細(xì)胞培養(yǎng)課件

1、1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史1885年年 Wilhelm Roux 將雞胚髓板在溫?zé)岬柠}水中維持存活將雞胚髓板在溫?zé)岬柠}水中維持存活 若干天，是有記錄的第一個(gè)體外移植成功的例子。若干天，是有記錄的第一個(gè)體外移植成功的例子。1887年年 Amold 把榿木的木髓碎片接種到蛙皮下，當(dāng)白細(xì)胞侵入把榿木的木髓碎片接種到蛙皮下，當(dāng)白細(xì)胞侵入 到木髓碎片后，他將這些白細(xì)胞收集到盛有鹽水的小碟到木髓碎片后，他將這些白細(xì)胞收集到盛有鹽水的小碟 中，接下來觀察到這些白細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)，并存活一個(gè)短的時(shí)中，接下來觀察到這些白細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)，并存活一個(gè)短的時(shí) 間。間。1902年年 哈泊蘭德哈泊蘭德 預(yù)言植物細(xì)胞

2、的全能性預(yù)言植物細(xì)胞的全能性1903年年 Jolly 將蠑螈的白細(xì)胞保存在懸滴中并維持了將蠑螈的白細(xì)胞保存在懸滴中并維持了1個(gè)月。個(gè)月。1906年年 Beebe&Ewing 在動(dòng)物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染狗淋巴肉在動(dòng)物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染狗淋巴肉 瘤病毒的細(xì)胞。瘤病毒的細(xì)胞。2細(xì)胞培養(yǎng)19071907年年 Ross Harrison Ross Harrison （美國）（美國）將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這些組織在體外不但存活若干周，而且居然從細(xì)胞中這些組織在體外不但存活若干周，而且居然從細(xì)胞中長出了軸突（神經(jīng)細(xì)胞）。

3、長出了軸突（神經(jīng)細(xì)胞）。意義：公認(rèn)的組織培養(yǎng)開始標(biāo)志；意義：公認(rèn)的組織培養(yǎng)開始標(biāo)志；解決了軸突發(fā)生的爭論；解決了軸突發(fā)生的爭論；培養(yǎng)方法將培養(yǎng)物放在蓋玻片上并培養(yǎng)方法將培養(yǎng)物放在蓋玻片上并倒置于凹玻片腔中培養(yǎng)。倒置于凹玻片腔中培養(yǎng)。3細(xì)胞培養(yǎng) 1923 Alexis Carrel (surgeon)Aseptic techniquesCarrel Flask1912-1946Culture Chicken Embryo FibroblastPlasma+tissue homogenate在沒有抗生素的條件下，使雞胚心臟細(xì)胞維持生存在沒有抗生素的條件下，使雞胚心臟細(xì)胞維持生存34年，先后傳代年，

4、先后傳代3400次。次。4細(xì)胞培養(yǎng)19341934年年 荷蘭溫特荷蘭溫特 發(fā)現(xiàn)生長素，并證實(shí)了對(duì)植物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)生長素，并證實(shí)了對(duì)植物細(xì)胞 培養(yǎng)的作用培養(yǎng)的作用19371937年年 高特里特高特里特, ,諾比考特諾比考特( (法法) ) 幾乎同時(shí)離體培養(yǎng)幾乎同時(shí)離體培養(yǎng) 了胡蘿卜組織，并使細(xì)胞增殖了胡蘿卜組織，并使細(xì)胞增殖19401940年年 Earle Earle 建立了可無限傳代的建立了可無限傳代的C3HC3H小鼠的結(jié)締組小鼠的結(jié)締組 織細(xì)胞系織細(xì)胞系L L系（曾在體外經(jīng)甲基膽蒽系（曾在體外經(jīng)甲基膽蒽 轉(zhuǎn)化）。轉(zhuǎn)化）。19511951年年 Gay Gay 建立了人第一個(gè)細(xì)胞系人體宮頸癌建立了人

5、第一個(gè)細(xì)胞系人體宮頸癌 HelaHela細(xì)胞系（原報(bào)道為鱗癌，細(xì)胞系（原報(bào)道為鱗癌，19711971年更年更 正為腺癌）。正為腺癌）。5細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生長動(dòng)物細(xì)胞的生長 動(dòng)物細(xì)胞特性動(dòng)物細(xì)胞特性: : 真核細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)：亞顯微水平真核細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)：亞顯微水平(0.2m)(0.2m) 膜囊結(jié)構(gòu)膜囊結(jié)構(gòu)質(zhì)膜，核膜，內(nèi)膜系統(tǒng)質(zhì)膜，核膜，內(nèi)膜系統(tǒng) 纖維結(jié)構(gòu)纖維結(jié)構(gòu)染色質(zhì)，細(xì)胞骨架系統(tǒng)染色質(zhì)，細(xì)胞骨架系統(tǒng) 顆粒結(jié)構(gòu)顆粒結(jié)構(gòu)核糖體核糖體6細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞器的化學(xué)組分：細(xì)胞器的化學(xué)組分：有機(jī)分子：蛋白質(zhì)類（結(jié)構(gòu)蛋白，分泌蛋白，酶等）有機(jī)分子：蛋白質(zhì)類（結(jié)構(gòu)蛋白，分泌蛋白，酶等） 脂類（磷脂，卵磷脂，腦磷脂，

6、心磷脂）脂類（磷脂，卵磷脂，腦磷脂，心磷脂） 多糖類（糖脂，糖蛋白等）多糖類（糖脂，糖蛋白等） 核酸類（核酸類（DNA,RNADNA,RNA等）等） 固醇類（膽固醇等）固醇類（膽固醇等）無機(jī)分子：水（結(jié)合水，游離水）無機(jī)分子：水（結(jié)合水，游離水） 無機(jī)離子（無機(jī)離子（NaNa+ +,K,K+ +,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+) )7細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)膜生物學(xué)特性：細(xì)胞質(zhì)膜生物學(xué)特性： 對(duì)水具有很強(qiáng)的通透性對(duì)水具有很強(qiáng)的通透性 對(duì)脂溶性物質(zhì)的通透性大于非脂溶性物質(zhì)對(duì)脂溶性物質(zhì)的通透性大于非脂溶性物質(zhì) 電阻率很高，一般在電阻率很高，一般在10109 910101111 表面張力較低表面張力較

7、低8細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞膜下皮質(zhì)層細(xì)胞膜下皮質(zhì)層: :微絲微絲(microfilament,MF)中等纖維中等纖維(intermediate filament,IF)微管微管(microtubule,MT)9細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞之間的連接形式動(dòng)物細(xì)胞之間的連接形式 緊密連接緊密連接(tight junction)(tight junction) 間隙連接間隙連接(gap junction)(gap junction) 隔壁連接隔壁連接(separate junction)(separate junction)無脊椎動(dòng)物細(xì)胞無脊椎動(dòng)物細(xì)胞 中間連接中間連接(intermediate junction)(in

8、termediate junction)脊椎動(dòng)物細(xì)胞脊椎動(dòng)物細(xì)胞 橋粒連接橋粒連接(desmosome junction)(desmosome junction)10細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征1.貼壁型細(xì)胞貼壁型細(xì)胞2.懸浮型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多形性細(xì)胞多形性細(xì)胞11細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)1.貼附貼附 影響因素：離子（影響因素：離子（Ca2+) 機(jī)械、物理因素（低溫、培養(yǎng)液流動(dòng)過快）機(jī)械、物理因素（低溫、培養(yǎng)液流動(dòng)過快） 生物因素（生長因子）生物因素（生長因子）2.接觸抑制接觸抑制3.密度抑

9、制密度抑制12細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程單個(gè)細(xì)胞的生長過程單個(gè)細(xì)胞的生長過程 細(xì)胞周期細(xì)胞周期 G1G1持續(xù)時(shí)間長短差異大持續(xù)時(shí)間長短差異大 S S 時(shí)間較恒定，平均時(shí)間較恒定，平均6-8hr6-8hr G2 G2對(duì)環(huán)境敏感對(duì)環(huán)境敏感 M M 持續(xù)時(shí)間很短持續(xù)時(shí)間很短13細(xì)胞培養(yǎng)14細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系的生長過程細(xì)胞系的生長過程 細(xì)胞在培養(yǎng)中存活時(shí)間的長短，主要取決于細(xì)胞的種類、性細(xì)胞在培養(yǎng)中存活時(shí)間的長短，主要取決于細(xì)胞的種類、性狀、和原供體的年齡等。狀、和原供體的年齡等。三個(gè)生長階段：三個(gè)生長階段： 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的從體內(nèi)取出

10、組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的 階段，一般維持階段，一般維持14周。周。 傳代期傳代期 衰退期衰退期15細(xì)胞培養(yǎng)每代細(xì)胞的生長過程每代細(xì)胞的生長過程每代細(xì)胞一般經(jīng)過三個(gè)生長階段：每代細(xì)胞一般經(jīng)過三個(gè)生長階段： 潛伏期潛伏期 指數(shù)生長期指數(shù)生長期 停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期）16細(xì)胞培養(yǎng)群體細(xì)胞的生長過程群體細(xì)胞的生長過程17細(xì)胞培養(yǎng)潛伏期潛伏期(1atent phase)(1atent phase)18細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期對(duì)數(shù)生長期(logarithmic growth phase)(logarithmic growth phase)接觸抑制接觸抑制(contact inhibition) (c

11、ontact inhibition) 正常細(xì)胞會(huì)因?yàn)榧?xì)胞接觸而發(fā)生相正常細(xì)胞會(huì)因?yàn)榧?xì)胞接觸而發(fā)生相互抑制分裂和限制運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象?；ヒ种品至押拖拗七\(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。對(duì)數(shù)生長期對(duì)數(shù)生長期最具活力時(shí)期（細(xì)胞分裂旺盛，分最具活力時(shí)期（細(xì)胞分裂旺盛，分 裂相增多。）裂相增多。） 細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotic index(mitotic index，MI)MI) MI MI( (分裂相個(gè)數(shù)分裂相個(gè)數(shù)10001000個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞) )100100 19細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定期穩(wěn)定期(stationary phase) 培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)有限培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)有限 代謝廢物積累代謝廢物積累 新分裂細(xì)胞數(shù)新分裂細(xì)胞數(shù)

12、= =死亡細(xì)胞數(shù)死亡細(xì)胞數(shù) （穩(wěn)定期）（穩(wěn)定期）注：細(xì)胞代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行中注：細(xì)胞代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行中20細(xì)胞培養(yǎng)衰亡期衰亡期(senescence phase)21細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征1.染色質(zhì)與染色體染色質(zhì)與染色體 原代培養(yǎng)多呈二倍體原代培養(yǎng)多呈二倍體 長期傳代發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象長期傳代發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象2.細(xì)胞性別細(xì)胞性別 Barr小體小體 Y小體小體22細(xì)胞培養(yǎng)體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化 體內(nèi)外細(xì)胞的差異體內(nèi)外細(xì)胞的差異 培養(yǎng)細(xì)胞的分化培養(yǎng)細(xì)胞的分化23細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液常用液體常用液體 1.1.水水2.2.平衡

13、鹽溶液平衡鹽溶液3.3.消化液消化液4.4.消化酶抑制液消化酶抑制液5.pH5.pH調(diào)整液調(diào)整液24細(xì)胞培養(yǎng)平衡鹽水平衡鹽水BSS v用途用途: : 作為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液作為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液 洗滌組織、細(xì)胞等洗滌組織、細(xì)胞等 v成分：成分： 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 葡萄糖葡萄糖 v作用：作用： 維持滲透壓，調(diào)節(jié)維持滲透壓，調(diào)節(jié)pHpH， 供給能量和無機(jī)離子供給能量和無機(jī)離子25細(xì)胞培養(yǎng)v常用常用:Hanks:Hanks液液 EarleEarle液液 PBSPBSv 配制要求配制要求: :防止鈣沉淀防止鈣沉淀 良好的緩沖作用良好的緩沖作用26細(xì)胞培養(yǎng)27細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞消化液細(xì)胞消化液:胰蛋白酶胰蛋白酶(tryp

14、sin)(trypsin)溶液溶液 濃度濃度0.125%0.125%和和0.25%0.25% 最適條件最適條件pH8.0pH8.037 37 配制配制無無CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的平衡鹽溶液及血清的平衡鹽溶液 乙二胺四乙酸二鈉乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(EDTA)溶液溶液VersenVersen液，常用濃度液，常用濃度0.020.02其他：鏈霉蛋白酶，骨膠原酶，透明質(zhì)酸酶其他：鏈霉蛋白酶，骨膠原酶，透明質(zhì)酸酶28細(xì)胞培養(yǎng)消化酶抑制液消化酶抑制液大豆胰酶抑制液大豆胰酶抑制液終濃度：終濃度：0.1% 0.5% 常以常以DMEM/F12培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液配制過濾除菌過濾除菌-20 保

15、存保存29細(xì)胞培養(yǎng)pH調(diào)整液調(diào)整液3.73.7，5.65.6，7.47.4NaHCONaHCO3 3溶液溶液 0.22m0.22m濾膜過濾除菌濾膜過濾除菌 NaHCONaHCO3 3+H+H2 2O NaO Na+ +OH+OH- -+ H+ H2 2O+COO+CO2 2HEPESHEPES 0.22m0.22m濾膜過濾除菌濾膜過濾除菌30細(xì)胞培養(yǎng)抗生素溶液：抗生素溶液： 青、鏈霉素青、鏈霉素( (雙抗雙抗) )青霉素青霉素抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成100U/ml100U/ml鏈霉素鏈霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成 100g/ml100g/ml 卡那霉素卡那霉素

16、制霉菌素制霉菌素31細(xì)胞培養(yǎng)谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺補(bǔ)充液 溶液中不穩(wěn)定溶液中不穩(wěn)定 過濾除菌過濾除菌 -20 -20 保存保存32細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基營養(yǎng)成分：營養(yǎng)成分： 氨基酸：氨基酸：L型型 單糖：葡萄糖單糖：葡萄糖 維生素維生素 其他成分其他成分 ：核酸降解物、抗氧：核酸降解物、抗氧化劑等化劑等促生長因子及激素促生長因子及激素 pH滲透壓滲透壓33細(xì)胞培養(yǎng)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 血清血清 組織提取液組織提取液 雞胚汁雞胚汁 鼠尾膠原鼠尾膠原 水解乳蛋白水解乳蛋白34細(xì)胞培養(yǎng)血清血清 種類種類: : 小牛血清小牛血清 牛血清：牛血清： 新生牛血清新

17、生牛血清 胎牛血清胎牛血清 馬血清馬血清 雞血清雞血清 兔血清兔血清 羊血清羊血清35細(xì)胞培養(yǎng)主要成分：主要成分： 各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等。素、無機(jī)物等。36細(xì)胞培養(yǎng)血清的主要作用：血清的主要作用：v 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)v 提供貼壁和擴(kuò)展因子提供貼壁和擴(kuò)展因子v 提供激素和各種生長因子提供激素和各種生長因子v 提供結(jié)合蛋白提供結(jié)合蛋白v 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用37細(xì)胞培養(yǎng)使用血清的缺點(diǎn)：使用血清的缺點(diǎn)：v可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)?？赡芨淖兡撤N細(xì)胞

18、在體內(nèi)的正常狀態(tài)。v 取材過程有可能帶入支原體、病毒，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞取材過程有可能帶入支原體、病毒，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞 產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn) 結(jié)果的不結(jié)果的不 可靠性可靠性v 每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致v 血清中含有一些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用血清中含有一些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用38細(xì)胞培養(yǎng)血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)v 理化性質(zhì)（滲透壓、理化性質(zhì)（滲透壓、pHpH、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等）水平、內(nèi)毒素等）v 微生物檢測（細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）微生物檢測（細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）v 促生長效果促生長效果39細(xì)胞培養(yǎng)血清的使用與儲(chǔ)存血清的使用與儲(chǔ)存v 使用前處理：使用前處理： 滅活處理滅活處理5656，30min30min 目的目的去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用v 儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存于儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存于-20 -20 ，避免反復(fù)凍融，避免反復(fù)凍融v 使用濃度：一般為使用濃度：一般為5%5%20%20%，常為，常為10% 10% 40細(xì)胞培養(yǎng)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 無機(jī)鹽無機(jī)鹽v 基本組分：基本組分： 氨基酸：氨基酸：1212種必需氨基酸種必需氨基酸 維生素維