凝膠過濾最新課件

1、凝膠過濾最新第六章第六章 凝膠過濾凝膠過濾凝膠過濾最新n凝膠過濾（又叫分篩層析）是20世紀60年代發(fā)展起來的一種分離純化方法。n其原理原理是： 凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部內(nèi)部，而大分子物卻被排阻在外部外部; 當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子質(zhì)量篩分開了。n凝膠過濾特點：設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好和樣品回收率高等。凝膠過濾最新 n常用于： 分離純化蛋白質(zhì)(包括酶類)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物；n還可用于: 測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，樣品的濃縮和脫鹽等方面。凝膠過濾最新第一節(jié)第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì)凝膠的分類及性質(zhì) n凝膠是不溶于水但在水中有較大膨

2、脹度和較好分子篩功能的一類化合物。n這化合物目前主要有： 葡聚糖凝膠 天然瓊脂糖 交聯(lián)瓊脂糖n其次還有： 聚丙烯酰胺凝膠(生物膠Bio-gel) 交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠 交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共結(jié)合的凝膠 (superdex) 詳見表6-1。 凝膠過濾最新一、葡聚糖凝膠一、葡聚糖凝膠n葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex。n它是由葡聚糖右旋糖酐(G型)和3-氯-1,2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵相互交聯(lián)而成的。n其結(jié)構(gòu)式如圖6-1所示。n在交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應(yīng)，即可構(gòu)成LH型烷基化葡聚糖凝膠。 凝膠過濾最新凝膠過濾最新1理化性質(zhì)理化性質(zhì)n葡聚糖凝膠的外觀為白色

3、珠狀顆粒。n它帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。n由于各種型號的葡聚糖凝膠的交聯(lián)度不同，致使如下理理化性質(zhì)化性質(zhì)在水中的有明顯的差異： 膨脹度膨脹度(床體積) 吸水量吸水量(每克干凝膠在水中充分膨脹時所需的水量) 篩孔的大小篩孔的大小 分級范圍分級范圍 n葡聚糖凝膠的型號不同，其性質(zhì)亦不一樣，詳見表6-2。 凝膠過濾最新n以G型葡聚糖凝膠(經(jīng)水溶液膨脹)作為固定相，以水溶液作為流動相，對水溶性水溶性物質(zhì)物質(zhì)進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠過濾過濾層析層析。n以LH型葡聚糖凝膠(經(jīng)乙醇或二甲亞砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有機溶劑膨脹)作為固定相，以有機溶

4、有機溶劑劑為流動相，對脂溶性脂溶性物質(zhì)物質(zhì)進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠滲透滲透層析層析。 凝膠過濾最新2穩(wěn)定性穩(wěn)定性 n葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學降解。n在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120)消毒0.5h，其性質(zhì)并不改變。n在0.1molL HCl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中浸泡6個月以上，對分離效果無明顯的影響。n當暴露于強酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。n葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時，應(yīng)加入適量的防腐劑如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不

5、然微生物將生長。 凝膠過濾最新3吸附性吸附性 n葡聚糖凝膠系弱酸性弱酸性物質(zhì)，這是由于其每克干膠中含1020g當量的羧基羧基基團所致。n羧基羧基基團能與分離物中電荷基團 (尤其是堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用。n這種吸附作用可以借助提高洗脫液的離子強度得以克服。 當離子強度大于0.05時，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。 因此，常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。 凝膠過濾最新n新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白質(zhì)進行預(yù)層析預(yù)層析，以便消除其影響(雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的標準曲線時，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時,需預(yù)層析預(yù)層析)。 n此外；葡聚

6、糖凝膠對芳香族芳香族化合物或雜環(huán)化雜環(huán)化以及某些某些凝集素凝集素具有較強的吸附吸附作用， 若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往利用的是吸附吸附性能性能，而不是排阻原理排阻原理。 凝膠過濾最新 二、瓊脂糖凝膠二、瓊脂糖凝膠n瓊脂糖是從瓊脂瓊脂中中分離出來的。n在制備過程要將其中含硫酸根硫酸根和和羧基基團羧基基團的的瓊脂膠瓊脂膠除去，得到不帶電荷基團的瓊脂糖。n瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈多糖鏈。n這種多糖鏈在100左右時呈液態(tài)呈液態(tài)，當溫度下降到45以下時呈固態(tài)呈固態(tài)。n它們之間以氫鍵氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖

7、凝膠。 凝膠過濾最新n該物質(zhì)對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力，在pH4.09.0的緩沖液中是穩(wěn)定的。n瓊脂糖凝膠室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。n瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存時易破裂，故一般存放在含防腐劑的水溶液中，同時還要避免劇烈的攪動。n瓊脂糖凝膠按其濃度按其濃度來分有Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6)。 Sepharose 6B的機械強度大于2B，但是篩孔小于2B。 凝膠過濾最新nSepharose與1，3-二溴異丙醇二溴異丙醇(1，3-dibromopropano1)在強堿性條件下反應(yīng)后，即生成CL-型交聯(lián)瓊脂糖型交聯(lián)瓊脂糖。n這種瓊脂

8、糖的篩孔與同濃度的、未交聯(lián)的瓊脂糖相同，但熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性都有了提高。nCL-型交聯(lián)瓊脂糖可在廣范圍的廣范圍的pH溶液(pH314)中使用，即使用較強的堿溶液短時間處理，其性能也不會改變，n但是，在氧化劑氧化劑存在下，會有少量的多糖鏈多糖鏈發(fā)生解聚。n瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。正如前章所述，用瓊脂糖凝膠進行柱層析時，流速可以快些流速可以快些。n瓊脂糖凝膠的有關(guān)性質(zhì)見表6-1和表6-3。 凝膠過濾最新 三、聚丙烯酰胺凝膠三、聚丙烯酰胺凝膠n聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為Bio-gel。n它是以甲撐雙丙烯酰胺甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑交聯(lián)劑，以過硫酸銨硫酸銨作催化劑，

9、 在N,N,N,N,- 四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下， 將丙烯酰胺丙烯酰胺(單體)聚合而成的。n當改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。 凝膠過濾最新n商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gel P-2到P-300，其阿拉伯數(shù)字相當于排阻限度的10-3。n一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干干凝膠凝膠形式出售，使用前必須溶脹。n該凝膠不溶于水和普通有機溶劑，能忍受濃的鹽、尿素和胍鹽等溶液的浸泡；n在pH110或短時間超過此pH范圍的溶液中較穩(wěn)定，要避免長期與強酸和強堿接觸。 n聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象有吸附現(xiàn)象，如使

10、用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服。n聚丙烯酰胺凝膠的物理性質(zhì)見表6-4。 凝膠過濾最新 四、四、SephacrylnSephacryl是由烯丙烷基葡聚糖烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺甲撐雙丙烯酰胺共價共價交聯(lián)交聯(lián)制成的。n屬硬性凝膠，具有篩孔和少量的羧基基團。nSephacryl吸水時，其珠狀顆粒直徑為25-75um(見表6-5)。n通常是用于水相系統(tǒng)水相系統(tǒng)中。n若在有機相系統(tǒng)有機相系統(tǒng)使用時，其孔徑孔徑大小略有變化。 凝膠過濾最新n它在所有的溶劑中不溶解不溶解，化學降解也很少；n它可在pH211范圍內(nèi)使用，當pH低時，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水解水解作用；n在0.2molL NaOH溶

11、液中(室溫)處理100h，對其低流速和多孔性沒有明顯影響。n用去污劑去污劑(如SDS)、6molL鹽酸胍和8molL尿素溶液可作為洗脫劑作為洗脫劑，n高溫(120)消毒(pH7.0時)處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。 nSephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖(proteoglycans)，甚至大的病毒顆粒(直徑300-400nm)也可用它分離。n層析時，用細顆粒凝膠細顆粒凝膠分辨率高凝膠過濾最新 五、五、SuperdexnSuperdex是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖瓊脂糖與與葡聚糖葡聚糖共價共價結(jié)合而成的。n該凝膠具有良好良好的分子篩特性分子篩特性和物理物理、化學穩(wěn)定性化學穩(wěn)定性。n

12、在用其分離樣品過程中，溶液的酸堿度可在pH312范圍內(nèi)變化，溶液中加入去污劑(如1SDS)和(或)解離劑(如8molL尿素、6molL鹽酸胍)時，也不會影響分離效果。n此凝膠共有6種類型，詳見表6-6凝膠過濾最新n除上述5類凝膠外，還有： Superose(高交聯(lián)度的多孔瓊脂糖珠，有制備級和分析級)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝膠 等也具有分子篩功能。n玻璃珠 有大量的網(wǎng)孔，且分布均一; 它機械性能良好，在較高的層析流速下，分辨率并不受影響; 缺點是對蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附能力。 凝膠過濾最新 第二節(jié)第二節(jié) 基本原理基本原理n凝膠過濾層析的基質(zhì)凝膠過濾層析的基質(zhì): 具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀

13、顆粒的物質(zhì)。n排阻、擴散效應(yīng)排阻、擴散效應(yīng)（見下圖） 這種基質(zhì)可以完全或者部分排阻排阻某些大分子化合物某些大分子化合物于篩孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可讓其在篩孔篩孔中自由地擴散擴散、滲透滲透。 任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱被排阻的范圍均在0100之間。凝膠過濾最新 凝膠過濾最新n分配系數(shù)分配系數(shù)Kav 用分配系數(shù)分配系數(shù)Kav表示被排阻的程度；即：分離化合物分配在內(nèi)水內(nèi)水和和外水體積外水體積中的比例比例關(guān)系。 Kav值的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)、外水體積(V0)以及分離物本身的洗脫體積(Ve)。即: Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）n在限定的層析條件下， Vt

14、和和Vo都為恒定值都為恒定值， Ve值值是隨著分離物分子質(zhì)量分子質(zhì)量的變化而變化的變化的。 n 分離物分子質(zhì)量大，Kav值小； 反之，Kav值增大。 凝膠過濾最新n分離過程分離過程 在同一凝膠過濾柱上分子質(zhì)量不同的混合物質(zhì)，由于流動相的作用，這些物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴散效應(yīng)效應(yīng)。 若緩沖液連續(xù)傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴散效應(yīng)也將連續(xù)發(fā)生； 結(jié)果是分子質(zhì)量的物質(zhì)先先從柱中流出， 分子質(zhì)量的物質(zhì)則從柱中流出。 (見圖6-2) 流出物分管等量等量或等時等時地收集， 檢測后分段分段合并合并相同組分相同組分的各管流出物，把分子質(zhì)量不同的物質(zhì)相互篩分開篩分開了。凝膠過濾最新凝膠過濾最新n篩分效果篩分效果 受

15、操作條件的影響(如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等)； 更為直接的影響是Kav值的差異性。 Kav值差異性大，分離效果好； Kav值差異性小，乃至等于1或等于零(即使樣品中各組分的分子質(zhì)量相差很大)，則分離效果很差，或根本不能分開。凝膠過濾最新nKav值的計算值的計算 從公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出， 只要測出：床體積Vt 外水體積Vo 洗脫體積Ve 即可計算出Kav值。凝膠過濾最新l凝膠床總體積Vt的求得 有如下2種方法可求得Vt I.計算法 根據(jù)層析柱體積計算總體積，可用下列公式表示 Vt =r2h 式中, r為層析柱半徑； h

16、為凝膠床高度； 為圓周率。凝膠過濾最新II.測量法已知，床體積Vt Vt=Vo+Vi+Vg因Vg與Vt相比是很小的，可忽略不計，故 Vt=Vo+Vi Vo和Vi可以通過實驗測得(見圖6-3)，如下： 凝膠過濾最新 通過實驗求Vo和Vi 當把分子質(zhì)量不同分子質(zhì)量不同的混合溶液混合溶液鋪在凝膠床上時， 溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者分子大于凝膠孔徑上限者，不能進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中。 凝膠床的洗脫體積Ve剛好等于外水體積Vo， 即: Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者下限者，能自由進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)； 凝膠床的洗脫體積Ve應(yīng)等于凝膠床總體積, 即: Ve=V

17、t=Vo+Vi (Kav=1) 則: Vi=Ve-Vo 溶液中的分子大小介于介于凝膠孔徑上限和下限之間者之間者，則有一部分能進入凝膠網(wǎng)孔，故其洗脫體積 Ve是在是在Vo和和Vt之間之間(Kav在在01之間之間)。 凝膠過濾最新凝膠過濾最新 實踐中 測定外水體積（Vo） 通常選用藍色葡聚糖2000作為測定外水體積的物質(zhì)。 理由是： 該物質(zhì)分子質(zhì)量(為200萬)，呈， 在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻， 并可借助本身的顏色，采用肉眼或分光光度計檢測(在210nm或260nm、620nm)洗脫體積Ve，即 Ve = Vo 測定內(nèi)水體積(Vi) 可選用硫酸銨、N乙酰酪氨酸乙酯，或者其他與凝膠無吸附

18、力的小分子物質(zhì)。即： Vi = Ve - Vo凝膠過濾最新l洗脫體積Ve 分子大小介于介于凝膠孔徑上限和下限之間者之間者的洗脫體積Ve也是通過實驗測得。 故可求得某一分離物的Kav值=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。 分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用VeVo或VoVe(R值)表示。這些值的大小見圖6-3。凝膠過濾最新 第三節(jié)第三節(jié) 操操 作作 一、凝膠的選擇和處理一、凝膠的選擇和處理 1凝膠的選擇凝膠的選擇n(1)型號型號 n凝膠型號多。型號不同，篩分范圍亦不相同。 Sephadex G型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。n蛋白質(zhì)脫鹽時，可選用凝膠SephadexG-25。 n

19、一般來說， 在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間分子質(zhì)量差別越大，分離的效果越好。 凝膠過濾最新n(2)(2)粒度粒度 n凝膠的粒度有粗有細(與交聯(lián)度無關(guān))。n細顆粒凝膠之間空間小，裝柱易均一易均一，因此分離效果離效果較粗得較粗得好 (見圖6-4)。 但細顆粒凝膠流速慢流速慢，故宜用用大直徑大直徑的層析柱，這類凝膠用于小型試驗，可得到滿意結(jié)果。 粗顆粒粗顆粒凝膠流速快流速快，宜用于宜用于小直徑小直徑的層析柱，如操作得當也可得到較滿意的結(jié)果。 凝膠過濾最新凝膠過濾最新 2凝膠用量的計算凝膠用量的計算n根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度(見表6-2)，按下面的公式可計算出所需干凝膠的用量： 干凝膠用量（干

20、凝膠用量（g）=r2h / 膨脹度膨脹度 膨脹度膨脹度=床體積床體積/gn用此法計算出的干凝膠用量還需增加10102020，因為凝膠在處理過程中會有一部分損失。 凝膠過濾最新 3凝膠的處理凝膠的處理n將所用的干凝膠慢慢傾人510倍的蒸餾水中，（參照表6-2凝膠溶脹所需的時間）進行充分浸泡n然后用傾斜法除去表面懸浮的小顆粒 n再用0.5molL NaOH-0.5molL NaCl溶液在室溫下浸泡0.5hn以抽濾法除去堿液 n用蒸餾水洗至中性 。凝膠過濾最新n注n為了除去凝膠顆?？障吨械臍馀荩簄可把處理過的凝膠浸泡于蒸餾水或平衡液中用抽氣方法實現(xiàn)。n有時采用加熱煮沸方法，不僅能達到此目的，而且還能

21、加快凝膠的溶脹速度。n但是，必須避免置于酸或堿溶液中加熱 凝膠過濾最新 二、凝膠柱的制備二、凝膠柱的制備 1柱的選擇柱的選擇n當用同樣直徑同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，長長層析柱比短短的分辨率高(見圖6-5、)；n當用同樣長度同樣長度的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，層析柱直徑大大的比小小的分辨率高；n當用同樣體積同樣體積的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，仍是層析柱長長的比短短的分辨率高。n一般理想的層析柱之直徑與長度之比是 1：25 1：100凝膠過濾最新凝膠過濾最新 2裝柱裝柱n裝柱的具體操作與要求按第三章吸附柱層析的裝柱方法進行。 3凝膠柱的鑒定凝膠柱的鑒定 新裝的凝膠柱用適當緩沖液平衡

22、后，將帶色的藍色葡藍色葡聚糖聚糖-2000、或者紅色葡聚糖紅色葡聚糖、細胞色素細胞色素C、血紅蛋白血紅蛋白等物質(zhì)配成2mgml的溶液過柱，觀察色帶色帶是否均勻均勻下降下降。 如均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的，或者說柱中沒有裂縫和氣泡，是可以使用的，否則就須重新裝柱。 如果凝膠柱鑒定時用的是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)類物質(zhì)類物質(zhì)進行，除能起到鑒定柱子的作用外，還可起到克服某些分離物被不不可逆吸附可逆吸附的作用的作用。 凝膠過濾最新 三、加樣與洗脫三、加樣與洗脫 1加樣加樣 加樣量加樣量與測定方法測定方法和層析柱大小層析柱大小有關(guān)。 如測定樣品含量的方法靈敏或床體積小時，加樣量可少，否則反之。 例如： 一般測

23、定蛋白質(zhì)的含量多用紫外分光光度法： 當采用280nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量需5mg左右(柱體積2cm60cm)； 當采用220nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量只需1.2mg左右。 凝膠過濾最新n 一般來說， 加樣量越少， 或加樣體積越小(樣品濃度高時)， 分辨率越高。 n 加樣體積多少為宜? 要視被分離物在層析柱的分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定。 凝膠過濾最新n假設(shè)： A、B兩個被分離物在層析柱中分離， 洗脫體積分別為VeA、VeB， 分配系數(shù)分別為Kav、Kav”。 A、B兩物洗脫體積之差稱為分離體積，以Vs表示。 則Vs=VeA-VeB。凝膠過濾最新n 當，樣品體積(Vp) = Vs

24、時， 理論上的洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開。 實際情況并非如此， 由于樣品流過柱時的擴散作用，其體積會逐漸增大，致使其洗脫體積遠比原來大。 因此， 當Vp Vs時， A、B兩種物質(zhì)就不能完全分開(見圖6-6)； 當VpVs時， A、B兩種物質(zhì)就能分開(見圖6-6I)。凝膠過濾最新凝膠過濾最新n求Vs 根據(jù)Kav = （Ve-Vo）/ （Vt-Vo） 則Ve = Vo+Kav（Vt-Vo） 則Vs = VeA-VeB =（Kav-Kav”）（Vt-Vo） 即，分離效果是與加樣體積、被分離樣品在層析柱中的洗脫體積或分配系數(shù)，以及凝膠床體積有關(guān)。 所以，為了提高分離效果，在一定范圍內(nèi)，加樣體積在一定范

25、圍內(nèi)，加樣體積越小越好越小越好。 此外，樣品的黏度也影響層析的分辨率。 一般使用的樣品黏度以小于小于2，或者與洗脫液的黏度相當為宜。凝膠過濾最新 2洗脫洗脫n洗脫液選擇 能能溶解溶解被洗脫物質(zhì)被洗脫物質(zhì)和不使其變性變性或失活失活為原則。 一般地，都以單一緩沖液單一緩沖液(如磷酸緩沖液、TrisHCl緩沖液等),或者鹽溶液鹽溶液作為洗脫液，有時甚至也可以用蒸蒸餾水餾水作洗脫液。n流速 洗脫時的流速要嚴格控制流速要嚴格控制，否則收集的每一部分洗脫體積就不會恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出。 控制流速的最好裝置是恒流泵恒流泵(微量泵)，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。 若無此裝置

26、，可用控制操作壓的辦法進行。凝膠過濾最新n3.收集收集 分管收集洗脫液。n4.測定測定 選用適當?shù)姆椒ㄟM行定性和定量測定。 凝膠過濾最新凝膠過濾最新凝膠過濾最新凝膠過濾最新凝膠過濾最新凝膠過濾最新 四、凝膠柱的再生及保存四、凝膠柱的再生及保存 1再生再生n僅使用過一次的凝膠柱，通常進行重新平衡后即可再次使用； 使用過多次后，由于凝膠床體積變小、流動速度降凝膠床體積變小、流動速度降低或污染雜質(zhì)過多低或污染雜質(zhì)過多等原因，致使其正常性能受到影響。須進行再生處理。n方法是，先用水水反復(fù)進行逆向沖洗逆向沖洗，再用緩沖液緩沖液進行平衡平衡。平衡畢，即可重復(fù)使用；n另一種方法是，把凝膠倒出，用低濃度低濃度

27、的酸或堿酸或堿按其預(yù)處理方法進行，處理后重新裝柱即可再行使用 凝膠過濾最新 2保存保存n若要短時間短時間保存，則需進行反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并加入適當?shù)姆烂箘┓烂箘?見表6-8)；n若要長時間長時間保存，則需將凝膠從柱中取出，進行洗滌洗滌、脫水脫水和和干燥干燥。 其方法如下： 洗滌洗滌 將凝膠用低濃度低濃度的的酸酸或或堿堿溶液溶液短時間浸泡后， 再用水反復(fù)洗滌水反復(fù)洗滌除去雜質(zhì)、過濾抽干抽干。 脫水脫水 浸泡在50乙醇溶液中進行脫水脫水。 然后，再過濾抽干過濾抽干； 并浸泡在濃度稍高的乙醇度稍高的乙醇溶液中。 如此依次提高乙醇濃度進行反復(fù)處理進行反復(fù)處理， 待乙醇濃度增加

28、至95時，將凝膠抽干； 干燥干燥 置60、烘箱中烘干烘干，可裝瓶保存裝瓶保存。 凝膠過濾最新凝膠過濾最新第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)應(yīng) 用用 一、脫鹽和濃縮一、脫鹽和濃縮n利用鹽類小分子物質(zhì)可以進入凝膠篩孔中，而大分子物質(zhì)則被排阻在其外的原理，可進行蛋白質(zhì)等溶液的脫鹽。n該法脫鹽的速度不僅比透析快，而且不會引起大分子物質(zhì)變性。n此外，利用凝膠的吸水性能，對生命大分子溶液進行濃縮也是很有效的。n一般用于這些操作的材料是細顆粒葡聚糖凝膠G-25。 凝膠過濾最新 二、分離生命物質(zhì)二、分離生命物質(zhì)n對于某些理化性質(zhì)相似(如溶解度、帶電性質(zhì))而分子質(zhì)量不同，或者是聚合體不等的混合溶液，采用凝膠過濾法就很容易分離。

29、三、去熱源物質(zhì)三、去熱源物質(zhì)n去熱源物質(zhì)常常是各種注射劑中的一個難題。n雖然已有一些方法(如活性炭吸附、離子交換吸附等)解決，但均不如凝膠過濾方便。 所謂熱源物質(zhì)可能是糖蛋白一類大分子物質(zhì)。一般在制備水解蛋白、核苷酸和酶注射液時，采用凝膠過濾法去除熱源物質(zhì)效果較好。 凝膠過濾最新 四、測定分子質(zhì)量四、測定分子質(zhì)量 原理：原理： Kav值與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（M）之間存在線性關(guān)系，即： Kav= - b lgM + c 。n先，用分子質(zhì)量的標準物質(zhì)進行過濾層析后求標準曲線。 將已知分子質(zhì)量的標準物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進行過濾層析。物質(zhì)分子質(zhì)量不同，故洗脫體積也不同。 根據(jù)洗脫體積求出Kav值，依Kav= -b lgM + c，繪出一條標準曲線。n后，在同樣條件下，進行未知分子質(zhì)量物質(zhì)的過濾層析后求出其Kav值。 以此值在標準曲線上就能求出其分子質(zhì)量。n用該方法測定分子質(zhì)量，操作簡便，容易掌握，需要樣品量較少，故實用價值頗大 凝膠過濾最新 1用凝膠柱層析制作測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量用凝膠柱層析制作測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標標準曲線的方法準曲線的方法n操作要點操作要點n裝柱 取葡聚糖凝膠G-100，處理后按要求裝柱(2cm60cm