流式原理培訓

1、流式細胞術流式細胞術-理論及應用理論及應用主要內容主要內容流式細胞術簡介流式細胞術應用 細胞周期檢測 細胞凋亡檢測流式細胞儀預約使用規(guī)范附二院分析型流式細胞儀附二院分析型流式細胞儀BD Canto II 二激光六色(自動上樣，同時容納40個樣本)488nm 藍激光633nm 紅激光Beckmen Cytoflex 雙激光六色（單上樣管，半自動上樣）488nm 藍激光635nm 紅激光流式細胞儀基本構造流式細胞儀基本構造 液流系統(tǒng)流動室液流驅動系統(tǒng) 光學系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)光電轉換器數據處理系統(tǒng)熒光信號熒光信號 電信號電信號 數字信號數字信號 流式細胞術:用于對懸懸浮浮于流體中的微

2、小顆粒進行計數和分選。這種技術可以用來對流過光學或電子電子檢測器的一個個細胞進行連續(xù)的多種多種參數參數分析。流式細胞術（流式細胞術（ Flow Cytometry, FCM）鞘液Sheath流式細胞術光信號類型流式細胞術光信號類型 散射光信號：與標記熒光素無關， 是細胞的固有參數。前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC);側向散射光側向散射光(side scatter, SSC) 熒光信號自發(fā)熒光自發(fā)熒光 ：微弱特異熒光特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。散射光信號散射光信號FSCFSC和和 SSC SSC當顆粒通過聚焦光束時，激光向各個方向散射。

3、與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱側向角散射光信號（SSC）。FSC：反應細胞大小和活力SSC：反應細胞內部顆粒度和精細結構變化 FSC/SSCFSC/SSC的作用的作用 實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。熒光信號熒光信號當熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，燃料吸收光子躍遷到高能級，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，以光的形式釋放。這種發(fā)出的光成為熒光。熒光通道熒光通道散射光通道: FSC和SSC通道；熒光通道 通道命名方式：以FL(fluorescence)加數字命名，如FL1、FL2、FL3等

4、。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。FLFL的作用的作用熒光素分子熒光素分子激發(fā)光波長激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長發(fā)射光波長（nm）中文名中文名FITC490520異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665常用熒光染料常用熒光染料499nm

5、藍色熒光（藍色熒光（Blue）； 500-549nm，綠色熒光（，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（，黃色熒光（Yellow） 585-615nm，橙色熒光（，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（，紅色熒光（Red）； 700nm，遠紅外熒光（，遠紅外熒光（Far-Red）。熒光抗體的選擇熒光抗體的選擇 根據流式細胞儀選擇抗體 根據抗原表達強弱合理選擇抗體不同熒光素強度有所不同高表達的抗原可不用太“亮”的熒光染料，“亮”的熒光染料分配給表達低的抗原 選擇熒光波譜見光譜重疊小的染料進行組合，同時正確的調節(jié)補償(細胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，理

6、論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應的通道檢測。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現象就是光譜重疊.)對照的設置對照的設置 空白對照空白對照設置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結果。 流式結果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越信號越強。通過調節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強度處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。同型對照同型對照 非特異性染色 抗體的Fc段可以與細胞表面的Fc受體非特異性結合； 抗體進入胞內，不容易洗脫，造成非特異性染色。 實驗抗體：FITC-CD3單克隆抗體為鼠IgG1亞型抗

7、體; 同型對照：相同劑量未免疫小鼠血清純化的IgG1，并標記FITC。單標對照單標對照兩色或多色實驗時須設置單標對照，用于補償的調節(jié)兩色或多色實驗時須設置單標對照，用于補償的調節(jié)( (以以PE/FITCPE/FITC為例為例) )；單標實驗時不需要。單標實驗時不需要。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2補償前補償前補償后補償后FITC單標單標PE 單標單標流式數據顯示流式數據顯示: 單參數直方圖 ( Histogram ) 雙參數數據顯示 - 散點圖(Do

8、t Plot) -等高線圖(Contour Plot) -密度圖（Density Plot） 三維圖 (3D Plot)直方圖 ( Histogram ):橫坐標是散射光或熒光相對強弱，縱坐標代表細胞數散點圖：每一個點代表一個細胞，橫縱軸各代表一個參數等高線圖 ：同一條線上的細胞數目相等，越靠里的曲線說明細胞數目越多密度圖：點密度越大的地方，細胞數越多三維圖FSC/SSC/ FL熒光抗體選擇原則對照設置（熒光補償）流式數據顯示小結小結流式細胞術應用流式細胞術應用-細胞周期細胞周期細胞周期：細胞周期：細胞從一次分裂完成到下一次細胞分裂結束所經歷的全過程，分為間期和分裂期兩個階段周期檢測的原理周期

9、檢測的原理周期檢測步驟u0.25%胰酶（無EDTA）消化，將細胞消化成單個。u離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次。 u打孔：加入1ml預冷（-20度）70%乙醇到細胞沉淀中，于4度固定過夜（或實驗周期長可以-20長期固定）。u離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞兩次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 4避光孵育30分鐘，上機檢測。樣本來源樣本來源培養(yǎng)的細胞、血液、骨髓、體液、組織等的單細胞都可用于DNA分析；標本數應大于106注意注意獲得單個細胞單個細胞，盡量避免DNA降解；樣本關鍵減少碎片減少碎片（無EDTA/不可過度吹打/離

10、心）；PI 既能和DNA結合，又能跟RNA結合，所以要用RNase降解脫氧核糖核酸酶會降解DNA,故耗材試劑要干凈滅菌 。流式細胞術應用流式細胞術應用-細胞凋亡細胞凋亡細胞凋亡概念細胞凋亡概念 為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。是機體主動主動、高度有序有序清除無用細胞的過程。是生物體中一種普遍存在的現象。區(qū)別于細胞壞死（外力引起的細胞無序變化的死亡過程）細胞凋亡多事件發(fā)生 早期：AnnexinV（PS外翻） 早中期：JC-1( 線粒體膜電位) 中晚期：caspase-3、8、9（western） 晚期： TUNEL （ DNA 片段）不同時期凋亡檢測指標不同時期凋亡檢測指標早

11、期凋亡特征： 磷脂膜（PS）外翻，但是細胞膜保持完整性，因此 PI染色為陰性 DNA沒有發(fā)生斷裂AnnexinVAnnexinV（磷脂結合蛋白）（磷脂結合蛋白）對照設置：對照設置：空白對照：不加AnnexinV/PI,用以調節(jié)電壓，陰陽性細胞界限單陽對照：誘導凋亡，AnnexinV/ PI單染，用來補償雙染陰性對照：未誘導的 AnnexinV+PI雙染。用它確定兩熒光通道電壓，排除非特異性結合注意：注意：細胞制備或存儲時細胞膜損傷，造成假陽性貼壁細胞消化時避免使用EDTA，螯合鈣離子當樣本表達GFP時，禁用AnnexinV-FITC 推薦使用AnnexinV-APC/7-AAD染色JC-1(B

12、IC2)JC-1(BIC2)檢測線粒體膜電位變化檢測線粒體膜電位變化原理：JC-1有單體跟多聚體兩種形式。濃度高時，JC-1呈多聚體，可以產生紅色熒光；在濃度較低時，JC-1為單體，可以產生綠色熒光。正常細胞：膜電位正常， JC-1隨線粒體膜極性進入線粒體，隨濃度升高而成多聚體，發(fā)紅色熒光。凋亡細胞：線粒體膜去極化， JC-1從線粒體釋放，濃度降低，轉為單體，發(fā)綠色熒光。通過檢測紅綠兩種熒光區(qū)分。Caspase-3Caspase-3檢測檢測 -細胞凋亡過程中，胞內主要蛋白通常被降解，調節(jié)這一過程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)。 Caspase 3是參與DNA維護和調控細胞

13、的重要組分，即 Caspase 3激活=細胞凋亡TUNELTUNEL檢測檢測凋亡晚期特征 DNA內切酶活性激活升高，雙鏈DNA切斷形成185bp的有序片段。Tunel流式法:基因組DNA斷裂時，暴露的3-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，通過流式細胞儀進行檢測。一步法一步法FITC-dUTP染色凋亡細胞流式細胞儀488nm激發(fā)，PI發(fā)出623nm熒光，FITC發(fā)出520nm熒光兩步法兩步法PI染總DNA(周期)FITC-dUTP染色凋亡細胞（如不需要周期信息，可不做PI染色）TUNELTUNEL檢測檢測TUNELTUNEL檢測檢測 小結：細胞凋亡小結：細胞凋亡-流式分析流式分析活細胞細胞凋亡流式分析固定細胞膜不對稱性改變AnnexinV線粒體膜電位變化Mitoscreen(JC-1)TUNEL/DNA片段化流式的其他應用流式的其他應用黏附因子黏附因子表面受體表面受體細胞因子細胞因子分泌到胞外分泌到胞外的細胞因子的