細(xì)胞增殖、凋亡、粘附的測(cè)定方法

1、細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法：四甲基偶氮唑鹽法(MTT)MTT 商品名為噻唑藍(lán)， 是一種黃色的染料。1983 年Mosmann 建立MTT比色法，用于檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖。其原理為活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶-甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死亡的細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。此方法已廣泛用于各種細(xì)胞增殖的檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定4-8等。

2、此方法簡(jiǎn)便、靈敏且無(wú)放射性。MTT 溶液需要放置在4避光保存，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。由于MTT 經(jīng)還原所產(chǎn)生的產(chǎn)物甲瓚不溶于水，無(wú)法直接測(cè)定吸光度，需要被溶解之后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，而且MTT 溶液具有致癌性。需要注意的是，MTT 法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力， 但不能測(cè)定細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。另外， 有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物會(huì)降低MTT 測(cè)定的準(zhǔn)確度，抑制將近95%的MTT 與O2的反應(yīng)，MTT 溶解產(chǎn)物甲瓚會(huì)吸附在納米纖維上， 而致使檢測(cè)的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。內(nèi)鹽法(MTS) MTS 是一種新型的MTT 類(lèi)似物。MTS 在偶聯(lián)劑PMS 存在的條件下， 可被活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性的有

3、色甲瓚產(chǎn)物， 其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)，可用酶標(biāo)儀檢測(cè)。它的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)放射性、快速、安全、方便、靈活及特異性強(qiáng)，同時(shí)又克服了MTT、XTT 的缺點(diǎn)。此方法已應(yīng)用于細(xì)胞增殖的檢測(cè)、藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞毒性的檢測(cè)等，且比MTT法更加準(zhǔn)確。此方法在一定程度上也存在缺陷。最新研究表明在96 孔板試驗(yàn)中， 靠外的孔液體易蒸發(fā)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響24，且不適合于豬淋巴細(xì)胞促有絲分裂反應(yīng)的檢測(cè).細(xì)胞粘附能力測(cè)定：蛋白染料染色法測(cè)細(xì)胞粘附本法是以蛋白染色劑如氨基黑10B來(lái)問(wèn)接測(cè)定96孔板中的細(xì)胞數(shù)目，該法迅速可靠，還可用怍細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和染色細(xì)胞的照像。Schulz 等對(duì)入角化細(xì)胞株Ha

4、CaT 受其亞克隆細(xì)胞株、鼠成纖維細(xì)胞林3T，骨髓瘤細(xì)胞株x63一Ag8653作過(guò)這方面的研究。即用甲醛或戊二醛固定粘附細(xì)胞，吹打去除未牯附的細(xì)胞 而粘附的細(xì)胞用pH3，5的氨基黑染色，先用pH355的鹽酸洗去附著的染料，結(jié)合的蛋白染料可用NaOH 溶解，然后在酶標(biāo)儀上讀取620rim405或750rim處的OD值。若用該法反映未牯附和半粘附的細(xì)胞數(shù)量，可在染色前先離心t然后固定。該法測(cè)量表明，氨基黑的染色吸光度值與細(xì)胞數(shù)、DNA含量呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，直線(xiàn)的回歸斜率對(duì)不同的細(xì)胞而有所不同。另外、該法可用來(lái)測(cè)定某些藥物的細(xì)胞毒作用、LAK細(xì)胞的殺傷作用以及雜交瘤抗體對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增的生物效應(yīng)。E rt

5、t 曾用氟基黑染色法來(lái)問(wèn)接反映24孔板上培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)，但其操作過(guò)程比較繁瑣，如細(xì)胞固定，染色細(xì)胞蛋白質(zhì)沉淀，多次溫育、沖洗、離心、溶解變性強(qiáng)白，最后轉(zhuǎn)移至比色杯中進(jìn)行常規(guī)比色。而本法只需在96孔板上即可進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，敏感性高，時(shí)間短，試劑便宜。但在測(cè)定某種細(xì)胞的粘附性時(shí)，必須先建立其細(xì)胞數(shù)與光密度值之問(wèn)的回歸曲線(xiàn)。因?yàn)槟骋惶囟?xì)胞的直線(xiàn)回歸斜率與該種細(xì)胞的太小及其蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。氨基黑染色法不能區(qū)分死亡細(xì)胞與活的細(xì)胞，但是粘附生長(zhǎng)的細(xì)胞一旦死亡。即可自行脫離吸附的介質(zhì)，被吸出洗去。因此，需要用 cr標(biāo)記和其他物質(zhì)拆記靶細(xì)胞測(cè)定粘附的試驗(yàn)太多可用該法代替。值得注意的是，死亡后仍能附著

6、的細(xì)胞不能用氨基黑染色法測(cè)定粘附性 這時(shí)可以選用中性紅、MTT以及其他臺(tái)適的染色方法。Joni 曾用氨基黑染色法測(cè)定細(xì)胞弱粘附特性-即最小切應(yīng)力粘附測(cè)定(MinimaSheariorce adhesion assay，MSFA)，其步驟與常規(guī)的粘附測(cè)定方法基本一致。不同之處是去除未粘附細(xì)胞時(shí)，在液體中用輕柔的切應(yīng)力去除未粘附的細(xì)胞，這樣強(qiáng)粘附與弱粘附的細(xì)胞可同時(shí)被測(cè)定。MSFA法去除非粘附細(xì)胞的操作方法如下：將孵育后臺(tái)粘附細(xì)胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl鹽液的容器中(容器中含液量約為2.5 升)然后在液體中輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)板避免板孔中形成氣泡，使板孔向下板底向上，這時(shí)可使

7、培養(yǎng)板從液體中升至液面，容器中的鹽液用40ram 長(zhǎng)的轉(zhuǎn)子以300rPm 的轉(zhuǎn)速室溫下攪動(dòng)7分鐘這樣板孔中未桔附的細(xì)胞可技去際 96孔板從NaC鹽液容器中取出時(shí)，要重新翻轉(zhuǎn)板孔向上，然后浸入含100 甲醇的容器中，在甲醇溶液中上下左右轉(zhuǎn)動(dòng)96孔板使鹽波和甲醇充分混臺(tái)切勿使細(xì)胞暴露于空氣中，每過(guò)5分鐘重復(fù)以上動(dòng)作，60分鐘后從甲醇液體中取出96孔板一去掉甲醇，染色細(xì)胞，酶標(biāo)儀上讀取570nm OD值一牯附率的計(jì)算用以下公式： OD570粘附細(xì)胞 粘附率×100 OD570孔中加入的總細(xì)胞用該法測(cè)得的牯附率高于常規(guī)方法的25-3倍，而基礎(chǔ)的非特異性粘附率不變。結(jié)晶紫染色：他是細(xì)胞核染色常

8、用的，用來(lái)顯示染色體的中心體，并可染淀粉、纖維蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)等。凡是用番紅和蘇木精或其他染料染細(xì)胞核不能成功時(shí)，用它能得到良好的結(jié)果。用番紅和結(jié)晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色，所以也是一種顯示細(xì)胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結(jié)晶紫染纖毛，效果也很好。用結(jié)晶紫染色的切片，缺點(diǎn)是不易長(zhǎng)久保存。蘇木精是淡黃色到銹紫色的結(jié)晶體，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。它是染細(xì)胞核的優(yōu)良材料，他能把細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。分化時(shí)組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復(fù)青藍(lán)色，用堿性溶液（如氨水）分化后

9、呈藍(lán)色，水洗后呈藍(lán)黑色。遇光變紅。Giemsa染色法：嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱(chēng)為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞 胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱(chēng)為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱(chēng)為中性物質(zhì)。 m#UOkrO PH對(duì)細(xì)胞染色有影響。細(xì)胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色 偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對(duì)氫離子濃度十分敏感，染色用正經(jīng)片必須清潔，無(wú)酸堿污染。配制瑞特液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必

10、須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識(shí)別困難，甚至造成錯(cuò)誤。MTT(l)接種細(xì)胞:用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔103一104個(gè)細(xì)胞接種于%孔板中(本實(shí)驗(yàn)所接種的細(xì)胞數(shù)是每孔2x103個(gè)細(xì)胞),每孔體積200ul,各組每個(gè)時(shí)相6孔,測(cè)量時(shí)取6孔OD平均值。同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。(2)培養(yǎng)細(xì)胞:將培養(yǎng)板放入COZ孵箱,在37、5%COZ及飽和濕度條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?。(3)呈色:分別于1天、2天、3天、4天和5天,在待測(cè)孔中每孔加入MTT溶液(smg/ml)20

11、ul,37繼續(xù)孵育4一6h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入150ulDMSO,振蕩10min,使其充分溶解。(4)比色:選擇490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值),一記錄結(jié)果。(5)以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。2.1細(xì)胞培養(yǎng)2.1.1細(xì)胞的復(fù)蘇(l)細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒(2)無(wú)菌操作配置好IOml完全細(xì)胞培養(yǎng)液并放入37恒溫水浴箱中預(yù)溫至37并轉(zhuǎn)入無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)備用。(3)從液氮中待復(fù)蘇的細(xì)胞,立即放入37很穩(wěn)水浴箱中輕輕來(lái)回旋轉(zhuǎn),確保細(xì)胞凍存液在1分值之內(nèi)解凍。(4)待細(xì)胞解凍,立即用滴管吸取解凍的細(xì)胞懸液放入裝有預(yù)溫的完全細(xì)胞培養(yǎng)液

12、的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置37、5%C02恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液。2.1.2培養(yǎng)細(xì)胞換液(l)細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2)按常規(guī)操作配制好完全細(xì)胞培養(yǎng)液并放入37恒溫水浴箱中預(yù)溫備用。(3)從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出前一日復(fù)蘇的裝有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。(4)在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用直頭吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液至廢液缸,棄吸管。(5)取新吸管,加入無(wú)血清的不完全培養(yǎng)液,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,把殘存的舊培養(yǎng)液沖掉。(6)棄去無(wú)血清的不完全培養(yǎng)液,加入事先已預(yù)溫的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。(7)蓋好培養(yǎng)瓶的瓶蓋(稍松),置37、5%C02恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(8)清走所有吸管、玻璃用品等,擦拭工作臺(tái)

13、。2.1.3細(xì)胞的凍存(l)細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2)按常規(guī)操作無(wú)菌配制好1.Oml細(xì)胞凍存液。(3)從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出裝有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,擰緊瓶蓋,置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部70一80%面積時(shí)),此時(shí)即可凍存。(4)凍存細(xì)胞24小時(shí)前給細(xì)胞換液。(5)用胰酶消化收集細(xì)胞,重懸在含有完全培養(yǎng)基中,1000印n訂min離心5分全中。(6)去除胰酶及舊的培養(yǎng)液,留細(xì)胞沉渣。加入預(yù)先配制好的細(xì)胞凍存液(含無(wú)血清的不完全培養(yǎng)液7份,純血清2份,DMS01份)。(7)用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,分裝入無(wú)菌凍存管中,每只凍存管內(nèi)加液lml。旋緊凍存管瓶蓋,

14、做好標(biāo)記,用封口膜封住凍存管瓶身及瓶蓋。(8)將裝有細(xì)胞的凍存管依次460分鐘一一2060分鐘一一80過(guò)夜一液氮內(nèi)長(zhǎng)期凍存。2.1.4細(xì)胞的傳代(1)吸除或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。(2)用無(wú)血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次。(3)向瓶?jī)?nèi)加入lml胰蛋白酶消化液,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細(xì)胞表面,然后吸掉或倒掉消化液后再加lml新的消化液,輕輕搖動(dòng)后再倒掉大部分消化液,僅留少許進(jìn)行消化。或者不采用上述步驟,直接加1一Zml消化液進(jìn)行消化,但要注意盡量減少消化液的剩余量。(4)在37或室溫25以上環(huán)境進(jìn)行消化,消化2一5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后,應(yīng)立即

15、終止消化。(5)小心倒掉殘余消化液(不含EDTA)或直接加入含血清的培養(yǎng)液,終止消化。(6)用彎頭吸管,吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液,反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,吹打過(guò)程要順序進(jìn)行,從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束,以確保所有底部都被吹到。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,不要用力過(guò)猛,同時(shí)盡可能不要出現(xiàn)泡沫,以免對(duì)細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡基本原理其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾方面：1. 細(xì)胞核的改變：由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各染色體熒光染

16、料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之。2. 光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，散射光與細(xì)胞的小有關(guān)，而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大；側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大，因此可根據(jù)前散射光和側(cè)散射

17、光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測(cè)凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測(cè)凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來(lái)，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類(lèi)。試劑與儀器l PBS溶液；l PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4避光保存。l 70%乙醇l 400目篩網(wǎng)l 流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)步驟1. 收集細(xì)胞目約（1 5）

18、5;106個(gè)/mL，500 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。2. 3mlPBS洗滌1次。3. 離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4，12小時(shí)。4. 離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。5. 400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，5001000r/min離心5min，棄去PBS。6. 用1mlPI染液染色，4避光30min。7. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。8. 結(jié)果判斷：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降

19、低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門(mén)技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚(yú)的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。注意事項(xiàng)細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。流式檢測(cè)細(xì)胞周期要點(diǎn)： 最關(guān)鍵的就是減少細(xì)胞碎片和單細(xì)胞懸液的制備！1、細(xì)胞消化要理想，資料顯示最好消