)nadna重組分子的篩選具有重要意義。重組分子的篩選具有重要意義。質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性16 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾焊锾m氏陰性菌

6、的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾耗茉谔烊粭l件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如一個細胞（接合作用），如f、col、r質(zhì)粒等質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（cole1）在接合型質(zhì)粒）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生dna轉(zhuǎn)移，這個過程由轉(zhuǎn)移，這個過程由bom 和和mob 基因決定?；驔Q定。17嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，1

7、 - 3 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，18 用小寫字母用小寫字母p代表質(zhì)粒，在代表質(zhì)粒，在p字母后面用兩字母后面用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)崅€大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q。后面的數(shù)字是構(gòu)建質(zhì)粒的編號。驗室名稱。后面的數(shù)字是構(gòu)建質(zhì)粒的編號。 如：如：puc18和和pbr322。1920加入合適的選擇標(biāo)記基因，通常是抗生素基因。加入合適的選擇標(biāo)記基因，通常是抗生素基因。增加或減少合適的酶切位點，便于重組。增加或減少合適的酶切位點，便于重組?？s短長度，切去不必要的片段，增加裝載量?？s短長度，切去不必要的

8、片段，增加裝載量。改變復(fù)制子，由嚴(yán)緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。改變復(fù)制子，由嚴(yán)緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。加裝特殊的基因元件。加裝特殊的基因元件。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：質(zhì)粒構(gòu)建的：psc101 8.8 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 tcrcole1 6.5 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 e1rsf2124 cole1衍生質(zhì)粒衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 apr21222324 測序質(zhì)粒測序質(zhì)粒 含

9、有測序通用引物互補序列和含有測序通用引物互補序列和多酶接頭多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因及整合特異裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因的整合。序列，便于外源基因的整合。 穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因能在兩種不同的受體細胞中子，便于基因能在兩種不同的受體細胞中復(fù)制。復(fù)制。 探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟?。篩選克隆或?qū)ふ一蛟?5如何閱讀質(zhì)粒圖譜如何閱讀質(zhì)粒圖譜 1.1.首先看首先看oriori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/ /真真核核/ /穿梭質(zhì)粒）穿梭質(zhì)粒）

10、 2.2.再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。記。（1 1）ampampr r 水解水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2 2）tettetr r 可以阻止四環(huán)素進入細胞。可以阻止四環(huán)素進入細胞。（3 3）camcamr r 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪陕让顾亓u乙?；苌铮怪?去毒性。去毒性。（4 4）neoneor r（kankanr r） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使g418g418 （卡那霉素衍生物）失活（卡那霉素衍生物）失活（5 5）hyghygr r 使潮霉素使潮霉素失活。失活。26如何閱

11、讀質(zhì)粒圖譜如何閱讀質(zhì)粒圖譜 3.3.看多克隆位點（看多克隆位點（mcsmcs）。它具有多個限制酶的單）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。何放置目的基因。 4.4.再看外源再看外源dnadna插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于小于10kb10kb的外源的外源dnadna片段。一般來說，外源片段。一般來說，外源dna

12、dna片片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。27如何閱讀質(zhì)粒圖譜如何閱讀質(zhì)粒圖譜 5.5.是否含有表達系統(tǒng)元件，即是否含有表達系統(tǒng)元件，即 啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號。錄終止信號。 這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。282.8kb。 29303132333435363738394041噬菌體是一類，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。4243444546474849寄主：大腸桿菌。寄

13、主：大腸桿菌。 dna長度：長度：6407 bp。 外型外型: 絲狀絲狀組成組成: 由外殼包裝蛋白和正鏈由外殼包裝蛋白和正鏈dna組成組成基因基因: 至少有至少有10個基因個基因m13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長5051rf dna:replicational form dna優(yōu)點：優(yōu)點：52 rf-dna(復(fù)制型dna) +dna轉(zhuǎn)譯與包裝相關(guān)的蛋白質(zhì) rfdna達到200個拷貝時, +dna被單鏈特異的dna結(jié)合蛋 白結(jié)合,阻斷-dna的復(fù)制只能以-dna為模板復(fù)制新的+dna 新的+dna立即被積累在細胞內(nèi)的殼蛋白包裝成新的噬菌體 顆粒,不斷被擠

14、出宿主細胞53m13 dna載體的構(gòu)建： 包裝極限可達包裝極限可達m13 dna本身長度的本身長度的7倍倍54 55 噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu) 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體 噬菌體由外殼包裝蛋白和-dna組成 -dna為線狀雙鏈dna分子，全長48502個核苷酸，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈，稱為cos區(qū)。 -dna-dna上至少有61個基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責(zé)裂解宿主細胞，dna自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負責(zé)與宿主染色體dna遺傳重組整合的基因。56575859606162 野生型野生型-dna包裝的上限為包裝的上限為51kb，本身長度

15、為，本身長度為48.5kb，只，只有當(dāng)插入的外源有當(dāng)插入的外源dna片段不大于片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-dna的長度，可以提高的長度，可以提高裝載量。野生型裝載量。野生型-dna上約有上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。非必需的。構(gòu)建原理：刪除構(gòu)建原理：刪除 噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。 在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點 引進某些突變表型，作為選擇標(biāo)記引進某些突變表型，作為選擇標(biāo)記 突變某些基因，使它

16、成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體 刪除刪除 dna必須區(qū)段上常用的限制酶切點必須區(qū)段上常用的限制酶切點 噬菌體噬菌體 dna上本身有上本身有5個個 ecor i 和和7 個個hind iii切點！切點！根據(jù)切除的多少，可將根據(jù)切除的多少，可將-dna分成兩大類載體：分成兩大類載體： 插入型載體插入型載體 取代型載體取代型載體63插入型載體長度插入型載體長度36.4kb插入片斷長度：插入片斷長度：0-14.5kb（36.4-51.9kb64656667替換型替換型-dna載體長度載體長度26kb插入片斷長度：插入片斷長度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb6869 -dna

17、重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分： 一部分缺少e組份，另一部分則缺少d組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-dna分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組-dna污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的。70 71體外包裝存在的問題體外包裝存在的問題 包裝錯誤：既能包裝內(nèi)源性原包裝錯誤：既能包裝內(nèi)源性原 dna，也能包裝重組的，也能包裝重組的 dna載體。載體。 重組：外源的重組重組：外源的重組 dn

18、a載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原 dna 發(fā)生重組。發(fā)生重組。 體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75% 105% （3651kb）之間，即既不能超過正常野生型）之間，即既不能超過正常野生型 容量的容量的105%；又不能低于正常野生型容量的；又不能低于正常野生型容量的75%。 注：注：野生型野生型 dna的必須區(qū)是的必須區(qū)是28kb，所以，所以 載體的載體的最大最大 克隆容量是克隆容量是23kb。（一般為。（一般為15kb）。）。72以以 噬菌體為載體噬菌體為載體進行進行dna克隆克隆 dna用限制性內(nèi)切酶用限制性內(nèi)切酶除去中間一段除

19、去中間一段與外源與外源dna連接連接重組載體的體外包裝重組載體的體外包裝帶有外源帶有外源dna的的 噬菌體噬菌體太小不能被包裝太小不能被包裝頭部前體頭部前體多聯(lián)體多聯(lián)體dnaa蛋白蛋白coscoscos成熟的顆粒成熟的顆粒在宿主細胞內(nèi)進行在宿主細胞內(nèi)進行dna的裝配過程的裝配過程732.4.6-dna及其重組分子的分離純化及其重組分子的分離純化 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入噬菌體或重組噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒密度已達1013 -1014/l，大腸桿菌細胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放-d

20、na 乙醇或異丙醇沉淀-dna742.4.7-dna載體的優(yōu)點載體的優(yōu)點 -dna可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 -dna載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量 重組-dna分子的篩選較為方便 重組-dna分子的提取較為簡便 -dna載體適合克隆和擴增外源dna片段，常用于構(gòu)建基因文庫，但不適合表達外源基因75 8裝載范圍為裝載范圍為31 - 45kb 多用于基因文庫構(gòu)建多用于基因文庫構(gòu)建76cos:cohesive-end site特點：特點：7778考斯質(zhì)粒的構(gòu)建考斯質(zhì)粒的構(gòu)建 由于-dna包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順序cos區(qū)。將這段dna與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建

21、的重組質(zhì)粒，可裝載外源dna（45.5kb)，它仍可象-dna一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進入細胞后，要通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進行復(fù)制。7980 人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多單個基因也相當(dāng)大（如：單個基因也相當(dāng)大（如：dmd gene dmd gene 2300kb2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因載，克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體：體。如近年來構(gòu)建的一些載體：bacbac，pipi，yacyac等。等。人造染色體載體人造染色體載體81 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可

22、構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源dna克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： 細菌人造染色體（細菌人造染色體（bac） 酵母人造染色體（酵母人造染色體（yac）人造染色體載體人造染色體載體82 優(yōu)點：能攜帶大片段優(yōu)點：能攜帶大片段dnadna，約約300kb300kb。 在每個細胞中，一個載在每個細胞中，一個載體分子能繁殖多個拷貝，體分子能繁殖多個拷貝，高產(chǎn)高產(chǎn)dnadna。 缺點：會出現(xiàn)插入片段在缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆隆dnadna部分的缺失或重排。部分的

23、缺失或重排。為克服上述缺點，人們采為克服上述缺點，人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，如，如，e colie coli中的中的f f因子。因子。此質(zhì)粒含有此質(zhì)粒含有2 2種基因種基因（part a, part bpart a, part b）。）。每個每個e colie coli能接受能接受 300kbdna300kbdna片段。片段。細菌人造染色體細菌人造染色體（bacterial artificial chromosomes bac）83細菌人造染色體細菌人造染色體（bacterial artificial chromosomes bac） 細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子ff質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間 各種類型的pbacs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pbacs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動植物基因文庫84酵母人造染色體酵母人造染色體（yeast artificial chromosomes yac）yac載體應(yīng)含有下列元件載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子大腸桿菌的選擇標(biāo)記yac載體的裝載量為350- 400 kb85酵母人工染色體（酵母人工染色體（yacyac） 適用于克隆大片段適用于