第14章多倍體與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

1、第第1414章章多倍體與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多倍體與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物14.1 多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物動(dòng)物多倍體比較少，原因：動(dòng)物多倍體比較少，原因：（1 1）高等動(dòng)物遠(yuǎn)源雜交能力很弱，很難形高等動(dòng)物遠(yuǎn)源雜交能力很弱，很難形成雜種個(gè)體；成雜種個(gè)體；（2 2）多倍體動(dòng)物高度不育，染色體異常通多倍體動(dòng)物高度不育，染色體異常通常會(huì)千萬(wàn)胚胎死亡，很難得到多倍體后代。常會(huì)千萬(wàn)胚胎死亡，很難得到多倍體后代。 但但低等脊椎動(dòng)物如魚類、兩棲類和爬低等脊椎動(dòng)物如魚類、兩棲類和爬行類中存在行類中存在。14.1 多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物多倍體水產(chǎn)動(dòng)物的研究多倍體水產(chǎn)動(dòng)物的研究目的目的（1）提高生長(zhǎng)速度（2）控制過(guò)度繁殖（3）延長(zhǎng)壽命（4）

2、改善品質(zhì)（5）合理開(kāi)發(fā)漁業(yè)資源14.1 多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物多倍體培育在動(dòng)物遺傳育種上具有重要多倍體培育在動(dòng)物遺傳育種上具有重要意義意義例如： 三倍體鮑魚具有不育性，其性腺發(fā)育程度應(yīng)低于二倍體，生長(zhǎng)方面的能量相對(duì)增加，增強(qiáng)了鮑魚的抗逆性抗逆性和抗病能力抗病能力，提高了生長(zhǎng)速度生長(zhǎng)速度和品質(zhì)品質(zhì)。 三倍體鯉魚、三倍體牡蠣肉質(zhì)更加鮮美肉質(zhì)更加鮮美 大麻哈魚、鮮魚產(chǎn)卵后死亡，其三倍體不育，可避免死亡避免死亡。多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物 魚類精子入卵的時(shí)期是第二次減數(shù)分裂的中期，刺激卵子繼續(xù)完成第二次分裂。卵中原有的二組染色體中一組作為第二極體排出受精卵成為正常的二倍體。如果在精子入卵時(shí)第二極體不能正常排出

3、，則精卵原核結(jié)合成為三倍體受精卵。多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物 如果卵子受精后，照常排出第二極體形如果卵子受精后，照常排出第二極體形成成單倍體卵單倍體卵，單倍的卵原核與，單倍的卵原核與單倍的精單倍的精原核原核結(jié)合就形成二倍的受精卵，這時(shí)再結(jié)合就形成二倍的受精卵，這時(shí)再抑制受精卵的第一次卵裂抑制受精卵的第一次卵裂，則產(chǎn)生，則產(chǎn)生四倍四倍體體。多倍體動(dòng)物多倍體動(dòng)物 產(chǎn)生原理產(chǎn)生原理：染色體的加倍可以通過(guò)保留：染色體的加倍可以通過(guò)保留受精卵第二極體即受精卵第二極體即抑制卵子的第二次成抑制卵子的第二次成熟分裂熟分裂或或抑制受精卵的第一次卵裂抑制受精卵的第一次卵裂來(lái)實(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體

4、動(dòng)物培育方法A 物理方法物理方法機(jī)制主要是通過(guò)機(jī)制主要是通過(guò)破壞微管形成破壞微管形成，使由微管，使由微管蛋白聚合成的微管解體或阻止微管的聚合蛋白聚合成的微管解體或阻止微管的聚合過(guò)程，過(guò)程，使染色體失去移動(dòng)的動(dòng)力，人為抑使染色體失去移動(dòng)的動(dòng)力，人為抑制染色體向兩極移動(dòng)制染色體向兩極移動(dòng)，形成多倍體細(xì)胞。，形成多倍體細(xì)胞。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體動(dòng)物培育方法（1 1）溫度休克法）溫度休克法：即用略高于或略低于致死溫：即用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體三倍體( (抑制第二極體排抑制第二極體排放放) )或或四倍體四倍體( (抑制第一次卵裂抑制第一次卵裂) )

5、的方法。根據(jù)處的方法。根據(jù)處理溫度的高低分為理溫度的高低分為熱休克法和冷休克法熱休克法和冷休克法。一般。一般冷冷水性魚類如蛙科魚類，宜用熱休克，溫度范圍為水性魚類如蛙科魚類，宜用熱休克，溫度范圍為28-3628-36; ;溫水性魚類宜用冷休克，溫度范圍為溫水性魚類宜用冷休克，溫度范圍為0-50-5左右左右。 優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：簡(jiǎn)便、廉價(jià)，但誘導(dǎo)率較低。簡(jiǎn)便、廉價(jià)，但誘導(dǎo)率較低。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體動(dòng)物培育方法（2 2）水靜壓法）水靜壓法：采用較高的水靜壓（如采用較高的水靜壓（如65kg/cm65kg/cm2 2）可抑制）可抑制卵母細(xì)胞第二極體的釋卵母細(xì)胞第二極體的釋放或放或者抑制第一

6、次卵裂誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體的者抑制第一次卵裂誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體的方法。方法。 原理：靜水壓處理破壞了有絲分裂器中原理：靜水壓處理破壞了有絲分裂器中的的紡錘絲即紡錘體和星體紡錘絲即紡錘體和星體，從而暫時(shí)阻，從而暫時(shí)阻斷了有絲分裂的進(jìn)程。斷了有絲分裂的進(jìn)程。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體動(dòng)物培育方法 該方法處理程序標(biāo)準(zhǔn)化該方法處理程序標(biāo)準(zhǔn)化易于掌握易于掌握，處理時(shí)間短，處理時(shí)間短(3-5min)(3-5min)，誘導(dǎo)率較高，對(duì)受精卵損傷較小誘導(dǎo)率較高，對(duì)受精卵損傷較小。 但需但需專門的設(shè)備專門的設(shè)備如水壓機(jī)等。此外，靜水壓處如水壓機(jī)等。此外，靜水壓處理還使理還使染色體染色體發(fā)生了不同程度的凝縮發(fā)生了不同程

7、度的凝縮, ,還可能還可能使使受精卵的結(jié)構(gòu)受精卵的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些物理和化學(xué)變化，造發(fā)生某些物理和化學(xué)變化，造成發(fā)育受阻，因此在生產(chǎn)中應(yīng)用較少。成發(fā)育受阻，因此在生產(chǎn)中應(yīng)用較少。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體動(dòng)物培育方法B B 化學(xué)法化學(xué)法 細(xì)胞松弛素誘導(dǎo)法細(xì)胞松弛素誘導(dǎo)法：細(xì)胞松弛素：細(xì)胞松弛素B(B(CBCB) )導(dǎo)致導(dǎo)致極體的保留是通過(guò)極體的保留是通過(guò)阻止卵子微絲環(huán)的收縮和極阻止卵子微絲環(huán)的收縮和極體的分離體的分離來(lái)實(shí)現(xiàn)的。來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CBCB處理比其他方法能更有處理比其他方法能更有效地誘導(dǎo)效地誘導(dǎo)三倍體三倍體的形成。的形成。B B 化學(xué)法化學(xué)法 6-6-甲氨基嘌呤誘導(dǎo)法甲氨基嘌呤誘導(dǎo)法：

8、6DMAP6DMAP 是一種蛋是一種蛋白激素酶抑制劑。當(dāng)白激素酶抑制劑。當(dāng)6DMAP 6DMAP 與微管蛋白二聚與微管蛋白二聚體結(jié)合以后體結(jié)合以后對(duì)微管正常的結(jié)構(gòu)和功能起到了抗對(duì)微管正常的結(jié)構(gòu)和功能起到了抗有絲分裂的作用，因此可以產(chǎn)生三倍體有絲分裂的作用，因此可以產(chǎn)生三倍體?；瘜W(xué)法缺點(diǎn)：化學(xué)法缺點(diǎn)：成功率較低，且對(duì)胚胎及操作者有成功率較低，且對(duì)胚胎及操作者有毒性，影響存活。毒性，影響存活。1 1 多倍體動(dòng)物培育方法多倍體動(dòng)物培育方法C C 生物法：主要是遠(yuǎn)緣雜交法生物法：主要是遠(yuǎn)緣雜交法 瑞齊（瑞齊（RaschRasch）等于）等于19651965首先證明了三倍首先證明了三倍體脊椎動(dòng)物可通過(guò)四

9、倍體個(gè)體與二倍體體脊椎動(dòng)物可通過(guò)四倍體個(gè)體與二倍體個(gè)體雜交產(chǎn)生。個(gè)體雜交產(chǎn)生。2 2 多倍體動(dòng)物的鑒定多倍體動(dòng)物的鑒定 人工誘導(dǎo)處理過(guò)的群體可能是由多倍體、人工誘導(dǎo)處理過(guò)的群體可能是由多倍體、二倍體甚至是多倍體與二倍體構(gòu)成的嵌二倍體甚至是多倍體與二倍體構(gòu)成的嵌合體等合體等混合群體混合群體，所以需要篩選出需要，所以需要篩選出需要的多倍體。的多倍體。2 2 多倍體動(dòng)物的鑒定多倍體動(dòng)物的鑒定（1 1）染色體計(jì)數(shù)法：）染色體計(jì)數(shù)法：將細(xì)胞固定制片、將細(xì)胞固定制片、染色后染色后觀察染色體個(gè)數(shù)觀察染色體個(gè)數(shù)。由于染色體制片技術(shù)比較成熟，。由于染色體制片技術(shù)比較成熟，因此該方法仍是目前鑒定多倍體倍性的因此該

10、方法仍是目前鑒定多倍體倍性的一種直觀、一種直觀、可靠的方法可靠的方法，缺點(diǎn)，缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)。是比較費(fèi)時(shí)。（2 2）核仁染色觀察法）核仁染色觀察法：一般而言，細(xì)胞：一般而言，細(xì)胞核仁數(shù)核仁數(shù)量與染色體組數(shù)目（倍性）成正比例量與染色體組數(shù)目（倍性）成正比例，通過(guò)，通過(guò)銀染銀染法法檢測(cè)胚胎細(xì)胞核仁數(shù)量及分布情況可以鑒定多檢測(cè)胚胎細(xì)胞核仁數(shù)量及分布情況可以鑒定多倍體，直觀、可靠。倍體，直觀、可靠。2 2 多倍體動(dòng)物的鑒定多倍體動(dòng)物的鑒定（3 3）核體積測(cè)量法）核體積測(cè)量法：一般而言，：一般而言，細(xì)胞核大小與細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成比例，染色體數(shù)目成比例，為了維持恒定的核質(zhì)比例，為了維持恒定的核質(zhì)比例，

11、隨著細(xì)胞核的增大，細(xì)胞大小也按比例增加。因隨著細(xì)胞核的增大，細(xì)胞大小也按比例增加。因此此多倍體細(xì)胞及細(xì)胞核通常要比二倍體大一些多倍體細(xì)胞及細(xì)胞核通常要比二倍體大一些。一般通過(guò)一般通過(guò)測(cè)定紅細(xì)胞核體積測(cè)定紅細(xì)胞核體積的大小可以鑒定染色的大小可以鑒定染色體的倍性。缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確性不高。體的倍性。缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確性不高。2 2 多倍體動(dòng)物的鑒定多倍體動(dòng)物的鑒定（4 4）DNADNA含量測(cè)定：染色體組數(shù)與含量測(cè)定：染色體組數(shù)與DNADNA含量成正含量成正比。比。測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的DNADNA含量，含量，根據(jù)細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞DNADNA比較比較來(lái)推斷出細(xì)胞的倍性。如果發(fā)現(xiàn)雜種的來(lái)推斷出細(xì)

12、胞的倍性。如果發(fā)現(xiàn)雜種的DNADNA含量含量是其親本的一倍半，就可以確定這些雜種是三倍是其親本的一倍半，就可以確定這些雜種是三倍體。體。DNADNA含量測(cè)定法快速準(zhǔn)確，能測(cè)出嵌合體，含量測(cè)定法快速準(zhǔn)確，能測(cè)出嵌合體，但是缺點(diǎn)是需要專門儀器。但是缺點(diǎn)是需要專門儀器。14.2 14.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animaltransgenic animal）：是指在）：是指在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合外源基因，并且外源基因可基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的基因工程動(dòng)物。以穩(wěn)定地遺傳給后代的基因工程動(dòng)物。 利用利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人

13、類藥用蛋白、異體器官轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人類藥用蛋白、異體器官等非常規(guī)畜牧產(chǎn)品，是目前世界上轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等非常規(guī)畜牧產(chǎn)品，是目前世界上轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的熱點(diǎn)之一。研究的熱點(diǎn)之一。2.2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法（1）原核原核期胚胎期胚胎顯微注顯微注射法射法 原理原理：對(duì)受精卵的原核進(jìn)行對(duì)受精卵的原核進(jìn)行DNADNA注射，獲注射，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)便，技術(shù)要求相對(duì)較優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)便，技術(shù)要求相對(duì)較低，周期較短。低，周期較短。2.2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法原核期胚胎原核期胚胎顯微注顯微注射法射法：幾百：幾百KBKB大片段、大片段、應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 目

14、的目的DNADNA制備（無(wú)需構(gòu)建載體）制備（無(wú)需構(gòu)建載體） DNADNA注入原核胚（受精卵雄核）注入原核胚（受精卵雄核） 胚胎體外培養(yǎng)胚胎體外培養(yǎng) 胚胎移植（移植前鑒定）胚胎移植（移植前鑒定） 發(fā)育發(fā)育 出生、鑒定出生、鑒定 1 1顯微注射法顯微注射法受精卵顯微注射胚胎移植后定檢測(cè)顯微注射法操作流程1. 外源基因整合至基因組的效率很低，對(duì)經(jīng)濟(jì)外源基因整合至基因組的效率很低，對(duì)經(jīng)濟(jì)大動(dòng)物（猴、牛、羊）的整合效率更低；大動(dòng)物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2. 隨機(jī)整合，轉(zhuǎn)基因整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)無(wú)法隨機(jī)整合，轉(zhuǎn)基因整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)無(wú)法控制，造成轉(zhuǎn)基因的表達(dá)差異很大，篩選高控制，造成轉(zhuǎn)基因的表達(dá)差異

15、很大，篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工作量很大；表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工作量很大；3. 對(duì)經(jīng)濟(jì)大動(dòng)物，由于需要大量的供體和受體，對(duì)經(jīng)濟(jì)大動(dòng)物，由于需要大量的供體和受體，耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，受到很大的限制。耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，受到很大的限制。 2.2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法 19801980年年，GordonGordon等人首先育成等人首先育成轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素基因轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素基因小鼠小鼠。世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 生長(zhǎng)速度快生長(zhǎng)速度快2 24 4倍、體形大一倍的轉(zhuǎn)基因倍、體形大一倍的轉(zhuǎn)基因“碩碩鼠鼠”發(fā)表在發(fā)表在19821982年的年的naturenature雜志上。雜志上。2.2.轉(zhuǎn)基因

16、動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法（2）胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞方法方法 胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞（ESES）是一種含正常二倍染色體的）是一種含正常二倍染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，因此只要，因此只要將外源將外源DNADNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞就可以實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。就可以實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。胚胎干細(xì)胞法建立轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序 干細(xì)胞（干細(xì)胞（stem cells）：是細(xì)胞譜系分化中最原）：是細(xì)胞譜系分化中最原始的細(xì)胞，能終身自我更新，并具有多分化潛始的細(xì)胞，能終身自我更新，并具有多分化潛能，能增殖分化為特定的組織細(xì)胞。能，能增殖分化為特定的組織細(xì)胞。 胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞（em

17、bryonic stem cells, ES）：從）：從著床前的哺乳類胚胎中分離的多能干細(xì)胞，具著床前的哺乳類胚胎中分離的多能干細(xì)胞，具有在體外不分化的增殖能力，經(jīng)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)有在體外不分化的增殖能力，經(jīng)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍具有分化成后仍具有分化成3種胚層的發(fā)育潛能。種胚層的發(fā)育潛能。 19561956年，年，WhittenWhitten培養(yǎng)成功小鼠的受精卵，在體外發(fā)育成囊胚；培養(yǎng)成功小鼠的受精卵，在體外發(fā)育成囊胚；19581958年，年，McLarenMcLaren經(jīng)胚胎移植，體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生小鼠個(gè)體；經(jīng)胚胎移植，體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生小鼠個(gè)體；19651965年，年，BrinsterBrinst

18、er建立了胚胎的微滴培養(yǎng)技術(shù)；建立了胚胎的微滴培養(yǎng)技術(shù)；19681968年，年，GardnerGardner將分離的細(xì)胞注入囊胚，獲得嵌合鼠將分離的細(xì)胞注入囊胚，獲得嵌合鼠; ;19701970年，年，StevenSteven分離成功小鼠的胚胎瘤細(xì)胞；分離成功小鼠的胚胎瘤細(xì)胞；19811981年，年， Martin Evans Martin Evans 從正常的小鼠囊胚中分離成功從正常的小鼠囊胚中分離成功ESES細(xì)胞；細(xì)胞；19841984年，年，BradleyBradley證實(shí)注射入囊胚的小鼠證實(shí)注射入囊胚的小鼠ESES細(xì)胞可分化為成體的各種細(xì)胞可分化為成體的各種組織，并組織，并整合入生殖系

19、整合入生殖系。意義：里程碑，與同源重組技術(shù)的結(jié)合使得在整體水平定向改變和意義：里程碑，與同源重組技術(shù)的結(jié)合使得在整體水平定向改變和修飾哺乳動(dòng)物的遺傳特性成為可能修飾哺乳動(dòng)物的遺傳特性成為可能 19951995年，年，ThomsonThomson從恒河猴中分離了猴的從恒河猴中分離了猴的ESES細(xì)胞；細(xì)胞；19981998年，年，ThomsonThomson從人的囊胚中分離成功人的從人的囊胚中分離成功人的ESES細(xì)胞；細(xì)胞；20002000年，年，BongsoBongso等建立了人的等建立了人的ESES細(xì)胞株細(xì)胞株 與傳統(tǒng)育種方法相比較，與傳統(tǒng)育種方法相比較，ESES細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因

20、動(dòng)物方面表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：因動(dòng)物方面表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1 1）打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限）打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制，加快了動(dòng)物群體遺傳變異程度；制，加快了動(dòng)物群體遺傳變異程度；（2 2）可以進(jìn)行定向變異和育種，利用同源重組）可以進(jìn)行定向變異和育種，利用同源重組技術(shù)對(duì)技術(shù)對(duì)ESES細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，通過(guò)細(xì)胞核移植細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，通過(guò)細(xì)胞核移植生產(chǎn)遺傳修飾性動(dòng)物，有可能創(chuàng)造新的物種；生產(chǎn)遺傳修飾性動(dòng)物，有可能創(chuàng)造新的物種；（3 3）利用）利用ESES細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平對(duì)胚胎進(jìn)細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平對(duì)胚胎進(jìn)行早期選擇，這樣可以提高選擇的準(zhǔn)確性，縮行早期選擇，這樣可以提

21、高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種時(shí)間。近年來(lái)的研究表明，利用短育種時(shí)間。近年來(lái)的研究表明，利用ESES細(xì)胞細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)揮著極為重要生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)揮著極為重要的作用。的作用。（3 3）精子載體法：）精子載體法：精子與外源精子與外源DNADNA混合培養(yǎng)，混合培養(yǎng)，DNADNA可被吸收進(jìn)入精子頭部，可被吸收進(jìn)入精子頭部，然后再與卵細(xì)胞受然后再與卵細(xì)胞受精后發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物精后發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 主要問(wèn)題：重復(fù)性不好主要問(wèn)題：重復(fù)性不好2.2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法精子與外源精子與外源DNADNA結(jié)合的機(jī)理結(jié)合的機(jī)理精子直接與外源精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)混合

22、培養(yǎng)，外源基因，外源基因可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。后來(lái)后來(lái)RottmanRottman對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源DNADNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與脂質(zhì)體與DNADNA相互作用形成脂質(zhì)體相互作用形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 2 2. .轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法(4)(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法法原理：當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病原理

23、：當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的毒的RNA RNA 進(jìn)入細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成DNA DNA ，依靠，依靠逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其末端特異的核苷及其末端特異的核苷酸序列，轉(zhuǎn)錄出的酸序列，轉(zhuǎn)錄出的DNADNA可整合到染色體上，可整合到染色體上，從而將其所攜帶的外從而將其所攜帶的外源基因插入到染色體源基因插入到染色體上。上。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝整合。法的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝整合。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：逆

24、轉(zhuǎn)錄病毒載體在設(shè)計(jì)時(shí)雖然缺失了病逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在設(shè)計(jì)時(shí)雖然缺失了病毒的復(fù)制功能序列，但是復(fù)制大量載體毒的復(fù)制功能序列，但是復(fù)制大量載體DNADNA所需所需的輔助病毒基因組內(nèi)有可能與目的基因一起整的輔助病毒基因組內(nèi)有可能與目的基因一起整合到同一細(xì)胞核中，就可能大量復(fù)制病毒，造合到同一細(xì)胞核中，就可能大量復(fù)制病毒，造成嚴(yán)重的污染，故不安全。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒成嚴(yán)重的污染，故不安全。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNADNA（10kb10kb），），而且逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的甲基化狀態(tài)常使而且逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺失。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺

25、失。2 2. .轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育方法（5 5）卵細(xì)胞顯微注射）卵細(xì)胞顯微注射法法 將將外源外源DNADNA克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，再顯微注射到再顯微注射到M IIM II中期卵細(xì)胞（無(wú)核中期卵細(xì)胞（無(wú)核膜），膜），再體外受精，胚胎移植，發(fā)育再體外受精，胚胎移植，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)內(nèi)首例綠色熒光蛋白東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因”克隆克隆豬豬 綠色綠色熒光蛋白豬胎兒成纖維細(xì)胞克隆熒光蛋白豬胎兒成纖維細(xì)胞克隆Chapter 14細(xì)胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights

26、reserved.Genetically modified animalhttp:/ fluorescent fish, the first geneticallymodified animal to be sold as a pet3 3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定 目的基因目的基因的鑒定：的鑒定：檢查動(dòng)物體內(nèi)是否有外源基檢查動(dòng)物體內(nèi)是否有外源基因因的存在的存在，以判明是否是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？捎?，以判明是否是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。可用聚聚合酶鏈反應(yīng)合酶鏈反應(yīng)(PCR)(PCR)、斑點(diǎn)雜交、斑點(diǎn)雜交(Dot blot), (Dot blot), SouthernSouthern印跡印跡分析分析等多種方法進(jìn)

27、行檢測(cè)。等多種方法進(jìn)行檢測(cè)。3 3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定 目的蛋白目的蛋白的鑒定：有活性的目的蛋白的的鑒定：有活性的目的蛋白的檢測(cè)非常重要。檢測(cè)方法主要有：檢測(cè)非常重要。檢測(cè)方法主要有：(1) SDS(1) SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠( (SDS-PAGESDS-PAGE) )(2) (2) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( (ELISAELISA) )(3) (3) WesternWestern印跡分析印跡分析4 4 轉(zhuǎn)基因改良動(dòng)物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因改良動(dòng)物的應(yīng)用（1 1）快速生長(zhǎng)與肉質(zhì)改善）快速生長(zhǎng)與肉質(zhì)改善。 如如轉(zhuǎn)生長(zhǎng)素基因的豬生長(zhǎng)快，瘦肉率也高轉(zhuǎn)生長(zhǎng)素基因的豬生長(zhǎng)快，瘦肉

28、率也高。 比利時(shí)比利時(shí)藍(lán)牛肌肉增加表型藍(lán)牛肌肉增加表型 皮埃蒙特牛肌肉增加表型皮埃蒙特牛肌肉增加表型 美培育轉(zhuǎn)基因鱒魚：腹肌有美培育轉(zhuǎn)基因鱒魚：腹肌有6 6塊塊, ,肉多肉多15%15% 4 4 轉(zhuǎn)基因改良動(dòng)物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因改良動(dòng)物的應(yīng)用（2 2）增加羊毛產(chǎn)量和性能。）增加羊毛產(chǎn)量和性能。 細(xì)菌基因細(xì)菌基因SATSAT和和DASDAS可以促進(jìn)合成可以促進(jìn)合成CysCys，將該基，將該基因轉(zhuǎn)入羊腸胃道上皮細(xì)胞，可提高羊毛產(chǎn)量。因轉(zhuǎn)入羊腸胃道上皮細(xì)胞，可提高羊毛產(chǎn)量。 若將毛角蛋白若將毛角蛋白IIII中間細(xì)絲基因轉(zhuǎn)入綿羊基因組中間細(xì)絲基因轉(zhuǎn)入綿羊基因組中，所產(chǎn)羊毛光澤亮麗、毛脂含量高暖和。中，所產(chǎn)羊

29、毛光澤亮麗、毛脂含量高暖和。（3 3）抗凍動(dòng)物品種培育。）抗凍動(dòng)物品種培育。 將魚抗凍蛋白基因?qū)Ⅳ~抗凍蛋白基因AFPAFP轉(zhuǎn)入不耐寒魚或其他動(dòng)轉(zhuǎn)入不耐寒魚或其他動(dòng)物。物。 一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactorbioreactor），），幾乎任何有生幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過(guò)人為馴化為命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過(guò)人為馴化為生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器, ,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得獲

30、得 例如例如，乳腺、膀胱、血液乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器, ,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器的研究的研究最為引人注目。最為引人注目。5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器 乳腺是最理想乳腺是最理想的藥物蛋白生產(chǎn)的藥物蛋白生產(chǎn)場(chǎng)所場(chǎng)所（1 1）概念概念將將外源基因外源基因置于置于特異性特異性調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)序列之下序列之下，使之，使之在在乳腺中乳腺中表達(dá)，表達(dá)，然后

31、然后通過(guò)通過(guò)回收回收乳汁乳汁獲得獲得重要重要價(jià)值價(jià)值的的生物活性生物活性蛋白蛋白的技術(shù)。的技術(shù)。5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器 1987 1987 年年Gordon Gordon 等將等將組織型纖溶酶原組織型纖溶酶原激活劑激活劑(tPA)(tPA)與小鼠乳清酸蛋白與小鼠乳清酸蛋白(WAP)(WAP)基因的啟動(dòng)子構(gòu)基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組成重組基因，成功地培育出了基因，成功地培育出了3737只在乳汁中能只在乳汁中能表達(dá)表達(dá)tPA tPA 的轉(zhuǎn)基因小的轉(zhuǎn)基因小鼠鼠。 20062006年年6 6月月2 2日，日，世界上第一個(gè)世界上第一個(gè)利用利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺乳腺生物反

32、應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物重組人重組人抗凝血酶抗凝血酶（商品名：（商品名：ATryn ATryn ）上市）上市獲得獲得批準(zhǔn)批準(zhǔn)。5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器 目前，目前，1-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(AAT)(AAT)、人乳球蛋白、人乳球蛋白、凝血因子凝血因子IIIIII、IVIV、VIIIVIII、纖維蛋白原、降、纖維蛋白原、降鈣素、鈣素、SODSOD、紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素、IGF-1IGF-1等成功等成功表達(dá)，多種藥用蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階表達(dá)，多種藥用蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。段。5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所：a) 1998年中國(guó)首頭轉(zhuǎn)基因羊。乳汁中表達(dá)人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治療血友病的藥物。b) 1999年，帶有人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀苯瞪?。攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管牛牛“滔滔滔滔” 1998年上海醫(yī)學(xué)研究所與復(fù)旦大學(xué)遺傳所合作獲得在乳腺腫表達(dá)有生物活性的人凝血因子IX轉(zhuǎn)基因山羊5 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳