微生物活菌計(jì)數(shù)方法

1、微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心曹鳳明曹鳳明直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法 核酸計(jì)數(shù)法核酸計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）nMPN（Most-Probable-Number ）最大可能數(shù)法）最大可能數(shù)法n混菌法混菌法n平板技術(shù)法平板技術(shù)法1. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)比濁法比濁法3. 電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法 1. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù) 顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液血球計(jì)數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子血球計(jì)數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細(xì)菌計(jì)數(shù)板：一般細(xì)菌細(xì)菌計(jì)數(shù)板：一般細(xì)菌

2、用途：快速了解發(fā)酵液的菌數(shù)。常用于生產(chǎn)線上生產(chǎn)過用途：快速了解發(fā)酵液的菌數(shù)。常用于生產(chǎn)線上生產(chǎn)過程控制。程控制。缺點(diǎn)：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計(jì)數(shù)與真實(shí)菌數(shù)缺點(diǎn)：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計(jì)數(shù)與真實(shí)菌數(shù)有很大差異。不能作為正規(guī)計(jì)數(shù)方法。有很大差異。不能作為正規(guī)計(jì)數(shù)方法。l每一種生物都有一套自己獨(dú)有的遺傳物質(zhì)，脫氧核糖核酸每一種生物都有一套自己獨(dú)有的遺傳物質(zhì)，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即和核糖核酸，即DNA和和RNA。隨著核酸分析技術(shù)的發(fā)展，。隨著核酸分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)能夠利用遺傳物質(zhì)對生物進(jìn)行定性和定量的測定，而已經(jīng)能夠利用遺傳物質(zhì)對生物進(jìn)行定性和定量的測定，而且更為靈敏、迅速、專一性強(qiáng)

3、。且更為靈敏、迅速、專一性強(qiáng)。l常用的方法：熒光定量常用的方法：熒光定量PCRl此法操作精細(xì)繁瑣，藥品昂貴，而且經(jīng)常受到死菌體的干此法操作精細(xì)繁瑣，藥品昂貴，而且經(jīng)常受到死菌體的干擾。暫時(shí)不能成為微生物肥料活菌計(jì)數(shù)的常用方法，擾。暫時(shí)不能成為微生物肥料活菌計(jì)數(shù)的常用方法，MPN（Most-Probable-Number ）最大可能數(shù)法（主要）最大可能數(shù)法（主要用于光合細(xì)菌和（糞）大腸菌群的測定）用于光合細(xì)菌和（糞）大腸菌群的測定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測定） 取取1.0mL不同稀釋度菌懸液于不同稀釋度菌懸液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至平皿內(nèi)，將冷卻至50左

4、右的左右的1520mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕混勻，培培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕混勻，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。養(yǎng)計(jì)數(shù)。 （食品中乳酸菌總菌數(shù)的測定）（食品中乳酸菌總菌數(shù)的測定）平板計(jì)數(shù)法（最常用的方法）平板計(jì)數(shù)法（最常用的方法）使不可見的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可使不可見的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可見的菌落（見的菌落（CFU），從而可用肉眼進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。），從而可用肉眼進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。較其他方法直觀準(zhǔn)確較其他方法直觀準(zhǔn)確 ，是一種經(jīng)典的檢測活菌數(shù)的，是一種經(jīng)典的檢測活菌數(shù)的方法，也是目前國際上通用的方法。方法，也是目前國際上通用的方法。制備一定體積的菌懸液，作一系列的倍數(shù)稀釋，然制備一定體積的菌

5、懸液，作一系列的倍數(shù)稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算出樣品中的活菌數(shù)。落數(shù)，計(jì)算出樣品中的活菌數(shù)。平板計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)平板計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確、可靠優(yōu)點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確、可靠 該方法不僅可以檢測到樣品中的有效活菌該方法不僅可以檢測到樣品中的有效活菌數(shù)，而且可以檢測到產(chǎn)品的微生物污染情況，數(shù)，而且可以檢測到產(chǎn)品的微生物污染情況，即雜菌數(shù)。即雜菌數(shù)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結(jié)果一般低于實(shí)際值。的結(jié)果一般低于實(shí)際值。 （一）檢測前的準(zhǔn)備（一）檢測前的準(zhǔn)備（二）（二）

6、操作過程（母液制備、系列稀釋、操作過程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識別、計(jì)數(shù)）加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識別、計(jì)數(shù)）（三）（三） 計(jì)算計(jì)算根據(jù)菌種的特性選擇方法根據(jù)菌種的特性選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無菌間或潔凈工作臺消毒無菌間或潔凈工作臺消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅菌菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備培養(yǎng)基制備和平板制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成的，專供微生培養(yǎng)基定義指人

7、工方法配合而成的，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營養(yǎng)物制品。養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇 需要了解目的微生物的基本特需要了解目的微生物的基本特性，選擇正確的培養(yǎng)基性，選擇正確的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備程序培養(yǎng)基的制備程序按按微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件規(guī)定執(zhí)行，規(guī)定執(zhí)行， NY/T1114-2006培養(yǎng)基標(biāo)識清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。培養(yǎng)基標(biāo)識清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50 左右（以不燙手為宜），在無左右（以不燙手為宜），在無菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。菌狀態(tài)下傾注培

8、養(yǎng)基。傾倒平板前應(yīng)將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖傾倒平板前應(yīng)將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖動(dòng)時(shí)要防止產(chǎn)生大量氣泡。動(dòng)時(shí)要防止產(chǎn)生大量氣泡。通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置23天使用，天使用，目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由于平板上的水滴運(yùn)動(dòng)而連片以致無法計(jì)數(shù)。于平板上的水滴運(yùn)動(dòng)而連片以致無法計(jì)數(shù)。l2.1 母液制備l2.2 系列稀釋、加樣和涂布l2.3 培養(yǎng)l2.4

9、 識別和計(jì)數(shù)樣品混合均勻：樣品混合均勻：很重要很重要固體樣品：稱取固體樣品：稱取10g左右樣品加入到左右樣品加入到100mL無無菌水（菌水（ 500mL三角瓶）中，靜置三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取液體樣品：量取10.0ml樣品加入到樣品加入到90mL無菌無菌水（水（500mL三角瓶）中，靜置三角瓶）中，靜置20min 。分散菌體：將三角瓶置于搖床上分散菌體：將三角瓶置于搖床上200r/min振蕩振蕩30min，即成母液菌懸液。，即成母液菌懸液。準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備工作： 應(yīng)將平板上做好標(biāo)記，包括培養(yǎng)基種類，樣品應(yīng)將平板上做好標(biāo)記，包括培養(yǎng)基種類，樣品編號，稀釋度編號，稀釋度/稀釋倍數(shù)稀

10、釋倍數(shù). 將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度/稀釋倍稀釋倍數(shù)數(shù)具體過程見具體過程見GB20287-2006 農(nóng)用微生物菌劑農(nóng)用微生物菌劑2.2.1 系列稀釋系列稀釋 用無菌吸管分別吸取用無菌吸管分別吸取 5.0mL 上述母液菌懸液上述母液菌懸液加至加至45 mL無菌水（無菌水（150mL三角瓶）中，按三角瓶）中，按1:10(10倍倍)進(jìn)行依次稀釋，分別得到進(jìn)行依次稀釋，分別得到10-1，10-2 ，10-3 ，10-4等濃度的菌懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無菌吸管）等濃度的菌懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無菌吸管） 注：稀釋度：注：稀釋度：10-1，10-2 ，10-3 ，10

11、-4 ，10-5 相當(dāng)于相當(dāng)于 稀釋倍數(shù)：稀釋倍數(shù)：101， 102 ， 103 ，104 ，105 每個(gè)樣品取每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，用個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，用0.5mL無菌無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至預(yù)先，加至預(yù)先制好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將制好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于平板表面。不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于平板表面。 每一稀釋度每種培養(yǎng)基做每一稀釋度每種培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無菌水作空白對照。菌水作空白對照。整個(gè)程序應(yīng)在無菌間或超凈臺內(nèi)進(jìn)行，操作人員時(shí)刻有整個(gè)程序

12、應(yīng)在無菌間或超凈臺內(nèi)進(jìn)行，操作人員時(shí)刻有無菌概念無菌概念適宜稀釋度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)提供的信息選擇稀釋度。適宜稀釋度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)提供的信息選擇稀釋度。系列稀釋時(shí)不同的稀釋度應(yīng)更換吸管（移液管），加樣系列稀釋時(shí)不同的稀釋度應(yīng)更換吸管（移液管），加樣和涂布不同稀釋度時(shí)也要更換吸管和刮刀。和涂布不同稀釋度時(shí)也要更換吸管和刮刀。每個(gè)培養(yǎng)皿均要標(biāo)明培養(yǎng)基種類、樣品編號、稀釋度每個(gè)培養(yǎng)皿均要標(biāo)明培養(yǎng)基種類、樣品編號、稀釋度稀釋和加樣要準(zhǔn)確，涂布均勻及時(shí)，使用的吸管量程要稀釋和加樣要準(zhǔn)確，涂布均勻及時(shí)，使用的吸管量程要適宜。適宜。無菌水對照，以檢查吸管、刮刀以及稀釋用水滅菌是否無菌水對照，以檢查吸管、刮刀

13、以及稀釋用水滅菌是否徹底、操作過程是否合乎無菌要求。徹底、操作過程是否合乎無菌要求。將涂布好平板放在適宜的條件下培養(yǎng)將涂布好平板放在適宜的條件下培養(yǎng) 如：如： 溫度條件溫度條件 氣體條件氣體條件 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間 平板倒置培養(yǎng)平板倒置培養(yǎng)通過菌落識別、涂片染色、鏡檢觀察，確定通過菌落識別、涂片染色、鏡檢觀察，確定有效菌。有效菌。（必要時(shí)做生化實(shí)驗(yàn)）（必要時(shí)做生化實(shí)驗(yàn)）選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落并非都是有效菌，選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落并非都是有效菌，培養(yǎng)基的選擇性是相對的。培養(yǎng)基的選擇性是相對的。一種有效菌只在一種特定培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，不一種有效菌只在一種特定培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，不同培養(yǎng)基上同一種有效菌不能

14、累加。同培養(yǎng)基上同一種有效菌不能累加。細(xì)菌雜菌（包括放線菌）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)菌雜菌（包括放線菌）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)；霉菌和真菌雜菌在真菌培養(yǎng)基上基上計(jì)數(shù)；霉菌和真菌雜菌在真菌培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)。但也不能重復(fù)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)。但也不能重復(fù)計(jì)數(shù)。l3.1 有效稀釋度的選擇有效稀釋度的選擇l3.2 標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差l3.3 計(jì)算公式及示例計(jì)算公式及示例參見標(biāo)準(zhǔn)參見標(biāo)準(zhǔn) GB20287-2006的的6.3.2.4示例：（表格）示例：（表格）計(jì)數(shù)原則計(jì)數(shù)原則以出現(xiàn)以出現(xiàn)20300個(gè)細(xì)菌菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，個(gè)細(xì)菌菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，絲狀真菌為絲狀真菌為10150個(gè)菌落數(shù)。個(gè)菌落數(shù)。 當(dāng)只有

15、一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20300之間時(shí)，之間時(shí)，則以平均菌落數(shù)計(jì)算。則以平均菌落數(shù)計(jì)算。 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20300之間時(shí)，之間時(shí)，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定：應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定： 若其比值小于等于若其比值小于等于2應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)；應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)； 若大于若大于2則以稀釋倍數(shù)小的菌落平均數(shù)計(jì)算。則以稀釋倍數(shù)小的菌落平均數(shù)計(jì)算。例次例次不同稀釋倍數(shù)的不同稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)菌落平均數(shù)兩個(gè)稀兩個(gè)稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)度菌落度菌落數(shù)之比數(shù)之比菌數(shù)菌數(shù)億億/g,mL1031041051無法數(shù)無法數(shù)無法數(shù)無法數(shù)2

16、53/25.32無法數(shù)無法數(shù)31532/3.23313383/0.3842893221.10.305無法數(shù)無法數(shù)136342.5/63250/0.03271530/0.0151n)xx(2標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation) ：各數(shù)據(jù)偏離平均數(shù)的距離（離均差）的平均數(shù)，它是離差平方和平均后的方根。用表示。標(biāo)準(zhǔn)差體現(xiàn)隨機(jī)變量取值與其期望值的偏差。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) NY411-2000 固氮菌肥料的固氮菌肥料的7.2.6.2。平板上菌落數(shù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差要求平板上菌落數(shù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差要求平板上菌落平板上菌落平均數(shù)，個(gè)平均數(shù)，個(gè)/皿皿20-5051-99100-300標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差10.020.050.0

17、重復(fù)重復(fù)I重復(fù)重復(fù)II重復(fù)重復(fù)III平均數(shù)平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差3548219100.7102.72222135100.748100.7219100.731102.7xxn 加樣量樣品量基礎(chǔ)液體積稀釋倍數(shù)有效菌菌落平均數(shù)億有效菌數(shù)810),(mLg加樣量樣品量基礎(chǔ)液體積稀釋倍數(shù)雜菌菌落平均數(shù)億雜菌菌數(shù)810),(mLg100(%)雜菌總數(shù)有效菌總數(shù)雜菌總數(shù)雜菌率l樣品編號 ：Al樣品狀態(tài)：顆粒l執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB20287-2006l菌種名稱：巨大芽孢桿菌l稱樣量：10.10g重復(fù)重復(fù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)（巨大芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯（巨大芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上）培養(yǎng)基上）/1031041051無法數(shù)無法數(shù)

18、11515有效菌有效菌數(shù)數(shù)億億/g2無法數(shù)無法數(shù)126193無法數(shù)無法數(shù)12417菌落菌落平均平均數(shù)數(shù)/121.717.01.20標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)差差/5.9/20. 11 . 010.10100107 .12110/48）有效菌數(shù)（億 g重復(fù)重復(fù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)（細(xì)菌細(xì)菌雜菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上）雜菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上）/1031041051無法數(shù)無法數(shù)152雜菌數(shù)雜菌數(shù)億億/g2無法數(shù)無法數(shù)2543無法數(shù)無法數(shù)183菌落菌落平均數(shù)平均數(shù)/19.3/0.1919.01 .010.10100103 .1910)/(48g億細(xì)菌雜菌重復(fù)重復(fù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)（霉菌在馬丁培養(yǎng)基（霉菌在馬丁培養(yǎng)基上）上）/10

19、310410516/霉菌數(shù)霉菌數(shù)個(gè)個(gè)/g27/38/菌落菌落平均數(shù)平均數(shù)7.0/0.69106631069. 01 . 010.10100100 . 7/）霉菌（個(gè)g重復(fù)重復(fù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)（真菌雜菌在馬丁培養(yǎng)（真菌雜菌在馬丁培養(yǎng)基上，不包括霉菌）基上，不包括霉菌）/10310410513/真菌雜菌真菌雜菌億億/g22/34/菌落菌落平均數(shù)平均數(shù)3.0/0.00300030. 01 . 010.10100100 . 310/38）真菌雜菌（億 g20. 11 . 010.10100107 .12110/48）有效菌數(shù)（億 g19.01 .010.10100103 .1910)/(48g億細(xì)菌雜

20、菌631069.01 .010.10100100 .7/）霉菌（個(gè)g0030. 01 . 010.10100100 . 310/38）真菌雜菌（億 g28.141000030. 00069. 019. 020. 10030. 00069. 019. 0%）雜菌率（樣品編號檢測日期年 月 日室溫，相對濕度，%儀器名稱、編號1.培養(yǎng)箱 2.潔凈室菌種名稱依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度， 培 養(yǎng) 基培養(yǎng)時(shí)間， h 基礎(chǔ)液體積v1，mL 樣品量m0(v0)，g(mL) 加 樣 量v2，mL 稀釋倍數(shù) k菌 落 數(shù)(cfu /皿)重復(fù)重復(fù)重復(fù)平均 標(biāo)準(zhǔn)差n-1無菌水對照計(jì)算公式： nm = 10-8kv1/(m0v2) 其中