第七章 預(yù)處理和固液分離技術(shù)

1、 預(yù)處理及固預(yù)處理及固- -液液 分離技術(shù)分離技術(shù)第七章第七章學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)n知識要求n 掌握去除雜蛋白和金屬離子的方法和原理；掌握影響過濾速度的因素及改進過濾性能的方法；掌握常用細(xì)胞破碎的方法，各種方法的優(yōu)缺點和適用范圍。n 了解預(yù)處理的目的和方法，了解發(fā)酵液過濾特性。n能力要求n 熟練掌握去除發(fā)酵液中雜蛋白和金屬離子的操作技能。n 學(xué)會包涵體的破碎技術(shù)。第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵液過濾特性的改變發(fā)酵液過濾特性的改變，發(fā)酵液預(yù)處理和固發(fā)酵液預(yù)處理和固- -液分離液分離下游技術(shù)下游技術(shù)生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程預(yù)處理和固液分離內(nèi)容預(yù)處理和固液分離內(nèi)容固液分離固液分離發(fā)酵液發(fā)酵液胞外

2、胞外上清液上清液/濾液濾液預(yù)處理預(yù)處理提取生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：提取生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：胞內(nèi)胞內(nèi)富集細(xì)胞富集細(xì)胞第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵液過濾特性的改變發(fā)酵液過濾特性的改變，發(fā)酵液預(yù)處理和固發(fā)酵液預(yù)處理和固- -液分離液分離n 發(fā)酵液成分很復(fù)雜，包含菌（細(xì)胞）體，胞內(nèi)發(fā)酵液成分很復(fù)雜，包含菌（細(xì)胞）體，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等。外代謝產(chǎn)物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等。n 目標(biāo)物質(zhì)濃度通常很低，雜質(zhì)較多，生物物質(zhì)目標(biāo)物質(zhì)濃度通常很低，雜質(zhì)較多，生物物質(zhì)一般又極不穩(wěn)定。一般又極不穩(wěn)定。一、發(fā)酵液過濾特性的改變一、發(fā)酵液過濾特性的改變n發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1

3、-10%1-10%n懸浮物顆粒小，細(xì)胞的相對密度與培養(yǎng)液相似懸浮物顆粒小，細(xì)胞的相對密度與培養(yǎng)液相似n可壓縮性可壓縮性n液相粘度大，大多為非牛頓型流體液相粘度大，大多為非牛頓型流體n性質(zhì)不穩(wěn)定，易受空氣氧化、微生物污染、蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定，易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用影響酶水解等作用影響n懸浮狀態(tài)穩(wěn)定：雙電層、水化膜、布朗運動懸浮狀態(tài)穩(wěn)定：雙電層、水化膜、布朗運動二、發(fā)酵液的預(yù)處理二、發(fā)酵液的預(yù)處理目的：目的：n 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離液中分離固形物的速度，提高固液分離效率；效率；n 分離菌體和其它懸浮顆粒，

4、除去部分分離菌體和其它懸浮顆粒，除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進行。提取和精制后繼各工序的順利進行。二、發(fā)酵液的預(yù)處理二、發(fā)酵液的預(yù)處理（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性()LmCdQA pdtRRA-過濾面積，過濾面積，p-操作壓力，操作壓力，L-濾液粘度，濾液粘度，Rm-介質(zhì)阻介質(zhì)阻力，力，RC-濾餅阻力。濾餅阻力。二、發(fā)酵液的預(yù)處理二、發(fā)酵液的預(yù)處理（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性1.降低液體粘度降低液體粘度 加水稀釋法加水稀釋法 升高溫度升高溫度 加熱加熱2 2）加熱使蛋白質(zhì)變

5、性凝固）加熱使蛋白質(zhì)變性凝固 變性蛋白質(zhì)的溶解度小變性蛋白質(zhì)的溶解度小。如檸檬酸發(fā)酵液加熱至。如檸檬酸發(fā)酵液加熱至8080以上，可使蛋白質(zhì)變性以上，可使蛋白質(zhì)變性凝固，過濾速度加快。凝固，過濾速度加快。 只適用于只適用于對熱較穩(wěn)定對熱較穩(wěn)定的的液體。注意加熱溫度與時間液體。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。完整性。加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡單最常用的方法。加加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡單最常用的方法。加熱能改善發(fā)酵液的操作特性。熱能改善發(fā)酵液的操作特性。麥芽汁的黏度麥芽汁的黏度-溫度曲線。溫度曲線。（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性2.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)p

6、H pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。值可改善其過濾特性。u細(xì)胞細(xì)胞( (碎片碎片) )及某些膠體物質(zhì)在某個及某些膠體物質(zhì)在某個pHpH值下也可能趨于絮凝值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。u調(diào)節(jié)發(fā)酵液的調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pHpH到蛋白質(zhì)的等電點是除去蛋白質(zhì)的有效方到蛋白質(zhì)的等電點是除去蛋白質(zhì)的有效方法。大幅度改變法。大幅度改變pHpH還能使蛋白質(zhì)變性凝固。還能使蛋白質(zhì)變性凝固。u通過調(diào)整通過調(diào)整pHpH值改變膜過濾中易吸附分子的電荷性質(zhì)，可減值改變

7、膜過濾中易吸附分子的電荷性質(zhì)，可減少膜堵塞和污染；少膜堵塞和污染；u影響離子型絮凝劑的電離度。影響離子型絮凝劑的電離度。0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH3.凝聚與絮凝凝聚與絮凝 凝聚凝聚: :是指在是指在電解質(zhì)電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，膠體粒子間因相互碰撞而排斥作用降低，電位下降，膠體粒子間因相互碰撞而產(chǎn)生凝集（產(chǎn)生凝集（1mm1mm左右）的現(xiàn)象。左右）的現(xiàn)象。絮凝絮凝:

8、:是指在某些是指在某些高分子絮凝劑高分子絮凝劑存在下，基于橋架作存在下，基于橋架作用，當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同用，當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，形成粗大的絮凝團的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，形成粗大的絮凝團（10mm10mm）的過程，是一種以物理的集合為主的過程。）的過程，是一種以物理的集合為主的過程。 （一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性凝聚：膠體粒子在中性鹽促進下脫穩(wěn)相互聚集成凝聚：膠體粒子在中性鹽促進下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（大粒子（1mm1mm）機理：機理：1）中和粒子表面電荷中和粒子表面電荷 2 2）消除雙電層

9、結(jié)構(gòu)）消除雙電層結(jié)構(gòu)3 3）破壞水化膜）破壞水化膜凝凝 聚聚 Coagulation因合并而沉降因合并而沉降n 發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)電荷，由于靜電引力使溶電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周液中反離子被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電圍，在界面上形成了雙電層。層。n 正離子同時受到使它們均正離子同時受到使它們均勻分布的熱運動影響，具勻分布的熱運動影響，具有離開膠粒表面的趨勢。有離開膠粒表面的趨勢。膠體雙電層結(jié)構(gòu)兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：n1 1）吸附層或）吸附層或sternstern層；層；2 2）擴散層。）擴散層。

10、形成了擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型形成了擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型( (Gouy-Chapman-Stern model) )。膠體雙電層結(jié)構(gòu)膠體雙電層結(jié)構(gòu)n常用的凝聚劑電解質(zhì)有：常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁硫酸鋁 Al2(SO4)318H2O（明礬）；（明礬）；氯化鋁氯化鋁 AlCl36H2O;三氯化鐵三氯化鐵 FeCl3;硫酸亞鐵硫酸亞鐵 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性n 絮凝絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團的過

11、程網(wǎng)狀，形成絮凝團的過程機理機理：架橋作用：架橋作用n 采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。液較易分離。絮絮 凝凝 flocculation高分子絮凝劑的吸附架橋作用高分子絮凝劑的吸附架橋作用 聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點l 用量少，一般以用量少，一般以mg/L計量；計量；l 絮凝體粗大，分離效果好；絮凝體粗大，分離效果好；l 絮凝速度快；絮凝速度快；l 種類多，適用范圍廣種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺

12、，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。目前最常見：目前最常見：聚丙烯酰胺類聚丙烯酰胺類絮凝劑絮凝劑n對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理，單獨使用可達到較好產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理，單獨使用可達到較好絮凝效果；絮凝效果；n對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果。凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果。n這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。這種包括凝

13、聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。 混混 凝凝絮凝的影響因素絮凝的影響因素n 發(fā)酵液的性質(zhì)（細(xì)胞濃度，表面電荷）；發(fā)酵液的性質(zhì)（細(xì)胞濃度，表面電荷）；n 絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一 半被聚合物覆蓋；半被聚合物覆蓋；n 絮凝劑的分子量；絮凝劑的分子量；n pH pH 控制；控制；n 攪拌速度。攪拌速度。n 常用的凝聚劑電解質(zhì)有：常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁硫酸鋁 Al2(SO4)318H2O（明礬）；（明礬）；氯化鋁氯化鋁 AlCl36H2O;三氯化鐵三氯化鐵 FeCl3;硫酸亞鐵硫酸亞鐵 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3

14、（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性4.加入助濾劑（filteraids） n 一種不可壓縮的多孔微粒，一種不可壓縮的多孔微粒，n 在發(fā)酵液中加入固體助濾劑在發(fā)酵液中加入固體助濾劑，則菌體可吸附于助濾劑微，則菌體可吸附于助濾劑微粒上，助濾劑就作為膠體粒粒上，助濾劑就作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾子的載體，均勻地分布于濾餅層中，降低了濾餅的可壓餅層中，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過濾阻力?？s性，減小了過濾阻力。n 常用的助濾劑是硅藻土，其常用的助濾劑是硅藻土，其次是珍珠巖粉、活性炭、石次是珍珠巖粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纖維素、白英砂、石棉粉、纖維素、白土等。土等。（一）改

15、變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性u1 1）加入反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀）加入反應(yīng)劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀, ,生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，又能生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)凝固，過濾性能上升，沉淀本身可作為助濾劑使蛋白質(zhì)凝固，過濾性能上升，沉淀本身可作為助濾劑. .如在如在新生霉素發(fā)酵液中加入新生霉素發(fā)酵液中加入CaClCaCl2 2和和NaNa3 3POPO4 4，生成，生成CaCa3 3(PO(PO4 4) )2 2沉淀。沉淀。u發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)時，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以發(fā)酵液中含有

16、不溶性多糖物質(zhì)時，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入加入0.025%0.025%的淀粉酶，攪拌的淀粉酶，攪拌30min30min后，再加后，再加2.5%2.5%硅藻土助濾劑，硅藻土助濾劑，可提高過濾效率可提高過濾效率5 5倍。倍。（一）改變發(fā)酵液的過濾特性（一）改變發(fā)酵液的過濾特性發(fā)酵液中的雜質(zhì)發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機離子（高價無機離子（CaCa2+2+、MgMg2+2+、FeFe2+2+）雜蛋白雜蛋白u常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞，影響過濾效率。常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞，影響過濾

17、效率。u采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，u有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清。有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清。因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。（二）發(fā)酵液的相對純化（二）發(fā)酵液的相對純化u 在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。高價無機離子的去除方法高價無機離子的去除方法 Ca2+ 草酸、草酸鈉，草酸、草酸鈉，形成草酸鈣沉淀形成草酸鈣沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸）

18、 ； Mg2+三聚磷酸鈉，三聚磷酸鈉，形成三聚磷酸鈉鎂可形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；溶性絡(luò)合物； Fe2+ 黃血鹽，黃血鹽，普魯士蘭沉淀普魯士蘭沉淀雜蛋白的去除方法雜蛋白的去除方法沉淀法吸附法變性法雜蛋白去除雜蛋白去除-沉淀法沉淀法 precipitationA 等電點沉淀法等電點沉淀法 （isoelectric precipitation ）蛋白質(zhì)的等電點大都在酸性范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的等電點大都在酸性范圍內(nèi)(pH4.0(pH4.05.5)5.5)，調(diào)節(jié)發(fā)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酵液的pHpH到蛋白質(zhì)的等電點是除去蛋白質(zhì)的有效方法。到蛋白質(zhì)的等電點是除去蛋白質(zhì)的有效方法。B. 酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與離子形成沉

19、淀酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與離子形成沉淀l在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子形成沉淀，如三氯乙在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子形成沉淀，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等；酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等；l在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子形成沉淀，如在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子形成沉淀，如Ag+Ag+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、Fe Fe 3+3+等。等。雜蛋白去除雜蛋白去除- 吸附法吸附法 adsorption。n 四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K K2 2ZnZn3 3Fe(CN)Fe(CN

20、)5 5 2 2的膠狀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得很沉淀來吸附蛋白質(zhì)，利用此法除蛋白質(zhì)已取得很好的效果。好的效果。n 在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。從而加快了過濾速度。雜蛋白去除雜蛋白去除-變性變性 Denaturation 蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程稱為變蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程稱為變性。變性蛋白質(zhì)溶解度較

21、小。性。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。l 加熱，加熱，l 大幅度調(diào)節(jié)大幅度調(diào)節(jié)pHpH值，值，l 加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處：不足之處：加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端極端pHpH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；a.a. 有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。 三、固三、固- -液分離液分離n （一）離心分離（一）離心分離n 離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動所產(chǎn)生的離心力，使懸浮液、乳濁

22、液離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動所產(chǎn)生的離心力，使懸浮液、乳濁液分離或濃縮的分離的過程。它具有分離速率快、分離效率高、液相分離或濃縮的分離的過程。它具有分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等優(yōu)點。但離心設(shè)備投資大、能耗高，連續(xù)排料時，固相澄清度好等優(yōu)點。但離心設(shè)備投資大、能耗高，連續(xù)排料時，固相干度不如過濾設(shè)備。干度不如過濾設(shè)備。n （二）過濾（二）過濾n 過濾是指借助于一種能將固體物截留而讓流體通過的多孔介質(zhì)，將過濾是指借助于一種能將固體物截留而讓流體通過的多孔介質(zhì)，將固體物與液體分離的單元操作。過濾技術(shù)可除去發(fā)酵液中的固體雜固體物與液體分離的單元操作。過濾技術(shù)可除去發(fā)酵液中的固體雜質(zhì)（如細(xì)菌菌

23、絲）達到固液分離，為進一步分離純化操作提供較澄質(zhì)（如細(xì)菌菌絲）達到固液分離，為進一步分離純化操作提供較澄清的溶液。清的溶液。n （三）固液分離的其它方法（三）固液分離的其它方法n 雙水相萃取、吸附法、膜處理、絮凝等均可達到固液分離的目的。雙水相萃取、吸附法、膜處理、絮凝等均可達到固液分離的目的。以上方法各有特點，通常是幾種方法綜合使用，以提高發(fā)酵液預(yù)處以上方法各有特點，通常是幾種方法綜合使用，以提高發(fā)酵液預(yù)處理效率。理效率。 生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù) 細(xì)胞破碎技術(shù)是利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞細(xì)胞破碎技術(shù)是利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞

24、內(nèi)容物包括目標(biāo)產(chǎn)物釋放出來。壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目標(biāo)產(chǎn)物釋放出來。微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽性細(xì)菌陽性細(xì)菌革蘭氏革蘭氏陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(3

25、0-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類脂類(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞破碎方法分類一、細(xì)胞破碎方法分類機械破碎機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎化學(xué)破碎有機溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的

26、外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細(xì)胞破碎而達到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理( (一一) )機械法機械法機械破碎法又可分為機械破碎法又可分為n1.組織勻漿器組織勻漿器 n2.研磨研磨 n3.高速組織搗碎機高速組織搗碎機 n4.高壓勻漿器高壓勻漿器 n5.高速珠磨機高速珠磨機 n6.超聲波震蕩法超聲波震蕩法 1. 1.

27、組織勻漿器組織勻漿器 組織勻漿器由一內(nèi)壁磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（表組織勻漿器由一內(nèi)壁磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（表面磨砂）的桿組成。面磨砂）的桿組成。 勻漿器的內(nèi)桿球體與管壁之間只有勻漿器的內(nèi)桿球體與管壁之間只有十分之毫米，組織破碎程度高，機械切力對生物大分子破十分之毫米，組織破碎程度高，機械切力對生物大分子破壞較少。制造勻漿器的材料除玻璃外，也可用不銹鋼、硬壞較少。制造勻漿器的材料除玻璃外，也可用不銹鋼、硬質(zhì)塑料等。大多數(shù)情況下，用這種方法可切碎較薄的動物質(zhì)塑料等。大多數(shù)情況下，用這種方法可切碎較薄的動物組織膜，但不易打碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。組織膜，但不易打碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。2.2.

28、 研磨研磨用研缽和研杵進行，對細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，它適用于用研缽和研杵進行，對細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，它適用于細(xì)胞器的制備，如線粒體、溶酶體、微粒體等。一些難以細(xì)胞器的制備，如線粒體、溶酶體、微粒體等。一些難以破碎的細(xì)胞或微生物菌體則可加一些研磨劑，如玻璃粉、破碎的細(xì)胞或微生物菌體則可加一些研磨劑，如玻璃粉、石英砂、氧化鋁、硅藻土等，破壁效果更好。石英砂、氧化鋁、硅藻土等，破壁效果更好。3.3.高速組織搗碎機高速組織搗碎機 搗碎機由調(diào)速器、支架、馬達、旋轉(zhuǎn)搗碎機由調(diào)速器、支架、馬達、旋轉(zhuǎn)刀葉、有機玻璃筒等部分組成。操作刀葉、有機玻璃筒等部分組成。操作時，先將材料配成稀糊狀液，置于筒時，先將

29、材料配成稀糊狀液，置于筒體中約占體中約占1/3體積，蓋上蓋子。開動體積，蓋上蓋子。開動馬達后，逐步加速至所需速度，轉(zhuǎn)速馬達后，逐步加速至所需速度，轉(zhuǎn)速最高可達最高可達10000r/min。操作時溫度。操作時溫度會迅速升高，需在圓筒周圍放冰冷卻會迅速升高，需在圓筒周圍放冰冷卻。高速組織搗碎機適宜于動物內(nèi)臟組。高速組織搗碎機適宜于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽等織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽等材料的破碎。材料的破碎。 4.4.高壓勻漿器高壓勻漿器高壓勻漿器由高壓泵和勻漿閥組成。高壓勻漿器由高壓泵和勻漿閥組成。細(xì)胞懸浮液自高壓室針細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度形閥噴出時，每秒速度

30、高達幾百米，高速噴出高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運動過程這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。胞破碎。l升高壓力有利于破碎升高壓力有利于破碎減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過小。乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過小。但但p p大到一定值時對勻漿器的磨損增加，也有實驗表明大到一定值時對勻漿器的磨損增

31、加，也有實驗表明p p超生一定值時，超生一定值時，R R增加但很慢。增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為555570Mpa70Mpa。l破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復(fù)雜培養(yǎng)基生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。上容易破碎。影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素高壓勻漿法適用的范圍高壓勻漿法適用的范圍大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法高壓勻漿

32、法適用的范圍：高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，料液細(xì)胞濃度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高壓勻漿法。不宜使用高壓勻漿法。易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包涵體的基因工程菌（因包含體堅硬，易含有包涵體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）損傷勻漿閥）5.5.高速珠磨機高速珠磨機 u珠磨是常用的方法u細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于研磨劑（直徑小于1mm1mm）一）一起快速攪拌

33、或研磨，研磨起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。碎，釋放出內(nèi)含物。u在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機采用高速珠磨機高速珠磨機工作原理高速珠磨機工作原理l 磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動；轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動；l 細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起l 在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的

34、狹縫很小，可阻擋玻板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。離小珠，使不被料液帶出。l 由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。6.6.超聲波震蕩法超聲波震蕩法 n 超聲波震蕩法利用超聲波振蕩器發(fā)射的超聲波震蕩法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。n 超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。n 超聲波的細(xì)

35、胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波破碎的機理超聲波破碎的機理JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機細(xì)胞粉碎機(一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),cavitation),(液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。而使細(xì)胞破碎。(操

36、作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。外部冷卻的容器中進行。(間歇操作。間歇操作。超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎的適用范圍 超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。的破碎。 一般桿菌比球菌易破碎，一般桿菌比球菌易破碎，G-G-細(xì)菌比細(xì)菌比G+G+細(xì)菌易破碎，對細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。酵母菌的效果較差。 但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。質(zhì)失活。 超聲波破碎的有效能量利用率極低超聲波破碎的有效能量利用率

37、極低 由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但。（二）非機械破碎方法（二）非機械破碎方法1 .1 .物理法物理法 反復(fù)凍融反復(fù)凍融 冷熱交替冷熱交替 滲透壓沖擊滲透壓沖擊 干燥法干燥法2.2.化學(xué)法溶胞化學(xué)法溶胞3.3.酶解酶解 自溶法自溶法 外加酶法外加酶法其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15-15），然后在），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵

38、結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)變性。 冷熱交替法冷熱交替法將細(xì)胞投入到沸水中，將細(xì)胞投入到沸水中，90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，可破碎絕大部立即置于冰浴中使之迅速冷卻，可破碎絕大部分細(xì)胞。從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時分細(xì)胞。從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可

39、使用這種方法?？墒褂眠@種方法。滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，n將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達到平內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 n僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞

40、壁預(yù)先用僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強度減弱。生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強度減弱。對革蘭氏陽性菌、真菌、植物細(xì)胞不適用。對革蘭氏陽性菌、真菌、植物細(xì)胞不適用。使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-3025-30的氣流中

41、吹干；的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)缺點是條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。缺點是條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。干燥法干燥法氣流干燥氣流干燥真空干燥真空干燥噴霧干燥噴霧干燥冷凍干燥冷凍干燥某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來?；瘜W(xué)法化學(xué)法該法取決于化

42、學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。 有機溶劑有機溶劑 能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS，陰離子型）；。，陰離子型）；。非離子型如非離子型如Triton X-100Triton X-100和吐溫（和吐溫（TweenTween）等）等對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂

43、，破壞對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。表面活性劑表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解EDTAEDTA螯合劑螯合劑處理處理G-G-細(xì)菌，對細(xì)胞壁外層有破壞作用。細(xì)菌，對細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子細(xì)菌的壁外

44、層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子CaCa2+2+或或MgMg2+2+結(jié)合脂多糖結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTAEDTA將將CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。酸、堿處理法酸、堿處理法n 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl6mol/L HCl。n 堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。

45、 酶解法酶解法 酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。分為：自溶法、外加酶法優(yōu)點：u專一性強，能選擇性地釋放產(chǎn)物u發(fā)生酶解的條件溫和u收率高，細(xì)胞外形較完整缺點：缺點：溶酶價格高，溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶) )產(chǎn)物抑制的存在。產(chǎn)物抑制的存在。 只適用于小規(guī)模實驗室研究只適用于小規(guī)模實驗室研究 酶解酶解- -自溶法自溶法l 自溶作用是自溶作用是利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶不需外加其他的酶。l在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種

46、能水在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。l自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。它的自溶酶，以達到自溶目的。l缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。懸浮液粘度增大，過濾速度下降。l自溶法不適用于制備具有活性的核酸或活性蛋白質(zhì)。自溶法不適用于制備具有活性的核酸或活性蛋白質(zhì)。 外加酶法外加

47、酶法n 溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的聚糖分子的-1,4-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTAEDTA一一起使用。起使用。l放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，

48、主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。l植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。纖維素酶和半纖維素酶裂解。（三）包涵體的破碎（三）包涵體的破碎n 包涵體是指異源的重組蛋白在宿主細(xì)胞（如原核細(xì)胞、酵母或真核系統(tǒng)）中高水平表達，生成的無定形的蛋白質(zhì)聚集體。n 不具生物活性，但一級結(jié)構(gòu)正確。與可溶形式的蛋白質(zhì)產(chǎn)物相比，包涵體蛋白具有一定的優(yōu)勢，包括產(chǎn)物濃度高（占細(xì)胞總蛋白

49、質(zhì)的50%），不易被宿主的蛋白酶降解，對宿主細(xì)胞的毒性較低等。 機械破碎機械破碎( (高壓勻漿、高速珠磨）高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包涵體離心提取包涵體加變性劑溶解加變性劑溶解除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性包涵體制備重組蛋白的工藝路線包涵體制備重組蛋白的工藝路線 目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑：常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸

50、胍和鹽酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破壞離子間相互作用；作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如表面活性劑如1-2 SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。 PH9.0的堿溶液和有機溶劑，使用較少。的堿溶液和有機溶劑，使用較少。影響變性因素：時間、影響變性因素：時間、pH、離子強度、變性劑種類和、離子強度、變性劑種類和濃度。濃度。二 非機械法二原理：原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后

51、，和共價鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過程稱復(fù)性。過程稱復(fù)性。復(fù)性方法：復(fù)性方法：l稀釋法除變性劑稀釋法除變性劑 加入大量水或緩沖液。加入大量水或緩沖液。l膜分離法除變性劑膜分離法除變性劑 透析、超濾、電滲析。透析、超濾、電滲析。l層析法：凝膠層析，層析法：凝膠層析，高效疏水層析高效疏水層析 目標(biāo)蛋白的復(fù)性目標(biāo)蛋白的復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：u變性劑濃度變性劑濃度u目標(biāo)蛋白濃度；目標(biāo)蛋白濃度；upH和離子強度；和離子強度； u氧化還原條件。氧化還原條件。 還原劑：還原劑： 二硫蘇糖醇、二硫蘇

52、糖醇、-巰基乙醇、巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；還原型谷胱甘肽；氧化劑：氧化劑： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 堿性下通空氣。堿性下通空氣。 復(fù)性區(qū)復(fù)性區(qū) 多聚物生成區(qū)多聚物生成區(qū) 絮凝沉淀區(qū)絮凝沉淀區(qū)鹽鹽酸酸胍胍濃濃度度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑與蛋白質(zhì)濃度對復(fù)性的影響與蛋白質(zhì)濃度對復(fù)性的影響蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度 mol/L細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。使導(dǎo)電率上升。 直接測定法直接測定法 化合物產(chǎn)量測定法化合物產(chǎn)量測定法 導(dǎo)電率測定法導(dǎo)電率測定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞

53、區(qū)別開來。采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與或活性，并與100%100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計算其破碎率。破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計算其破碎率。（一）細(xì)胞破碎率的測定（一）細(xì)胞破碎率的測定二、破碎效果的評價二、破碎效果的評價00()100%

54、NNYN分類分類作用機理作用機理適用范圍適用范圍機機械械法法組織勻漿組織勻漿器器固體剪切作固體剪切作用用用于破碎較薄的動物組織膜，但不易打用于破碎較薄的動物組織膜，但不易打碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。碎植物和細(xì)菌的細(xì)胞。研缽研缽固體剪切作固體剪切作用用細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，適用于細(xì)胞細(xì)菌及植物材料應(yīng)用較多，適用于細(xì)胞器的制備。器的制備。高速組織高速組織搗碎機搗碎機固體剪切作固體剪切作用用操作時溫度會迅速升高，適宜于動物內(nèi)操作時溫度會迅速升高，適宜于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽臟組織、植物肉質(zhì)組織、柔嫩的葉和芽等材料的破碎。等材料的破碎。高壓勻漿高壓勻漿器器液體剪切作液體剪切作用用大規(guī)模破

55、碎細(xì)胞常用設(shè)備，可達較高破大規(guī)模破碎細(xì)胞常用設(shè)備，可達較高破碎率，對多種微生物細(xì)胞均適用，不適碎率，對多種微生物細(xì)胞均適用，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌。合絲狀菌和革蘭氏陽性菌。高速珠磨高速珠磨機機固體剪切作固體剪切作用用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。超聲波振超聲波振蕩法蕩法液體剪切作液體剪切作用用最適合實驗室規(guī)模細(xì)胞破碎。對酵母菌最適合實驗室規(guī)模細(xì)胞破碎。對酵母菌效果差，破碎過程升溫劇烈，不適合大效果差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作。規(guī)模操作。分類分類作用機理作用機理適用范圍適用范圍

56、非機械法反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)-融化融化破碎率較低，適用于細(xì)胞壁較脆弱的新鮮細(xì)破碎率較低，適用于細(xì)胞壁較脆弱的新鮮細(xì)胞。不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物，蛋白釋胞。不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物，蛋白釋放量不足。放量不足。冷熱交替法冷熱交替法溫度劇烈變化溫度劇烈變化適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸。適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸。滲透壓沖擊滲透壓沖擊法法滲透壓劇烈改滲透壓劇烈改變變破碎率較低，常與其它方法結(jié)合使用。主要破碎率較低，常與其它方法結(jié)合使用。主要適用于不具有細(xì)胞壁、細(xì)胞壁較脆弱、細(xì)胞適用于不具有細(xì)胞壁、細(xì)胞壁較脆弱、細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或細(xì)胞壁合成受到抑制的細(xì)壁預(yù)先用酶處

57、理或細(xì)胞壁合成受到抑制的細(xì)胞的破碎。對革蘭氏陽性菌、真菌、植物細(xì)胞的破碎。對革蘭氏陽性菌、真菌、植物細(xì)胞不適用。胞不適用。干燥法干燥法改變細(xì)胞膜滲改變細(xì)胞膜滲透性透性條件變化劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其它組織變條件變化劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性?？諝飧稍镞m用于酵母菌，真空干燥適用性?？諝飧稍镞m用于酵母菌，真空干燥適用于細(xì)菌，而冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化于細(xì)菌，而冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。物質(zhì)?；瘜W(xué)法化學(xué)法改變細(xì)胞膜滲改變細(xì)胞膜滲透性透性有一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低有一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差。，通用性差。酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用專一性強，酶解條件

58、溫和，漿液易分離，收專一性強，酶解條件溫和，漿液易分離，收率高，產(chǎn)品破壞少，不殘留細(xì)胞碎片。費用率高，產(chǎn)品破壞少，不殘留細(xì)胞碎片。費用較高，通用性差。常用于實驗室研究。較高，通用性差。常用于實驗室研究。（三）細(xì)胞破碎方法的選擇（三）細(xì)胞破碎方法的選擇 細(xì)胞破碎的一般原則：提取的物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，采細(xì)胞破碎的一般原則：提取的物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，采用機械方法；在細(xì)胞膜附近采用非機械法；提取產(chǎn)用機械方法；在細(xì)胞膜附近采用非機械法；提取產(chǎn)物若與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合時，采用機械法和化學(xué)物若與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合時，采用機械法和化學(xué)法相結(jié)合的方法。適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的法相結(jié)合的方法。適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從

59、高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步分離、提取這三產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步分離、提取這三方面進行權(quán)衡。方面進行權(quán)衡。第三節(jié)第三節(jié) 沉淀分離純化技術(shù)沉淀分離純化技術(shù) 沉淀法是指改變條件或加入某些沉淀沉淀法是指改變條件或加入某些沉淀劑，降低溶液中溶質(zhì)的溶解度，使溶質(zhì)由液劑，降低溶液中溶質(zhì)的溶解度，使溶質(zhì)由液相變成無定形固相析出的過程。相變成無定形固相析出的過程。 第三節(jié)第三節(jié) 沉淀分離純化技術(shù)沉淀分離純化技術(shù)防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障u蛋白質(zhì)周圍的水化層蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)hydration shell)，使使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白

60、質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。u蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)為分子間靜電排斥作分子間靜電排斥作用。用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)粒子在水溶液中（存在雙電層）蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷離子或自身基團的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。一、鹽析沉淀法一、鹽析沉淀法 概述：概述： “鹽析鹽析”意指在固體物質(zhì)的水溶意指在固體物質(zhì)的水溶液中加入高濃度中性鹽，固體物質(zhì)因溶解度液中加入高濃度中性鹽，固體物質(zhì)因溶解度減小而析出的過程。減小而析出的過程。1-100nm鹽析法機理鹽析