食品微生物檢測簡介

1、微生物微生物介紹介紹菌種保藏菌種保藏微生物檢測微生物檢測010203目錄微生物介紹 所謂微生物是指個(gè)體微小，必須借助于顯微所謂微生物是指個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。微小生物，如細(xì)菌。 什么是微生物？微生物介紹微生物的特點(diǎn) 微生物是結(jié)構(gòu)簡單、繁殖快、分布廣、個(gè)體最小的生物。 結(jié)構(gòu)簡單：微生物多數(shù)是單細(xì)胞,有的具有細(xì)胞構(gòu)造，有的甚至沒有細(xì)胞構(gòu)造； 生長旺，繁殖快（大腸桿菌在它的適宜37-44之間，20-30分鐘繁殖一代）； 分布廣.種類多（10萬多種） ：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等； 個(gè)體?。盒∮?

2、.1mm，肉眼不可見。 適應(yīng)性強(qiáng)，易變異； 代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快； 微生物介紹 真核細(xì)胞型微生物真核細(xì)胞型微生物細(xì)胞核分化程度高，有核膜和核仁，細(xì)胞器完整。如真菌。 原核細(xì)胞型微生物原核細(xì)胞型微生物細(xì)胞核的分化較低，僅有原始核，無核膜、核仁。細(xì)胞器很不完善。DNA和RNA同時(shí)存在。這類微生物眾多，有細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體。 非細(xì)胞型微生物非細(xì)胞型微生物是最小的微生物一類微生物。無典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。核酸類型為DNA或RNA。病毒屬之。 微生物的分類微生物介紹 環(huán)境條件一定范圍的變化，影響形態(tài)生理生長繁殖 極端環(huán)境條件對微生物的影響死亡 微生物生長的主要環(huán)境

3、因子溫度O2水分pH值氧化還原點(diǎn)位化學(xué)藥物、輻射等微生物介紹微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備 電子天平：0.1g；0.01g； pH計(jì)； 加熱裝置：電爐、微波爐； 高壓滅菌鍋微生物介紹 高壓鍋：滅菌檢測產(chǎn)品 1、壓力滅菌指示卡（121）； 2、生物指示劑 （121，15min ） 干燥滅菌箱； 水浴鍋微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備微生物介紹 超凈工作臺(tái)/生物安全柜1、區(qū)別：保護(hù)對象不同微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備操作者樣品環(huán)境超凈工作臺(tái)生物安全柜微生物介紹微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備 生物安全等級P1P2P3P4普通無害微生物（細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群）一般可治病微生物（沙門、副弧、金葡、單增、空彎、O157

4、）烈性微生物，可治愈（肉毒桿菌、炭疽桿菌）烈性微生物，無法治愈（鼠疫耶爾森氏菌）微生物介紹 操作臺(tái)內(nèi)的滅菌設(shè)備1、酒精燈；2、紅外線滅菌器；3、電子火焰滅菌器； 培養(yǎng)箱1、一般恒溫培養(yǎng)箱；2、厭氧培養(yǎng)箱（厭氧培養(yǎng)罐） 微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備微生物檢測GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定；GB 4789.3-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)；GB 4789.15-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)；GB 4789.4-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)；GB 4789.10-2

5、016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)；GB 4789.30-2016 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)；微生物檢測菌落總數(shù)測定 菌落總數(shù) aerobic plate count 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每mL(g)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。微生物檢測菌落總數(shù)測定衛(wèi)生學(xué)意義： 食品的菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本的衛(wèi)生要求。 加工、貯存運(yùn)輸過程中是否受到污染衛(wèi)生質(zhì)量 衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)：菌落總數(shù)和致病菌有本質(zhì)區(qū)別，必須配合其他病原菌項(xiàng)目的檢驗(yàn)，才能作出比較全面準(zhǔn)確的評定微生物檢測菌落總數(shù)測定微生物檢測編編 號號菌

6、落總數(shù)菌落總數(shù)報(bào)告方式報(bào)告方式單單 位位195.596CFU/g或CFU/mL（CFU大寫）216801700或1.71033均為蔓延菌落無法計(jì)數(shù)報(bào)告“菌落蔓延”4空白對照有菌結(jié)果無效計(jì)數(shù)和報(bào)告結(jié)果報(bào)告微生物檢測 必須做空白對照：必須做空白對照：監(jiān)測培養(yǎng)基、平皿、稀釋液的無菌程度。同時(shí)，應(yīng)在工作臺(tái)內(nèi)打開一塊空白PCA（其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)），以了解樣品在檢驗(yàn)過程中有無受到來自環(huán)境的污染 水浴和傾注溫度：461 培養(yǎng)條件：一般樣品361/48h2h，水產(chǎn)品（指原生態(tài)、未加工水產(chǎn)品）301/72h3h注意事項(xiàng)微生物檢測 如樣品（干調(diào)、面粉、脫水蔬菜）中可能含有在瓊脂表面蔓延生長的菌落，可在凝

7、固后的瓊脂表面再覆蓋一層（4mL）培養(yǎng)基 樣品稀釋液有時(shí)會(huì)帶有細(xì)碎的食物顆粒（如奶粉、堅(jiān)果），為避免這些顆粒與菌落發(fā)生混淆，可將樣品稀釋液與PCA混合，單做培養(yǎng)，置于4冰箱放置同樣時(shí)間，以便在計(jì)數(shù)時(shí)作為對照。注意事項(xiàng)微生物檢測大腸菌群計(jì)數(shù) 定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 該菌主要來源于人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評價(jià)食品該菌主要來源于人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。 這些細(xì)菌在生

8、化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化鑒定試驗(yàn)，可將大腸菌群細(xì)分為大腸埃希氏菌步的生化鑒定試驗(yàn)，可將大腸菌群細(xì)分為大腸埃希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。和陰溝腸桿菌等。微生物檢測 檢驗(yàn)原理：檢驗(yàn)原理： MPNMPN法法：是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合：是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算

9、出釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。數(shù)。 平板計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法：大腸軍群在固體培：大腸軍群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。大腸菌群計(jì)數(shù)微生物檢測霉菌和酵母計(jì)數(shù)馬鈴薯葡萄糖瓊脂馬鈴薯葡萄糖瓊脂孟加拉紅培養(yǎng)基孟加拉紅培養(yǎng)基微生物檢測 兩種培養(yǎng)基都含有氯霉素，可以抑制細(xì)菌的生長；兩種培養(yǎng)基都含有氯霉素，可以抑制細(xì)菌的生長； 對氯霉素耐藥的一些細(xì)菌在這兩種培養(yǎng)基上也會(huì)生對氯霉素耐藥的一些細(xì)菌在這兩種培養(yǎng)基

10、上也會(huì)生長，可以通過長，可以通過菌落形態(tài)菌落形態(tài)來區(qū)分，或者通過來區(qū)分，或者通過染色鏡檢染色鏡檢來判定；來判定； 如果需要分開報(bào)告霉菌和酵母菌的數(shù)量，主要通過如果需要分開報(bào)告霉菌和酵母菌的數(shù)量，主要通過菌落形態(tài)菌落形態(tài)來區(qū)分。來區(qū)分。培培養(yǎng)基的使用養(yǎng)基的使用霉菌和酵母計(jì)數(shù)微生物檢測細(xì)菌：由于細(xì)胞小，形成的菌落較小，較薄、細(xì)菌：由于細(xì)胞小，形成的菌落較小，較薄、較透明、且有較透明、且有“細(xì)膩感細(xì)膩感”。可產(chǎn)生不同色素，?？僧a(chǎn)生不同色素，菌落可呈現(xiàn)五顏六色且形態(tài)多樣。菌落可呈現(xiàn)五顏六色且形態(tài)多樣。酵母菌：由于細(xì)胞較大且不能運(yùn)動(dòng)，一般菌落酵母菌：由于細(xì)胞較大且不能運(yùn)動(dòng)，一般菌落比細(xì)菌大、厚且透明度差

11、。產(chǎn)生色素較單一，比細(xì)菌大、厚且透明度差。產(chǎn)生色素較單一，通常乳白色，少數(shù)為橙紅色，個(gè)別黑色。通常乳白色，少數(shù)為橙紅色，個(gè)別黑色。霉菌：菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，霉菌：菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；不透明，呈現(xiàn)蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的聯(lián)系緊密，不易挑起，菌落菌落與培養(yǎng)基間的聯(lián)系緊密，不易挑起，菌落正面與反面、邊緣與中心的顏色和構(gòu)造常不一正面與反面、邊緣與中心的顏色和構(gòu)造常不一致。致。細(xì)菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形態(tài)細(xì)菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形態(tài)微生物檢測細(xì)菌：包括三種基本細(xì)菌：包括三種基本形態(tài)，球狀、桿狀和形態(tài)，球狀

12、、桿狀和螺旋狀螺旋狀細(xì)菌、酵母菌及霉菌的鏡檢形態(tài)細(xì)菌、酵母菌及霉菌的鏡檢形態(tài)v 霉菌：細(xì)胞構(gòu)造霉菌：細(xì)胞構(gòu)造與酵母菌相似，但與酵母菌相似，但以菌絲體形式存在以菌絲體形式存在v 酵母菌：細(xì)胞通酵母菌：細(xì)胞通常有球狀、卵圓狀、常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀和香橢圓狀、柱狀和香腸狀腸狀微生物檢測微生物檢測致病菌檢驗(yàn)綜合鑒定結(jié)果分離（選擇性培養(yǎng)基通常2種）初篩生化鑒定血清學(xué)鑒定 前增菌選擇性增菌判定檢出/未檢出結(jié)論：微生物檢測檢驗(yàn)流程檢驗(yàn)流程 前增菌前增菌 選擇性增菌選擇性增菌 選擇性分離選擇性分離生化鑒定生化鑒定血清學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定微生物檢測 任何樣品均需進(jìn)行前增菌。任何樣品均需進(jìn)行前增菌。 緩沖蛋

13、白胨水（緩沖蛋白胨水（BPWBPW）：不含任何抑菌成分，有利于受損沙門氏）：不含任何抑菌成分，有利于受損沙門氏菌的復(fù)蘇，使受損傷細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。菌的復(fù)蘇，使受損傷細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。 冷凍樣品解凍：冷凍樣品解凍：4545以下不超過以下不超過15min15min，或，或2-52-5不超過不超過18h18h。 增菌時(shí)間：增菌時(shí)間：8h-18h8h-18h。SC:u亞硒酸鹽抑菌亞硒酸鹽抑菌;胱氨酸促生長胱氨酸促生長;u適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，37 TTB:u四硫酸鈉和煌綠抑菌四硫酸鈉和煌綠抑菌;u適合其他沙門菌生長，適合其他沙門菌生

14、長，42 ;為防漏檢宜為防漏檢宜SC+TTB前增菌選擇性增菌微生物檢測 分別用分別用3mm3mm接種環(huán)取增菌液接種環(huán)取增菌液1 1環(huán)，劃線接種于一個(gè)環(huán)，劃線接種于一個(gè)BSBS瓊瓊脂平板和一個(gè)脂平板和一個(gè)XLDXLD瓊脂平板（或瓊脂平板（或HEHE瓊脂平板或沙門氏瓊脂平板或沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板），于菌顯色培養(yǎng)基平板），于363611分別培養(yǎng)分別培養(yǎng)18h18h24h24h（XLDXLD、HEHE、顯色培養(yǎng)基）或、顯色培養(yǎng)基）或40h40h48h48h（BSBS瓊脂平瓊脂平板）板） 為了最大可能的檢出沙門氏菌，必須使用兩種或以上為了最大可能的檢出沙門氏菌，必須使用兩種或以上選擇性分離培養(yǎng)基選擇性

15、分離培養(yǎng)基選擇性分離微生物檢測鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌弗氏志賀氏菌XLD瓊脂BS瓊脂選擇性分離微生物檢測HE瓊脂選擇性分離鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌 大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌沙門氏菌顯色培養(yǎng)基微生物檢測生化鑒定微生物檢測血清學(xué)鑒定 血清學(xué)作為鑒定的一部分，必須完成血清學(xué)作為鑒定的一部分，必須完成 實(shí)驗(yàn)室必須配備沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)室必須配備沙門氏菌的自凝性自凝性、多價(jià)菌體（）多價(jià)菌體（）和和多多價(jià)鞭毛（）價(jià)鞭毛（）診斷血清診斷血清 其中血清學(xué)分型為選作試驗(yàn)項(xiàng)目其中血清學(xué)分型為選作試驗(yàn)項(xiàng)目 血清學(xué)試驗(yàn)必須基于生化試驗(yàn)的結(jié)果，不能單純

16、以血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)必須基于生化試驗(yàn)的結(jié)果，不能單純以血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來報(bào)告最終結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果來報(bào)告最終結(jié)果。微生物檢測血清學(xué)鑒定33從營養(yǎng)瓊脂上挑取一環(huán)純化菌落，用無菌接種環(huán)分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液在玻片上劃出兩個(gè)區(qū)域，一邊滴加1滴O多價(jià)血清，另一邊加入1滴生理鹽水，作為對照結(jié)果觀察自凝性檢查及O多價(jià)鑒定菌種保藏不亂不亂菌種保藏是微生物學(xué)及相關(guān)工作的一項(xiàng)重要菌種保藏是微生物學(xué)及相關(guān)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是我們檢測工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)內(nèi)容，也是我們檢測工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)不變不變保持保持原有性狀原有性狀不亂不亂不死不死保持活力保持活力 而不死而不死不亂不亂不雜不雜保證純培養(yǎng)保證純培養(yǎng)防止污染

17、防止污染菌種保藏選擇最適宜的保藏方法選擇最適宜的保藏方法4123010203挑選特征典型的純菌菌落確定保藏的合適菌體形態(tài)選擇最適宜的保藏方法04定期對保藏菌種進(jìn)行檢查菌種保藏保藏方法長期保藏法長期保藏法 短期保藏法短期保藏法 定期移植保藏法：試管斜面 穿刺培養(yǎng) 皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)（保藏厭氧菌）冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法液氮冷凍法液體石蠟保藏液體石蠟保藏甘油管保藏法甘油管保藏法載體保藏法：載體保藏法：沙土管保藏濾紙片保藏菌種菌種菌種保藏保藏方法 磁珠保藏菌種方法 刮取新鮮純培養(yǎng)物，配置3-4麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙骸?加入到保存管中，擰緊，來回顛倒4-5次，磁珠會(huì)吸附菌體，然后將培養(yǎng)液吸取干凈。

18、 置于-20或-70，或液氮中保存微生物介紹 所謂微生物是指個(gè)體微小，必須借助于顯微所謂微生物是指個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。微小生物，如細(xì)菌。 什么是微生物？微生物檢測菌落總數(shù)測定 菌落總數(shù) aerobic plate count 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每mL(g)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。微生物檢測 分別用分別用3mm3mm接種環(huán)取增菌液接種環(huán)取增菌液1 1環(huán)，劃線接種于一個(gè)環(huán)，劃線接種于一個(gè)BSBS瓊瓊脂平板和一個(gè)脂平板和一個(gè)XLDXLD瓊脂平板（或瓊脂平板（或HEHE瓊脂平板或沙門氏瓊脂平板或沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板），于菌顯色培養(yǎng)基平板），于363611分別培養(yǎng)分別培養(yǎng)18h18h24h24h（XLDXLD、HEHE、顯色培養(yǎng)基）或、顯色培養(yǎng)基）或40h40h48h48h（BSBS瓊脂平瓊脂平板）板） 為了最大可能的檢出沙門氏菌，必須使用兩種或以上為了最大可能的檢出沙門氏菌，必須使用兩種或以上選擇性分離培養(yǎng)基選擇性分離培養(yǎng)基選擇性分離微生物