自噬在心肌缺血再灌注損傷中的不同作用研究

1、自噬在心肌缺血再灌注損傷中的不同作用研究 南方醫(yī)科大學級博士學位論文自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的不同作用/課題來源:國家自然科學基金廣東省自然科學基金團隊項目專 業(yè) 名 稱科一一學位申請人指 導 教 師羲一爵一答辯委員會主席圳一徘一一誹答辯委員會成員 李自成一一一一一黃巧冰程繼東劉世明論文評閱人 蘇磊張文清黃巧冰邱健余細勇程繼東日廣州年月/四博士學位論丈自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的不同作用博士研究生:徐秋林指導教師:廖禹林賓建平摘要研究背景冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脈狹窄引起心肌缺血甚至心肌梗死心梗與病死率密切相關(guān),缺血時間越長,心梗面積越大,患者預(yù)后越差。盡快恢復(fù)心肌灌注

2、,挽救瀕死心肌,防止梗死擴大是急性心梗的基本治療原則。然而,再灌注會引起再灌注損傷/ ,/損傷。/損傷的機制包括氧自由基生成增加、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細胞凋亡、內(nèi)皮細胞活化和損傷以及自噬等。其中自噬是目前研究的熱點,被認為在心肌缺血.再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。自噬是溶酶體介導的對長命蛋白質(zhì)和損傷細胞器進行回收的過程,對線粒體等細胞器的降解和周轉(zhuǎn)起關(guān)鍵作用。在/時,細胞內(nèi)減少以及激活的蛋白激酶? ,活性增高均可激活自噬信號通路。另外,唯域蛋白的表達上調(diào)、細胞內(nèi)鈣離子濃度增加、活性氧分子,、過量的一氧化氮、線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔的開放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng) ,等均可促進心肌細胞

3、的自噬。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 ,信號通路、/依賴的蛋白激酶通路、胰島素/生長因子信號通路以及.通路調(diào)節(jié)著自噬活性。在真核細胞中,雷帕摘要霉素可抑制而激活自噬,而一甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通過抑制磷脂酰肌醇激酶 ,而抑制自噬。線粒體是心肌細胞總含量最豐富的細胞器,其對于維持細胞功能非常重要。心肌細胞/會導致線粒體功能障礙,主要表現(xiàn)為線粒體膜電位除極化以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔,開放。線粒體功能障礙可以使心肌減少,氧自由基生成以及促凋亡蛋白釋放,造成細胞死亡。氧自由基又可以進一步加重線粒體損傷,形成惡性循環(huán)。線粒體膜電位除極化、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放以及氧自由基均可激活自噬,后者清除損傷的線粒體,

4、從而挽救瀕死的心肌細胞。然而,當自噬過度激活時,自噬可過度清除細胞內(nèi)的細胞器,從而引起細胞自噬性死亡。大量文獻報道在心肌細胞缺氧/復(fù)氧/,/以及心肌/時,自噬活性上調(diào)。但在/或/的時程與自噬活性的關(guān)系上存在爭議。有研究認為缺血或缺氧時間過短不改變自噬活性,也有報告顯示缺血抑制而再灌注上調(diào)自噬活性,甚至有研究提出缺血期的自噬增強保護心肌,而再灌注期的自噬增強則損害心肌。多數(shù)研究報告嚙齒類動物缺血超過和/或再灌注時間超過均可促進心肌細胞的自噬。不少研究認為自噬的增強對缺血心肌有保護作用,但同樣也有不少研究認為自噬加重心肌損傷。關(guān)于自噬在/的作用之所以會產(chǎn)生如此大的分歧,可能與實驗設(shè)計和研究于段的局

5、限性有關(guān)。文獻報道的相關(guān)研究,多是對單一/狀態(tài)下的集中研究,而沒有對不同/狀態(tài)下自噬功能作用進行比較性研究。比如,輕度和重度/損傷時,自噬增強所產(chǎn)生的作用未必是一樣的。我們設(shè)想,過低或過高的自噬可能都是有害的,那么用基因敲除和過表達的研究于段得出的結(jié)果應(yīng)該謹慎解釋。如果能確定心肌/損傷時自噬的“安全范圍”,則有望操控自噬活性來達到治療目的。研究目的博士學位論文在新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)的/模型和小鼠心肌/模型中,觀察不同的缺氧時間和缺血時間對自噬活性的影響,并用自噬增強劑雷帕霉素和自噬抑制劑渥曼青霉素調(diào)節(jié)自噬,來研究自噬在心肌細胞/及心肌/中的作用及其機制,借此闡明自噬在/損傷中的作用機制,為心肌

6、的/損傷提供有效的治療靶點。方法.離體研究分離.日齡乳鼠中心肌細胞,按常規(guī)進行原代培養(yǎng),做下列檢測:,法檢測細胞生存,.二甲基.噻唑基,.率,設(shè)對照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,置于缺氧孵箱中分別缺氧、比色,于分光光度儀下測吸光度值,比較各組細和,然后復(fù)氧,胞生存率變化。凋亡檢測將心肌細胞接種于激光共聚焦小皿,設(shè)對照組、雷帕霉素和渥曼青霉素組,藥物預(yù)處理后,置于缺氧孵箱中分別缺氧、和,復(fù)氧。用 染核,檢測心肌細胞凋亡率。檢測自噬將細胞接種于孔板或激光共聚焦小皿,單丹磺酰尸胺,染色后用激光共聚焦檢測其熒光信號,定量分析自噬活性;或?qū)⒓毎靡让赶?、離心后用戊二醛固定,電鏡檢測其中自噬體形成;或提

7、取細胞總蛋白,用免疫印跡 分別檢測.和的表達水平。檢測開放,將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細,漂洗次,胞共孵育后,磷酸鹽緩沖液胰酶消化后,用等體積含%胎牛血清/終止消化,流式細胞儀檢測其熒光強度。激光共聚焦檢測:將鈣黃綠素和氯化鉆與心肌細胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦檢測。線粒體膜電位除極化檢測:將.探針與心肌細胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦檢測線粒體膜電位除極化水甲。摘要.在體研究在動物水平上,將.周齡/小鼠分為對照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,腹腔注射藥物后,麻醉,人工呼吸,左側(cè)第肋間開胸,暴露心臟,結(jié)扎左冠狀動脈,分別缺血后松開結(jié)扎,恢復(fù)冠脈灌注。假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎。觀察指標:酶聯(lián)免疫吸附實

8、驗?法檢測血清乳酸脫氫酶 ,、,一氯化三苯基四氮唑,法測定心梗面積、超聲檢查左室內(nèi)徑和收縮功能、免疫印跡及電鏡檢查自噬水平。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤±表示,統(tǒng)計分析采用 .軟,兩兩比較采用法。計量資料用件完成,多重比較采用.卡方檢驗。.被認為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果.心肌細胞自噬活性隨缺氧時間延長而增強和自噬體上的酸性物質(zhì)結(jié)合顯示為藍色,在自噬形成的時候會聚集成團塊狀。我們發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長,心肌細胞中藍色顆粒數(shù)量及面積均顯著增多.。在電鏡觀察下,自噬體為特有的雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)含有損傷的細胞器。結(jié)果顯示,細胞內(nèi)的自噬體數(shù)量隨著缺氧時間延長而明顯增加尸. 用檢測.和時發(fā)現(xiàn),缺氧使.和

9、蛋白表達量顯著增加。.干預(yù)自噬對/心肌細胞生存的影響將藥物預(yù)處理心肌細胞后,分別進行缺氧.后復(fù)氧。在缺氧時,心肌細胞存活率顯著下降,自噬增強劑雷帕霉素增加缺氧心肌細胞的存活率,而自噬抑制劑渥曼青霉素則降低細胞存活率。而在缺氧時,雷帕霉素降低心肌細胞存活率,渥曼青霉素則改善細胞生存率。博士學位論文.干預(yù)自噬對/心肌細胞凋亡和自噬性死亡的影響用 來染核,凋亡細胞核固縮,被染成亮藍色。在非用藥的/組,隨著缺氧時間延長,凋亡細胞核逐漸增加。在常氧組,雷帕霉素和渥曼青霉素對細胞凋亡率無影響。但是將心肌細胞缺氧、,復(fù)氧組,雷帕霉素處理組均可使一肌細胞凋亡率下降,而渥曼青霉素增加凋亡。然而用電鏡觀察細胞自噬

10、性死亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺氧的/組,雷帕霉素和渥曼青霉素對自噬性死亡無明顯影響,而在缺氧的/組,雷帕霉素增加自噬性死亡,渥曼青霉素則抑制之。.干預(yù)自噬對線粒體功能的影響用鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法來檢測心肌細胞開放情況,隨著缺氧時間延長,流式細胞儀檢測到的線粒體平均熒光強度下降,表明心肌細胞線粒體轉(zhuǎn)換孔開放增加。用激光共聚焦檢測細胞內(nèi)綠色熒光強度,增加則表明開放降低,線粒體功能穩(wěn)定。結(jié)果與流式細胞儀檢測結(jié)果一致。熒光探針.可以作為線粒體膜電位的指示劑,其紅/綠熒光的比值可以反應(yīng)線粒體膜電位的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長,線粒體紅/綠熒光比值逐漸下降,表明線粒體膜電位除極化增加。雷帕霉素和渥曼

11、青霉素不明顯改變常氧心肌細胞的開放程度。在輕度缺氧時,雷帕霉素可降低的開放,而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧的/組,雷帕霉素由于增強自噬而導致線粒體數(shù)量減少,從而降低線粒體內(nèi)的熒光強度,而渥曼青霉素仍會繼續(xù)增加的開放。.干預(yù)自噬對/心肌細胞釋放及心梗面積的影響小鼠心肌缺血及,再灌注時,加上缺血共三組,心/組,雷帕霉素可顯著縮小心梗梗面積和血清依次增加。在缺血面積、減少的釋放,渥曼青霉素的作用效果相反。在缺血組,雷帕摘要霉素反而增加心梗面積,而渥曼青霉素則縮小之。電鏡檢測顯示各組的自噬水平也是依次增加,雷帕霉素增加心肌細胞自噬,而渥曼青霉素則抑制之。結(jié)論.缺氧或缺血時間延長可導致心肌細胞自噬活性增

12、強,提示自噬活性與損傷程度關(guān)聯(lián)。.在自噬水甲較低時,適當增加自噬對心肌細胞起保護作用,其機制可能與促進細胞垃圾清除,降低線粒體轉(zhuǎn)換孔的開放,從而抑制細胞凋亡有關(guān)。.在細胞損傷嚴重,自噬活性較強的情況下,進一步增加自噬可促進自噬性細胞死亡,而抑制自噬反而能增加心肌存活、限制梗塞面積。關(guān)鍵詞:自噬;凋亡;缺血.再灌注損傷;缺氧.復(fù)氧;線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔;線粒體膜電位博士學位論文 :;:. /. . . , ./, , . /., ? ? , / ,. ., ,.,/? / 一,. ,. / . ,.,., ., ./ /,/ /.,博士學位論文. . . /., / ./. ./ / /.: .:

13、 .:,. ., , ,【一,一一一一,一 】.:. . : 一 , .:, .: , ,一. / /., .:.博士學位論文. ,一.?,. .,. , . ./, . /, ./ . . /. , , ./ . , , . 一. / , . 博士學位論文./,./ , , . /? / / ./ , .,. .,. , ./ / . ., .¨:; ;?;博士學位論文目 錄摘要目錄?.前言?. 日吾材料與方法?.實驗動物及材料?主要試劑的配制?.主要實驗儀器實驗方法.統(tǒng)計學分析?.結(jié)果?.一. :木?.討論?.結(jié)論.參考文獻縮寫詞簡表?.致射?.博士研究生期間發(fā)表論文情況學位論文

14、原創(chuàng)性聲明統(tǒng)計學審稿證明?博士學位論文前言.缺血.再灌注損傷是急性心梗治療后常見的損傷機制冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,年全球有萬人死于心血管疾病,占全部死亡人數(shù)的%,其中冠心病引起的死亡人數(shù)達萬。另外,據(jù)估計,到年,心血管疾病的死亡人數(shù)可以達到萬人。因而,在今后相當長的一段時間內(nèi),冠心病是引起死亡的首要原因。在美國,每年有約萬人患急性心肌梗塞,另有約萬人因為各種心臟手術(shù)而出現(xiàn)心臟停博。冠心病的發(fā)病機制是由于脂質(zhì)代謝異常,血液中的脂質(zhì)沉著在原本光滑的冠狀動脈內(nèi)膜上,在動脈內(nèi)膜一些類似粥樣的脂類物質(zhì)堆積而成白色斑塊,這些斑塊漸漸增多造成動脈腔狹窄,使血流受阻,導致心

15、臟缺血,產(chǎn)生心絞痛。如果動脈壁上的斑塊形成潰瘍或破裂,就會形成血栓,使整個血管血流完全中斷,發(fā)生急性心肌梗死,甚至猝死。冠心病的少見發(fā)病機制是冠狀動脈痙攣血管可以沒有粥樣硬化,產(chǎn)生變異性心絞痛,如果痙攣超過分鐘,也會導致急性心肌梗死甚至猝死。研究表明,心肌缺血的時間與心肌梗死的面積和患者的病死率密切相關(guān),缺血時間越長,心肌梗塞面積越大,患者預(yù)后越差。因而,治療原則是盡快搶救恢復(fù)心肌的血液灌注,以挽救瀕死心肌,防止梗死擴大或縮小心肌缺血范圍,保護和維持心臟功能,及時處理并發(fā)癥。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)、溶栓等各種治療缺血性心臟病方法的廣泛開展,的病死率已經(jīng)得到很大下降。然而

16、由于絕大部分事件發(fā)生在院外,患者往往因為無法及時到達醫(yī)院而錯過開通梗塞血管的最佳時機;另外,在醫(yī)療資源缺乏的偏遠地區(qū)或者一些醫(yī)療條件較差的發(fā)展中國家,梗塞心肌的再灌注也成為一個困難的問題。因而,如何在心肌缺血的情況下減少心肌梗死面積、延緩心肌梗死速度,盡可能的保護心臟的功能具有非常重要的意義。另外,對前言于那些即使能夠及時接受介入或者藥物溶栓治療使得梗塞冠脈再通的患者,哪怕其心肌缺血時間非常短,心臟再灌注后的心功能恢復(fù)仍然不如預(yù)期的那么好。很多患者再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化及血管無復(fù)流等現(xiàn)象。這主要是由于心肌缺血后的再灌注損傷所引起的。心肌缺

17、血再灌注損傷,/損傷是指心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重、甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。后來的研究發(fā)現(xiàn),心臟的/損傷涉及多種分子和細胞機制,包括氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細胞凋亡、內(nèi)皮細胞活化和損傷以及自噬等。其中自噬是目前研究的熱點,被認為在心肌缺血.再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。.自噬在心肌缺血.再灌注損傷中的作用及其機制自噬是生物進化過程中形成的在溶酶體內(nèi)降解細胞質(zhì)成分的一種保守生理過程。正常情況下,它通過不問斷的回收細胞的成分,如長壽命蛋損傷細胞器來對細胞進行修復(fù),維持生命的延續(xù)。許多生物過程都涉及到自噬,例如,細胞分化、組織重塑、生長控制、細胞防御,以及適應(yīng)不合適的

18、外部環(huán)境。根據(jù)細胞質(zhì)內(nèi)的成分進入溶酶體的方式可將自噬分為三種類型:巨自噬,是指小的細胞質(zhì)和細胞器螫合在雙層膜空泡上,即自噬體,被運輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解;微自噬,是細胞質(zhì)直接被溶酶體包裹消化;分子伴侶介導的自噬,指溶酶體表面的受體選擇性地與胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合并介導其進入溶酶體腔內(nèi)。通常所說的自噬為巨自噬。在真核細胞生物中,自噬受著嚴格信號調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)的參與真核細胞自噬調(diào)控的信號通路如下:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,信號通路有兩個功能不同的蛋白復(fù)合體,和。其中是雷帕霉素的靶蛋白,在自噬的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。在博士學位論文營養(yǎng)豐富的情況下,被激活而抑制自噬;當營養(yǎng)缺乏時,被抑制而激活自噬。對自噬的調(diào)節(jié)主

19、要通過下列兩個途徑來調(diào)節(jié)自噬:首先是調(diào)節(jié)?激酶復(fù)合體的形成,后者可以增加自噬活性;其次,通過作用于其下游靶蛋白來調(diào)控自噬。例如通過對的磷酸化來調(diào)節(jié)自噬活性。在哺乳動物中,蛋白對自噬的調(diào)控更加復(fù)雜,它不僅受細胞的營養(yǎng)狀況調(diào)控,還受激素的調(diào)控,如胰島素受體、胰島素受體底物和、以及/,。/依賴的蛋白激酶通路/在營養(yǎng)豐富的情況下,種酶和激活腺苷環(huán)化酶生成,后者與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合,使其與的個催化亞單位、和解離,導致激活,從而抑制自噬。對自噬的調(diào)節(jié)可能與其對自噬相關(guān)蛋白、和磷酸化相關(guān)。胰島素/生長因子信號通路即使在營養(yǎng)豐富的情況下,當細胞外的生長因子減少時,自噬被激活。在高等真核生物中,激素對自噬的調(diào)節(jié)與營

20、養(yǎng)不同,但是它們最終在處匯合。胰島素和胰島素樣生長因子可以通過 來調(diào)節(jié)。當激素缺乏時,失活,從而激活自噬。通路當細胞內(nèi)能量缺乏時,/比值下降,通過使激活?；罨囊?復(fù)合體的激活,后者通過抑制,從而激活自噬。另外在激素缺乏或營養(yǎng)缺乏的情況下,.通路還可以磷酸化激活。,從而激活自噬,抑制細胞凋亡。前言其它途徑另外,各種應(yīng)激反應(yīng)也均可激活自噬,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、氧化應(yīng)激以及病原體感染。正常情況下,機體的絕大部分細胞都維持著基礎(chǔ)的自噬活性。另外,自噬可以被細胞外如營養(yǎng)缺乏、缺氧以及高溫等和細胞內(nèi)的應(yīng)激如損傷或者多余細胞器的聚集所激活。在一些疾病狀態(tài)下,如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、病原體入侵以及肌肉和肝

21、臟功能失調(diào)等均可激活自噬。自噬可發(fā)揮著有害和有益的作用,即細胞保護和細胞損傷的雙重作用。在凋亡的過程中,自噬的激活具有保護作用;但同時,自噬又可以引起另一種類型的程序性細胞死亡,白噬性細胞死亡,也稱為型細胞死亡。事實上,過度自噬會破壞細胞質(zhì)和細胞器的主要成分,如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而導致整個細胞功能的崩潰, 自噬性細胞死亡同細胞凋亡和壞死的不同之處在于,不具備核濃縮、半胱天冬酶活化、片段化及細胞腫脹。自噬在心臟中也發(fā)揮著重要的作用。心衰和心肌肥厚均可誘導激活心肌細胞自噬。大量文獻報道在心肌/中自噬活性增強。最初,在對胚胎小鼠心臟進行缺氧和無糖培養(yǎng)及再灌注時發(fā)現(xiàn)心肌自噬增強。隨后研究發(fā)現(xiàn)在灌注的兔

22、心臟中,缺血不足以誘導自噬,而在再灌注時自噬才升高。但是缺血時間延長為時白噬增高,再灌注后自噬進一步升高。這表明依均可增高自噬等發(fā)現(xiàn),在模型中,缺血,再灌注可以導致自噬的顯著升高。在對培養(yǎng)的心肌細胞進行缺氧/復(fù)氧/,處理時也同樣發(fā)現(xiàn)自噬活性的增強。盡管關(guān)于心肌/中自噬的研究較多,自噬的作用仍不明確。很多研究認為自噬增強在心肌/可能導致細胞死亡。等發(fā)現(xiàn),無糖培養(yǎng)的心肌細胞自噬增強的同時細胞死亡增加,而使用.甲基腺嘌呤.,和抑制自噬后可以減少細胞死亡,提示自噬可以導致細胞死亡螺。博士學位論文另有研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的心肌細胞進行/刺激時,通過下調(diào) 表達或者使用抑制自噬可以減少細胞死亡,。然而等的研究發(fā)

23、現(xiàn),自噬在缺血過程中起保護作用,而在再灌注時起損傷作用。另外,等在壓力負荷的心衰模型中發(fā)現(xiàn)自噬活性增強可導致細胞死亡。另外,也有很多文獻報道自噬在/中起著有益的作用, 。等在豬慢性心肌缺血實驗中發(fā)現(xiàn),自噬作用的增強能使細胞凋亡率下降,而發(fā)生凋亡的細胞中自噬受到抑制。在培養(yǎng)的心肌細胞模擬/模型中,等發(fā)現(xiàn),在葡萄糖剝奪培養(yǎng)的心肌細胞中,抑制自噬可以增加細胞死亡。在.心肌細胞中,下調(diào)自噬基因或 表達可以抑制自噬,同時也導致/誘導的細胞凋亡增加,而過表達則增強自噬,使細胞凋亡率下降。在/過程中,線粒體蛋白被激活,誘導自噬作用上調(diào),通過自噬對損傷線粒體的降解而對抗細胞凋亡的誘導。人們公認的短暫的輕度缺血

24、預(yù)處理 ,能夠減輕隨后嚴重的缺血損傷,而且發(fā)現(xiàn)能誘導自噬。如果抑制自噬,則的保護作用就會消除。另外,雷帕霉素、他汀類藥物等能夠有力地誘導自噬,對抗/損傷,縮小心肌梗死范圍,從而產(chǎn)生保護作用。因此,盡管目前對心肌/自噬的研究較多,自噬究竟發(fā)揮著什么樣的作用仍無定論。.自噬與線粒體損傷之間的關(guān)系心肌能量耗竭是心衰的主要病理生理機制之一。線粒體是提供能量的最主要場所,線粒體損傷使能量產(chǎn)生不足,促使心功能進一步惡化。另外,線粒體損傷在細胞凋亡中起決定性作用,而心肌細胞凋亡是心力衰竭的重要機制。線粒體損傷的主要表現(xiàn)之一是線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔開放,使膜通透性增高,從而促進細胞凋亡和自噬。,具有折疊蛋白、維持

25、鈣穩(wěn)態(tài)及脂質(zhì)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前言物合成等功能。氧化應(yīng)激、缺血等刺激可引起未折疊或錯誤折疊蛋白的過度聚集,從而導致功能障礙,這個過程被稱為應(yīng)激。應(yīng)激可觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng),激活一組信號通路來處理未折疊或錯誤折疊的。適度的通過增加位于的伴侶蛋白來抑制新的蛋白質(zhì)合成并加速降解未折疊和錯誤折疊蛋白,有利于維持細胞正常功能。但持續(xù)或嚴重的則觸發(fā)相應(yīng)的細胞凋亡信號通路,如果發(fā)生在心臟,則促進心哀的發(fā)生和發(fā)展。線粒體損傷、自噬和應(yīng)激三者之間有緊密的聯(lián)系。應(yīng)激與線粒體損傷相互關(guān)聯(lián):信號可以激活和誘導包括、在內(nèi)的多種促凋亡蛋白質(zhì),并能激活信號通路。而、表達量的上調(diào)會引起線粒體膜通透性增高,膜電位除極,導致線粒體依賴的細

26、胞凋亡。可以磷酸化、來增強其促凋亡活性。另外,還可以上調(diào)促凋亡因子/的表達,是一個轉(zhuǎn)錄因子,可以抑制一和上調(diào)的表達。而促凋亡蛋白、可以與伐結(jié)合,激活的通路,基因敲除/則的底物及其靶基因表達下降 應(yīng)激與自噬的關(guān)系:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是自噬體膜的主要來源?？偟膩碚f,應(yīng)激是很強的自噬誘導因子。信號中的、通路均可激活自噬,而通路則負向調(diào)節(jié)自噬活性。自噬的激活可以幫助降解聚集的蛋白質(zhì),減輕應(yīng)激。線粒體損傷與自噬的關(guān)系:自噬通過清除損傷的線粒體來防止細胞內(nèi)的聚集。在多種刺激的作用下,線粒體膜的通透性發(fā)生改變,發(fā)生電位除極,除極化的線粒體膜可以通過線粒體激酶或信號通路來引起線粒體自噬。線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孑 ,開放可誘導

27、自噬,而抑制劑環(huán)雹素可阻止自噬弱,表明線粒體通透性增高與自噬有關(guān)。四有待解決的問題及我們的假設(shè)博士學位論文雖然離體和在體研究都觀察到心肌瓜時心肌細胞自噬水平增高,但對其產(chǎn)生何種功能性作用并不清楚。關(guān)于自噬在心臟中的作用仍然有很多需要回答的問題。有可能存在不同的信號通路來觸發(fā)促進與細胞存活和死亡相關(guān)的自噬。因此,有必要探明在什么條件下自噬促進細胞生和死及其相關(guān)機制。雖然有證據(jù)表明線粒體損傷、自噬之間存在相互聯(lián)系,但很少有研究對將二者聯(lián)系在一起的信號系統(tǒng)進行探索?；陬愃频倪壿?我們假設(shè)在/時適度的自噬水甲對心肌有保護作用,而過低和過高的自噬均會加重心肌損傷。其可能機制是適度自噬可清除受損的蛋白質(zhì)

28、和細胞器,有利于維持細胞的正常功能:自噬水甲過低會使受損的蛋白質(zhì)和細胞器不能被及時清除,造成蓄積而加重心肌損傷;過度自噬則可能會使功能正常的蛋白質(zhì)分子及細胞器被清除,也會加重心肌損傷。我們設(shè)想在輕度瓜損傷如/時間較短時,自噬增強會激活細胞存活的信號通路;相反,嚴重的/損傷如長時間缺血后再灌注,則可能會由于長期過度的自噬激活使正常的細胞器和蛋白質(zhì)過度自我消化而促進細胞死亡;而大量的心肌細胞喪失時導致心哀的重要原因。材料與方法材料與方法實驗動物及材料.實驗動物/雄性小鼠周,體重約?,共只。 新生大鼠天共只。由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。.主要實驗試劑/,美國胎牛血清,美國,單丹磺酰尸胺,美國,美

29、國,美國化學發(fā)光液,提取試劑盒,美國,日本 試劑盒,日本,美國、抗體、一、抗體公司,美國;凋亡試劑盒 ,中國鈣黃綠素,美國一,美國蛋白定量試劑盒博士德,中國標記的抗兔二抗,主要試劑的配制磷酸鹽緩沖液 ,:在蒸餾水中溶解博士學位論文、. 和.、. ,用調(diào)節(jié)溶液的值至.,加水定容至,在高壓下蒸氣滅菌,保存于室溫。.乙酸緩沖液:堿,./冰乙酸.,./.加蒸餾水至。,加入雙蒸水,。保存一周。最好現(xiàn)用%過硫酸銨:.現(xiàn)配。配制:堿,./冰乙酸.,./.加蒸餾水至。.,?配制:取 .溶解于單蒸水,定容至.,充分混勻。,加入膠原消化液:膠原酶, ,溶于?液,用孔徑為.濾器過濾后即配即用。缺氧液:., .,?

30、., .,.,加雙蒸水定容為.,乳酸鈉.,用雙蒸水溶解,調(diào)整,高壓滅菌于保存。復(fù)氧液:., ., .,? .,., ., .,葡萄糖.,用雙蒸水溶解,調(diào).,加雙蒸水定容為,高壓滅菌于保存。整主要實驗儀器冷光源廣州奧元儀器公司,中國小動物呼吸機公司,美國多導生理記錄系統(tǒng)埃德公司,澳大利亞于術(shù)顯微鏡廣州奧元儀器公司,中國高清攝像系統(tǒng),日本多光譜微孔板閱讀器 ,材料與方法倒置熒光顯微鏡,微量/定量儀、水平瓊脂糖凝膠電泳儀和恒溫水浴箱,瑞典;干轉(zhuǎn)膜儀,美國熒光定量儀,美國圖像工作站,美國;凝膠成像分析儀,法國;一,德國;超聲儀 超凈工作臺蘇州凈化儀器廠,中國;二氧化碳孵箱 ,德國;低溫高速離心機,美國

31、;,瑞典;半干轉(zhuǎn)膜儀一高壓火菌器 .,日本;臺式計 ,美國;制冰機 .,;超純水制備系統(tǒng),英國;缺氧裝置,;顯微外科于術(shù)器材、。實驗方法.原代心肌細胞的分離和培養(yǎng)新生大鼠,%酒精消毒,用眼科剪從劍突下沿胸骨左緣剪開胸廓,用眼科鑷取出心臟,于?液中漂洗三次,將血液漂洗干凈,輕輕將心臟撕裂.次,裂而不斷的程度即可。將心臟轉(zhuǎn)移至血清瓶,按每個心臟.加入 .%胰酶/,于過夜。往過夜消化的心臟中加入含%胎牛血清/每個心臟.,博士學位論文置于。恒溫搖床,。棄上清,加入配制的膠原酶消化液每個心臟.,置于恒溫搖床,。棄上清,加入膠原酶消化液每個心臟.,置于。恒溫振蕩器上攪拌,將上清轉(zhuǎn)移到無菌試管中。上清即為含

32、心肌細胞的混懸液。重復(fù)步驟次。將上清離心。將上清分種在直徑的培養(yǎng)皿中平均每.個心臟消化的細胞接種個平皿,。,%常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中。此時%成纖維細胞及少量心肌細胞貼壁生長。將含心肌細胞的上清轉(zhuǎn)移至無菌試管中,并用含%胎牛血清/漂洗.次,以充分回收心肌細胞。將細胞計數(shù)后按實驗需要分別接種激光共聚焦小皿、孔板及孔板。.實驗將分離的乳鼠心肌細胞按接種子孔板,培養(yǎng)小時后用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時。分離的原代心肌細胞培養(yǎng)小時后,用不含血清的/培養(yǎng)小時,分別加入不同濃度雷帕霉素和渥曼青霉素。培養(yǎng)后吸去培養(yǎng)基,漂洗次,加入缺氧液后置于含%氧氣,%的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)、。在相應(yīng)的時間點將孔板取出,吸去

33、上清,加復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)后更換為含%胎牛血清/培養(yǎng)?？装逯屑尤?后去培養(yǎng)液,加入,震蕩。用分光光度儀于波長處讀取值,以加有培養(yǎng)液的空白孔為對照。材料與方法重復(fù)上述實驗次,取次測得的實驗值進行統(tǒng)計分析。.檢測心肌細胞自噬將分離的乳鼠心肌細胞按/皿接種于激光共聚焦小皿,培養(yǎng)小時后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時。去培養(yǎng)基,用不含血清的/培養(yǎng)小時,去培養(yǎng)基,加入缺氧液后置于含%氧氣,%的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)、。去缺氧液,加復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)后,加入.州,。孵育。加入漂洗次。%多聚甲醛固定。漂洗次在倒置熒光顯微鏡下,用.波長激發(fā)光觀察細胞內(nèi)的自噬顆粒,軟件分析結(jié)果。并用. 檢測細胞凋亡取潔凈蓋玻片在%

34、/醇中浸泡分鐘,無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的或.%等溶液洗滌三遍,再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入細胞培養(yǎng)過夜,使約為%一%滿。刺激細胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入.固定液,固定分鐘或更長時間可。過夜。去固定液,用或.%洗兩遍,每次分鐘,吸盡液體。洗滌時宜用搖床,或手動晃動。加入. 染色液,染色分鐘。也宜用搖床,或于動晃動數(shù)次。博士學位論文去染色液,用或.%洗兩遍,每次分鐘,吸盡液體。洗滌時宜用搖床,或于動晃動。滴一滴抗熒光淬火封片液于載玻片上,蓋上貼有細胞的蓋玻片,讓細胞接觸封片液,盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長左右,發(fā)射波長壽右。.流式細胞術(shù)檢測心

35、肌細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放將分離的乳鼠心肌細胞按/接種于直徑為 ,培養(yǎng)小時后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對照組,缺氧組心肌細胞加入缺氧液,將心肌細胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。更換復(fù)氧液,%常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入鈣黃綠素、氯化鈷,。漂洗次。加入.%胰酶/ 室溫放置約,顯微鏡下觀察到大多數(shù)貼壁心肌細胞漂浮起來。加入.含有%胎牛血清的/,用吸管輕輕將貼壁心肌細胞管。吹打起來,轉(zhuǎn)移到.離心。用.重懸心肌細胞,混勻后,取加入到孔板中,用流式細胞儀進行檢測。.激光共聚焦檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放材料與方法將分離的乳鼠心肌細胞

36、按.×/接種于激光共聚焦玻底小皿,培養(yǎng)小時后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對照組,缺氧組心肌細胞加入缺氧液,將心肌細胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。更換復(fù)氧液,%常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入鈣黃綠素、氯化鈷,。漂沈次。激光共聚焦顯微鏡檢測鈣黃綠素的熒光,激發(fā)光,發(fā)射光。軟件分析其熒光強度。用.激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位本研究采用.探針來指示線粒體膜電位。.是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時,.聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒

37、光;在線粒體膜電位較低時,.不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時.為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。將分離的乳鼠心肌細胞按.×/接種于激光共聚焦玻底,培養(yǎng)小時后,用含%胎牛血清的/換液,繼續(xù)培養(yǎng)小時。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培養(yǎng),去培養(yǎng)基,用洗次。設(shè)常氧對照組,缺氧組心肌細胞加入缺氧液,將心肌細胞缺氧孵箱中培養(yǎng)、。博士學位論文更換復(fù)氧液,%常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中。去復(fù)氧液,漂洗次,先后加入.熒光探針,。漂洗次。激光共聚焦顯微鏡檢測鈣黃綠素的熒光,激發(fā)光波長為,發(fā)射光波軟件分析其兩種熒光的強度,

38、長為綠光和紅光。用計算/比值。.小鼠心梗及心肌缺血一再灌注模型的建立/雄性小鼠,.周齡,.。隨機分為如下組:假手術(shù)組;假手術(shù)雷帕霉素組;假手術(shù)渥曼青霉素組;/ 缺血時間雷帕霉素組;/ 渥曼青霉素組;,再灌;/缺血時間,再灌;/雷帕霉素組;/渥曼青霉素組;心梗組缺血;心梗雷帕霉素組:心梗渥曼青霉素組。對于藥物治療組,術(shù)前腹腔注射雷帕霉素./或渥曼青霉素./。圖.小鼠心肌/模型的建立和實驗設(shè)施/ . .模型建立見圖:戊巴比妥鈉麻醉/,將小鼠四肢及頭部固定在手術(shù)臺上,氣管插管,接小動物呼吸機輔助通氣,次/分鐘,潮氣量材料與方法.。用銀針探頭接小鼠右上及雙下肢,連接生理記錄儀,記錄心電圖。脫去其左側(cè)胸

39、部毛,%酒精消毒手術(shù)區(qū),從第肋間處水平橫行剪開皮膚、胸大肌、前鋸肌及肋間肌肉,暴露小鼠心臟,將小鼠改為右側(cè)臥位。鈍性剝開心包膜及胸腺,暴露左心耳及左心室,用.無損傷線于左心耳中部、下緣進針,右/處出針。對于缺血.再灌注模型,可將一直徑約.光滑小珠置于結(jié)扎區(qū),扎活結(jié),心電圖上見段抬高,結(jié)扎心肌變白即為成功。缺血預(yù)定的時間后將活結(jié)松開;對于心梗模型,可直接系死結(jié)結(jié)扎。假手術(shù)組開胸及心臟穿線,但不打結(jié)。動物術(shù)后處死,從心臟取血,離心,取上清后置于.保存以檢測乳酸脫氫酶;心臟組織于液氮速凍后轉(zhuǎn)移至.保存以提取和蛋白用,對于用于制作石蠟切片的心臟組織需先用預(yù)冷的約從左心室心尖處注入以洗凈血液,然后將心臟

40、置于%中性甲醛固定.。. 染色檢測心肌細胞梗死區(qū)戊巴比妥鈉麻醉小鼠,氣管插管,呼吸機輔助通氣,方法同前。從劍突下剪開小鼠上腹部皮膚,鈍性分離膈肌,從腋中線處剪開雙側(cè)肋骨至第肋,鈍性分離皮下及心包以充分暴露左、右心耳及心室。迅速取下心臟,于冰預(yù)冷的中漂洗干凈。.速凍,用刀片從心尖開始至左心耳處沿與縱軸垂直的方向切成厚度約. 片。將切片的心臟置于%中,。顯微相機照相,用 軟件計算左心室 ,和,灰白色區(qū)面積。心肌梗死區(qū)面積占左室面積百分心肌梗死區(qū)比。.乳酸脫氫酶測定于孔板中分別加入待測血清,然后各.抗.抗體、鏈酶親和素.;空白對照孔不加樣品,生物素標記的抗抗體,鏈霉親博士學位論文和素.,只加顯色劑和

41、終止液,其余各步操作相同;標準品孔中只加,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,溫育。入標準品,鏈霉素.揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置秒后棄去,如此重復(fù)次,拍干。每孔先加入顯色劑,再加入顯色劑 ,輕輕震蕩混勻,避光顯色。每孔加終止液,終止反應(yīng)此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。以空白空調(diào)零,波長依序測量各孔的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。.心肌細胞總蛋白的提取棄細胞培養(yǎng)液,。預(yù)冷的漂洗次;加入裂解液含,:,其中直徑的力裂解液,冰上放置,用塑料小刮刀將貼壁心肌細胞剝離下來。將裂解液轉(zhuǎn)移至. 管,置冰上,每混勻次。將裂解液,離

42、心。管中,保存。取上清分裝于.心肌組織總蛋白的提取將心臟取下后置于 管中,加入 裂解液含,:,盡可能剪碎心臟。用電動勻漿器于冰上勻漿心肌組織次,每次,間隔。將裂解液,離心。取上清分裝于. 管中,.保存。材料與方法.法測蛋白濃度方法參照說明書按:的體積比加入試劑和,充分混勻以配置工作液。將凍干標準品用稀釋成/的儲存液,從高濃度到低濃度分別稀釋為下列濃度:/、./、¨/、肛/、/、¨、嵋/、。取標準品和樣品加入孔板加入工作液,充分混勻,孵育。用酶標儀于波長處測值,根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。.檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白參照文獻配制%分離膠和%濃縮膠,在加樣孔中緩慢加入約樣品蛋白,接通電源,先以的電壓電泳,待樣品進入分離膠后將電壓調(diào)至/,直至溴酚藍指示劑接近凝膠底部。取出凝膠,去濃縮膠,參照說明書用 進行轉(zhuǎn)膜,電壓,轉(zhuǎn)膜時間。用配制%封閉液,將膜浸入封閉