瓊脂糖凝膠電泳濃度與dna長度的確定

1、瓊脂糖凝膠電泳：膠濃度與 DNA長度的 2010年1月22日«1,527 views« Biology*沒有評(píng)論分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見下表。凝膠濃度（%線性DNA長度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.0502000膠回收DNA注意事項(xiàng) 切膠回收DNA片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。 所以為了 減少膠的體積，我們就可以用相對(duì)比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。 主要還是DNA

2、勺濃度，如果DNA濃度不夠，想膠小點(diǎn)也不可能。 紫外燈下切下含待回收DNA勺凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無 DNA虧染的新刀片，其目的在于防止外源 DNA勺污染。 利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個(gè)原因：膠塊未完全溶解，可適當(dāng)延長水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助 溶解；膠塊體積太大，應(yīng)先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合DNA如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未加入無 水乙醇。 可以改用去離子水洗脫。但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當(dāng)調(diào)高其pH值，以增加洗脫得率。 洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會(huì)影響后續(xù)酶切

3、實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)確保徹底去除漂洗緩沖 液，具體方法參見回收效率低的解決方案。 不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積） 進(jìn)行洗脫以 提高濃度，因?yàn)檎f明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積， 若 減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。 電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)片 段純度要求較高，建議即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純 度可能要比直接回收高一些。 瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因： 瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝 膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保 存在4C或-20C ;制膠的電泳緩沖液濃度過

4、高或陳舊。關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng)1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈 滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源 dna污染。2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以 用相對(duì)比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴 樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對(duì)于膠有特殊要求，例如要求 不含EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4. 按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有

5、marker的膠，EB染色，紫外 燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與 marker間的相對(duì)位置已知， 根據(jù)尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。 如果覺得很難判斷，可以直接在 marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。膠回收一. 提高膠回收量的辦法：1）增加電泳時(shí)的上樣量。2）電泳緩沖液用新鮮配制的。3）切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要 了，不然影響回收率。4）把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè) 柱子上。5）溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于 DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要 多余750ul。6）膠回收的關(guān)鍵是

6、通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使 DNA 與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的 PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（ PH5.0， 3mol/L的NaAC ；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在 加熱溶解膠后的液體里。7）加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需 10分鐘），以使乙醇充分 揮發(fā)。H最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50卩l(xiāng)洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合 在膜上的DNA9）可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以 上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜

7、，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)。10）將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。二. 幾種PCR產(chǎn)物回收的詳方法和步驟1）普通膠回收 如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可 以切膠后加入3倍體積TE,水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即 可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。2）從低熔點(diǎn)凝膠回收 DNA純化 DNA片段 加與凝膠體積相等的 TE（ 10mmol/l Tris-HCI pH8.0，0.1mmol/lEDTA，置65C水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE 飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000r

8、pm, 3分鐘離 心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積 無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的 DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可 用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。3）擴(kuò)增特異性好的PCF回收如果PCRT增特異性好，只是簡單的PCF產(chǎn)物純化回收，可以在PCF產(chǎn)物中加入 50ug/ml的蛋白酶K, 37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入 0.1 體積的醋酸鈉， 2.5 體積的無水乙醇沉淀回收。三. 不需膠回收就可直接連接的方法1）低溫冷凍析出法跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的 agarose 膠，跑到一定時(shí)候， 將目的條帶所在的那一段膠切 下

9、，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那 點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入 1.5ml EP 管中，然后放在負(fù) 75度冰箱中 1030分 鐘，接著1, 300rpm離心5- 10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余 的液體也吸出，儲(chǔ)存在另一個(gè)管子中，做好標(biāo)記，放在 20 度備用。2）酶切后的直接連接在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好 的片斷的 .四、一些注意事項(xiàng)1. 電泳的 buffer 和 gel 都是新制的， 切膠的臺(tái)子清理干凈， 刀片最好洗凈滅菌， 總之一句話就是保證切下的帶沒有外源 DNA虧染。2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所

10、在位置的膠全部回收。 為了減少膠的體積， 可以用 相對(duì)比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3. 關(guān)于防護(hù)， 在一般有機(jī)玻璃后就足夠了， 戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛， 如果你戴 樹脂眼鏡就可以了。4. 瓊脂糖對(duì)回收率有一定影響， 如果瓊脂糖較多， 可以增加溶膠液， 保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對(duì)于小于10 Obp的片段回收，可加至30%異丙醇。5. 如果是用PAG創(chuàng)收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要 將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用 X片，未標(biāo)記的用EB6. 選用回收效率較高的柱子，

11、比如進(jìn)口的 Qiaquick spin column 。7. 參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。附注：1 影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1）DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等， 電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密 的電泳快（超螺旋 線性DNA2）瓊脂糖濃度：logU=logUO Krt膠濃度，U為遷移率，U0為DNA的自由電泳 遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgar

12、ose: 0.5% : 1-30 kb ; 0.7% : 0.8-12 kb1.2%: 0.4-7 kb ; 1.5%: 0.2-3 kb.3）DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀 線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。4）所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。 使分辨效 果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過 5V/cm5）堿基組成與溫度：一般影響不大 4 -30 C6）嵌入染料的存在：降低線性 DNA遷移率，（不提倡加在電泳液中）7）電泳緩沖液 （0.5 X TBE的組成及其離子強(qiáng)度影響 DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝