傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)ppt課件

1、傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 1.2n掌握無菌操作技術(shù)。掌握無菌操作技術(shù)。n了解傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。n了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。n了解培養(yǎng)液配制方法。了解培養(yǎng)液配制方法。n了解倒置顯微鏡的使用。了解倒置顯微鏡的使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅簩?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?.4實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：n細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以

2、觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。還可以利用培養(yǎng)細(xì)胞制備染色體，分抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。還可以利用培養(yǎng)細(xì)胞制備染色體，分析外界因素（如理化因素）對細(xì)胞的影響，研究細(xì)胞癌變等等。在細(xì)胞培養(yǎng)的基析外界因素（如理化因素）對細(xì)胞的影響，研究細(xì)胞癌變等等。在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展了細(xì)胞融合、細(xì)胞雜交等細(xì)胞工程技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)。礎(chǔ)上發(fā)展了細(xì)胞融合、細(xì)胞雜交等細(xì)胞工程技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)。5n動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從有機(jī)體獲取的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從有機(jī)體獲取的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)是原代培養(yǎng)，若將培養(yǎng)細(xì)胞洗

3、脫后轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行在培養(yǎng)叫做傳代培養(yǎng)。是原代培養(yǎng)，若將培養(yǎng)細(xì)胞洗脫后轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行在培養(yǎng)叫做傳代培養(yǎng)。n目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)達(dá)到一個(gè)新的階段：從不同分化組織衍生得到的許目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)達(dá)到一個(gè)新的階段：從不同分化組織衍生得到的許多類型的細(xì)胞能夠成功地在培養(yǎng)液中生長、反復(fù)傳代。在維持一個(gè)獨(dú)特細(xì)胞系長達(dá)多類型的細(xì)胞能夠成功地在培養(yǎng)液中生長、反復(fù)傳代。在維持一個(gè)獨(dú)特細(xì)胞系長達(dá)數(shù)月的過程中，記錄下細(xì)胞的倍增次數(shù)和生長速率是很有用的，以便在合適的時(shí)間數(shù)月的過程中，記錄下細(xì)胞的倍增次數(shù)和生長速率是很有用的，以便在合適的時(shí)間傳代以及在體外生活是中不同時(shí)間凍存細(xì)胞。傳代以及在體

4、外生活是中不同時(shí)間凍存細(xì)胞。6實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：* * 早期細(xì)胞培養(yǎng)，依靠的是精湛的操作技術(shù)和盡可能的靠近火焰一達(dá)到細(xì)胞的早期細(xì)胞培養(yǎng)，依靠的是精湛的操作技術(shù)和盡可能的靠近火焰一達(dá)到細(xì)胞的無菌化。無菌化。* * 目前，超凈臺是使工作臺無菌化最經(jīng)濟(jì)有效的手段。目前，超凈臺是使工作臺無菌化最經(jīng)濟(jì)有效的手段。 （1）超凈臺的選擇，應(yīng)選擇層流超凈臺。不能選擇平流超凈臺。超凈臺應(yīng)）超凈臺的選擇，應(yīng)選擇層流超凈臺。不能選擇平流超凈臺。超凈臺應(yīng)該盡可能的安裝紫外燈。該盡可能的安裝紫外燈。 （2）超凈臺的維護(hù)，超凈臺的）超凈臺的維護(hù)，超凈臺的HEPA過濾層應(yīng)該每一年或一年后由認(rèn)可的過濾層應(yīng)該每一年或一年后由

5、認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行維修。機(jī)構(gòu)進(jìn)行維修。1.工作環(huán)境及表面的處理（超凈臺的使用）工作環(huán)境及表面的處理（超凈臺的使用）7（3）使用超凈臺的方法，在每次使用前，應(yīng)用紫外燈照）使用超凈臺的方法，在每次使用前，應(yīng)用紫外燈照30分鐘。首先打開吹風(fēng)分鐘。首先打開吹風(fēng)的開關(guān)，在關(guān)掉紫外燈，打開日光燈。點(diǎn)燃酒精燈，開始操作。的開關(guān)，在關(guān)掉紫外燈，打開日光燈。點(diǎn)燃酒精燈，開始操作。（4）超凈臺表面的處理。）超凈臺表面的處理。a. 應(yīng)做到每日清潔，以使操作中濺出的培養(yǎng)液或其它液體及時(shí)被清除而不蓄積，應(yīng)做到每日清潔，以使操作中濺出的培養(yǎng)液或其它液體及時(shí)被清除而不蓄積，達(dá)到杜絕細(xì)菌和真菌繁殖的目的。達(dá)到杜絕細(xì)菌和真菌繁殖的

6、目的。b. 工作臺中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必須物應(yīng)當(dāng)除去。工作臺中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必須物應(yīng)當(dāng)除去。c. 日常的清潔工作包括：用日常的清潔工作包括：用70%的酒精或的酒精或10%的新潔而滅擦洗工作臺。用固定的新潔而滅擦洗工作臺。用固定的容器裝廢棄液。的容器裝廢棄液。892.細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理n用于細(xì)胞培養(yǎng)的器材包括：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板，吸管，各種瓶子等。用于細(xì)胞培養(yǎng)的器材包括：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板，吸管，各種瓶子等。n目前，上述器材均可以從商家買到無菌一次性的用品。但是，成本太高。目前，上述器材均可以從商家買到

7、無菌一次性的用品。但是，成本太高。n玻璃器材，經(jīng)過濕熱或者干熱滅菌后可以反復(fù)使用。玻璃器材，經(jīng)過濕熱或者干熱滅菌后可以反復(fù)使用。n不宜進(jìn)行高溫高壓滅菌的器材，可以浸泡在不宜進(jìn)行高溫高壓滅菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中進(jìn)行消毒，并在超乙醇中進(jìn)行消毒，并在超凈臺上吹干。凈臺上吹干。103.實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)n無菌操作的原則：無菌操作的原則：保證細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)部以及吸管包裹保證細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)部以及吸管包裹層等內(nèi)部的無菌狀態(tài)。層等內(nèi)部的無菌狀態(tài)。n細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工作間里進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工

8、作間里進(jìn)行。n培養(yǎng)液或其它溶液不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。培養(yǎng)液或其它溶液不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。n裝吸管或吸頭的容器也不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。裝吸管或吸頭的容器也不應(yīng)該在工作區(qū)以外打開。n細(xì)胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機(jī)械移液裝置移取。切勿采用口吸的方法?？谖羌?xì)胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機(jī)械移液裝置移取。切勿采用口吸的方法?？谖亲畲蟮奈⑸镂廴驹矗匾氖羌?xì)胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入的方式及入最大的微生物污染源，更重要的是細(xì)胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入的方式及入人體，可能對研究人員造成傷害。人體，可能對研究人員造成傷害。n細(xì)胞培養(yǎng)瓶在超凈臺中打開后，瓶蓋應(yīng)扣在工作臺上。細(xì)胞培養(yǎng)瓶在超凈臺中打開

9、后，瓶蓋應(yīng)扣在工作臺上。11n如果培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)被污染，切勿直接倒掉，應(yīng)高壓滅菌后倒掉處理。如果培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)被污染，切勿直接倒掉，應(yīng)高壓滅菌后倒掉處理。n濕潤的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的濕度，濕潤的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的濕度，然而托盤本身及可導(dǎo)致各種細(xì)菌和真菌的污染，這種污染還可能存在與培養(yǎng)箱壁然而托盤本身及可導(dǎo)致各種細(xì)菌和真菌的污染，這種污染還可能存在與培養(yǎng)箱壁上和提供氣體的管道上。應(yīng)該定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行加熱處理。也可以采用上和提供氣體的管道上。應(yīng)該定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行加熱處理。也可以采用70%乙乙醇擦洗表面，并定期更換輸送醇擦

10、洗表面，并定期更換輸送CO2管道，并將該管子浸泡與管道，并將該管子浸泡與20%的含氯漂白劑的含氯漂白劑中消毒。中消毒。n為了防止交叉污染，原則上超凈臺中應(yīng)不同時(shí)進(jìn)行二種細(xì)胞系或細(xì)胞株的操作。為了防止交叉污染，原則上超凈臺中應(yīng)不同時(shí)進(jìn)行二種細(xì)胞系或細(xì)胞株的操作。n不應(yīng)用的細(xì)胞應(yīng)及時(shí)丟棄處理，不應(yīng)繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中不予理睬。不應(yīng)用的細(xì)胞應(yīng)及時(shí)丟棄處理，不應(yīng)繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中不予理睬。124.細(xì)胞的處理以及維持細(xì)胞生長所需培養(yǎng)液的無菌處理。細(xì)胞的處理以及維持細(xì)胞生長所需培養(yǎng)液的無菌處理。n基本培養(yǎng)液基本培養(yǎng)液由必須氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖和作為生長因子、激由必須氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖和

11、作為生長因子、激素和貼壁因子來源的血清組成。一般用碳酸氫鈉（素和貼壁因子來源的血清組成。一般用碳酸氫鈉（NaHCONaHCO3 3) )體系進(jìn)行緩沖。體系進(jìn)行緩沖。n細(xì)胞的生長不僅產(chǎn)生細(xì)胞的生長不僅產(chǎn)生COCO2 2，也需要也需要COCO2 2才能生存。所以，細(xì)胞的培養(yǎng)需要子在才能生存。所以，細(xì)胞的培養(yǎng)需要子在COCO2 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中nCOCO2 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中COCO2 2的濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉平衡。如果的濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉平衡。如果COCO2 2的濃度為的濃度為5%5%，則配培養(yǎng)液中應(yīng)加入則配培養(yǎng)液中應(yīng)加入1.97g/L1.97g/L的碳酸氫鈉。的碳酸氫鈉。n培養(yǎng)瓶蓋應(yīng)

12、輕輕的擰上，不要完全擰死，以保證氣體的交換。培養(yǎng)瓶蓋應(yīng)輕輕的擰上，不要完全擰死，以保證氣體的交換。n培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的pHpH值應(yīng)為值應(yīng)為7.27.2至至7.47.4。13n培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的pHpH值應(yīng)為值應(yīng)為7.27.2至至7.47.4。n高密度細(xì)胞使細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖耗竭并產(chǎn)生高密度細(xì)胞使細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖耗竭并產(chǎn)生COCO2 2和乳酸，在含酚紅作為指示的和乳酸，在含酚紅作為指示的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液將從紅色變?yōu)槌壬?。?xì)胞培養(yǎng)液長時(shí)間貯藏在培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液將從紅色變?yōu)槌壬?。?xì)胞培養(yǎng)液長時(shí)間貯藏在4 4C C冰箱中，冰箱中，會使培養(yǎng)液的會使培養(yǎng)液的pHpH值產(chǎn)生變化，變堿，是培養(yǎng)液的顏色呈深品紅紫

13、色。應(yīng)用時(shí)可值產(chǎn)生變化，變堿，是培養(yǎng)液的顏色呈深品紅紫色。應(yīng)用時(shí)可用用HepesHepes（N-2-N-2-羥乙基哌嗪羥乙基哌嗪-N-N-2-2-乙磺酸）調(diào)整。乙磺酸）調(diào)整。n可以向培養(yǎng)液中加入抗生素，比如青霉素，鏈霉素，慶大霉素等，抑制由于操可以向培養(yǎng)液中加入抗生素，比如青霉素，鏈霉素，慶大霉素等，抑制由于操作中的微小失誤而導(dǎo)致的低水平的感染。但是，有時(shí)由于抗生素的加入，也會作中的微小失誤而導(dǎo)致的低水平的感染。但是，有時(shí)由于抗生素的加入，也會使感染不易被迅速發(fā)現(xiàn)。使感染不易被迅速發(fā)現(xiàn)。14培養(yǎng)液的配制：培養(yǎng)液的配制：n商家一般以三種形式提供培養(yǎng)液：商家一般以三種形式提供培養(yǎng)液：1.1.粉末劑

14、粉末劑 （需要實(shí)驗(yàn)著配制）（需要實(shí)驗(yàn)著配制）2.2.濃縮裝濃縮裝（用無菌水稀釋即可）（用無菌水稀釋即可）3.3.無需進(jìn)一步處理的工作液形式。由于粉末劑是其無需進(jìn)一步處理的工作液形式。由于粉末劑是其中最便宜的一種，一般實(shí)驗(yàn)室較多采用。中最便宜的一種，一般實(shí)驗(yàn)室較多采用。n配制培養(yǎng)液需要濾菌裝置：除菌器、真空泵以及配制培養(yǎng)液需要濾菌裝置：除菌器、真空泵以及0.45m0.45m或或0.22 m0.22 m的濾膜。的濾膜。n培養(yǎng)液應(yīng)貯藏在培養(yǎng)液應(yīng)貯藏在4 4C C冰箱中。冰箱中。n配好的培養(yǎng)液應(yīng)在無抗菌素的無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每次配好后留樣，培配好的培養(yǎng)液應(yīng)在無抗菌素的無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每次配好后留

15、樣，培養(yǎng)養(yǎng)7272小時(shí)，觀察培養(yǎng)液確實(shí)沒有污染后使用。小時(shí)，觀察培養(yǎng)液確實(shí)沒有污染后使用。15學(xué)習(xí)傳代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)學(xué)習(xí)傳代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)n本次試驗(yàn)應(yīng)用本次試驗(yàn)應(yīng)用HeLa細(xì)胞或細(xì)胞或A375-S2細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。nHeLa 細(xì)胞：人子宮頸癌細(xì)胞株細(xì)胞：人子宮頸癌細(xì)胞株nA375-S2細(xì)胞：人黑色素瘤細(xì)胞株細(xì)胞：人黑色素瘤細(xì)胞株16操作前的準(zhǔn)備（超凈臺內(nèi)物品擺放）17實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：n每組的超凈臺中有以下物品：每組的超凈臺中有以下物品：n1. 20mlRPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液1瓶；瓶；1-2ml小牛血清（小牛血清（FCS) 1瓶；瓶；2ml胰蛋白酶胰蛋白酶 1瓶；瓶

16、；1ml谷氨酰胺谷氨酰胺 1瓶；瓶；1ml Hepes 1瓶；瓶；PBS(-)1 瓶瓶n2. 1ml ，200l移液器各移液器各1支；槍頭盒支；槍頭盒2個(gè)個(gè)n鑷子鑷子1把，小燒杯把，小燒杯1個(gè)；酒精燈個(gè)；酒精燈1臺；臺；n培養(yǎng)好細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)好細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)個(gè)18操作前準(zhǔn)備（酒精燈）19試驗(yàn)操作步驟：試驗(yàn)操作步驟： 1.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。20212.倒掉原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入倒掉原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入5mlPBS(-)洗滌洗滌2次。次。3.加入胰蛋白酶加入胰蛋白酶300-500l，迅速前后旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，迅速前后

17、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被次，以便胰蛋白酶包被所有細(xì)胞，于所有細(xì)胞，于37C 培養(yǎng)箱中或手心孵育培養(yǎng)箱中或手心孵育5分鐘，消化細(xì)胞分鐘，消化細(xì)胞224.在顯微鏡下觀察，細(xì)胞變化。待到細(xì)胞變?yōu)榍蛐危形磸呐囵B(yǎng)瓶壁上脫落下來時(shí)，用在顯微鏡下觀察，細(xì)胞變化。待到細(xì)胞變?yōu)榍蛐危形磸呐囵B(yǎng)瓶壁上脫落下來時(shí)，用手輕敲打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，加入細(xì)胞培養(yǎng)液手輕敲打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，加入細(xì)胞培養(yǎng)液2-5ml。23246.倒入倒入50ml離心筒中，再向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入離心筒中，再向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml培養(yǎng)液洗滌，再一并倒入培養(yǎng)液洗滌，再一并倒入離心筒中，離心筒中，2000轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)離心，10分鐘。分鐘。257.取出離心管，倒掉上清液，在桌面上輕敲離心筒，使沉降在離心筒底的細(xì)胞取出離心管，倒掉上