慢病毒載體介導(dǎo)GFP標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

1、慢病毒載體介導(dǎo)GFP標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 作者：魏峰，馬愛群，王亭忠，張靜【摘要】 目的 探究慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的理想條件,以獲得穩(wěn)定高表達GFP的MSCs亞群。方法 慢病毒載體介導(dǎo)GFP以25、50、100、200和400的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別作用12h和24h感染MSCs，倒置熒光顯微鏡及流式細胞術(shù)檢測各組的感染效率和熒光強度，MTT法評價感染對MSCs增殖的影響，從而確定理想

2、的感染條件。平皿克隆套環(huán)法挑選理想條件下感染的MSCs單克隆。結(jié)果 MOI為100、200和400作用24h時，感染效率較高，分別為88.94%、99.65%、99.42%;MOI為100和200時，感染對MSCs增殖無影響，MOI為400時，感染的MSCs增殖減慢。挑選MOI為200、作用24h感染組的單克隆細胞，其1月時感染效率為99.95%，且熒光均一、強度很強。結(jié)論 MOI為200作用24h是慢病毒載體介導(dǎo)GFP標記MSCs的理想條件;通過細胞單克隆技術(shù)可獲得穩(wěn)定高表達GFP的MSCs亞群。 【關(guān)鍵詞】 間充質(zhì)干細胞;慢病毒載體;綠色熒光蛋白;單克隆ABSTRACT:Objective

3、 To determine the optimal condition for labeling rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with green fluorescent protein (GFP)infection by lentiviral vector so as to establish a subgroup of MSCs which have a high level of GFP expression. Methods MSCs were infected with GFP by lentiviral vector

4、for 12h or 24h at different MOI (25, 50, 100, 200 and 400). The infection efficiency and fluorescence intensity were analyzed by inverted fluorescent microscopy and flow cytometry. The effect of infection at different MOI on proliferation of MSCs was evaluated by MTT. Based on those mentioned above,

5、 we could determine the optimal condition for infection. Then single cell clones of MSCs labeled with GFP under optimal condition were selected by using cloning rings. Results The efficiency of infection for 24h at MOI 100, 200 and 400 was 88.94%, 99.65% and 99.42%, respectively. The infection had n

6、o significant effect on the proliferation of MSCs infected at MOI 100 or 200, compared with MSCs without infection. However, those MSCs infected at MOI 400 proliferated slowly. The rate of GFP expression on singlecell clone of MSCs infected for 24h at MOI 200 was 99.95%, and their fluorescence inten

7、sity was strong and uniform. Conclusion Infection for 24h at MOI 200 is optimal for labeling rat bone marrow MSCs with GFP by a lentiviral vector. A subgroup of MSCs which have a stably high level of GFP expression can be obtained by single cell cloning technique.KEY WORDS: mesenchymal stem cell; le

8、ntiviral vector; green fluorescent protein; monoclone骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種來源于中胚層具有多向分化潛能的成體干細胞，在一定條件下可分化為軟骨細胞1、神經(jīng)細胞2、胰島細胞3、肺上皮細胞4等各胚層的組織細胞。目前已成為再生醫(yī)學(xué)研究中的熱點細胞。然而穩(wěn)定高效標記MSCs是進行體內(nèi)示蹤研究亟待解決的關(guān)鍵問題。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因具有效率高、外源基因長期穩(wěn)定表達、安全性好5等優(yōu)點。因此，我們擬通過慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)來標

9、記大鼠骨髓MSCs，探討其標記的理想條件，從而建立穩(wěn)定高表達GFP的MSCs亞群，為體內(nèi)深入研究MSCs的分化行為奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料 低糖DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)和胎牛血清購自Gibco公司;Percolls細胞分離液(1.131g/mL)購自Pharmacia公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司;攜帶GFP的慢病毒載體pGC FUGFPLV購自上海吉凱基因化學(xué)有限公司?？寺…h(huán)為Corning公司生產(chǎn);酶標儀為美國BioTek公司生產(chǎn);流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)。1.2 方法1.2.1

10、 大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)及表面標志鑒定 參照文獻方法6，主要采用Percolls密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠骨髓MSCs，流式細胞術(shù)檢測2代MSCs表面CD34、CD45、CD54、CD90的表達。1.2.2 慢病毒載體介導(dǎo)GFP感染MSCs 將3代MSCs制成單細胞懸液，連續(xù)計數(shù)3次，取平均值為最終細胞密度。將細胞稀釋為1×104個/mL，接種于96孔板中(2個時間點，5個MOI梯度，每個梯度3個復(fù)孔，共30個孔)，每孔200L，培養(yǎng)16h后，各孔以25、50、100、200、400的MOI加入攜帶GFP的慢病毒載體，分別感染12h和24h，PBS沖洗5遍，換為不含病毒載

11、體的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每天觀察感染結(jié)果。1.2.3 流式細胞儀檢測GFP的感染效率 將MOI為100、200、400感染24h的MSCs制成單細胞懸液，20g/L的多聚甲醛固定10min，流式細胞儀測定GFP的表達率及平均熒光強度，未感染的MSCs作為對照。1.2.4 MTT法檢測感染后的MSCs增殖情況 MOI為100、200、400感染24h的MSCs和未感染的MSCs共4組，每組7孔，每孔3個復(fù)孔，每孔接種1×103個細胞。培養(yǎng)24h后，加入濃度為5mg/mL的MTT 20L，培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 200L，震蕩培養(yǎng)10min，用全自動酶標儀測定波長490n

12、m處的吸光度(A值)，連續(xù)檢測6d，記錄A值。1.2.5 GFP標記的MSCs的克隆培養(yǎng) 將MOI為200作用24h感染的MSCs制成密度為10個/mL的單細胞懸液。取5mL接種至已補加DMEM和100mL/L血清的90mm培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。16h后，觀察標記單個細胞。約1周后，單個細胞可形成80100個細胞的克隆集落。標記生長良好、熒光強度較強且周圍較大范圍內(nèi)無其他細胞生長的單克隆集落。棄去舊培養(yǎng)基，用沾有少許滅菌凡士林的克隆環(huán)準確套住標記的單克隆集落。于克隆環(huán)中消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)。1.2.6 統(tǒng)計學(xué)

13、分析 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗，顯著性水平=0.05。2 結(jié) 果2.1 MSCs的形態(tài)學(xué)特征及表面標志鑒定 第2代MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)，分布均勻(圖1)，其表達CD54和CD90，不表達CD34和CD456。在整個傳代培養(yǎng)過程中，細胞始終保持其成纖維細胞樣的形態(tài)和較強的增殖能力。2.2 慢病毒載體介導(dǎo)GFP感染MSCs2.2.1 感染后MSCs形態(tài)變化 MOI為25、50、100、200、400作用12h及MOI為25、50、100作用24h的感染組未發(fā)現(xiàn)細胞死亡及細胞形態(tài)改變(圖2A)。作用

14、24h，MOI為200的感染組細胞形態(tài)基本無明顯改變，偶見個別細胞呈中毒樣改變(圖2B);MOI為400的感染組可見部分細胞死亡，一些細胞胞體皺縮，表面粗糙，有顆粒樣物質(zhì)沉積(圖2C)。A：MOI為100，細胞形態(tài)無明顯改變;B：MOI為200，細胞形態(tài)基本無改變，偶見個別細胞呈凋亡樣改變;C：MOI為400，可見較多細胞死亡，部分細胞呈凋亡樣改變。2.2.2 感染后MSCs中GFP的表達 感染后4d，可見較弱的綠色熒光;6d時GFP表達達到高峰，后維持在此高水平。感染后7d，MOI為25、50、100、200、400作用12h及MOI為25、50作用24h的感染組感染率相對較低，且熒光強度較

15、弱。作用24h，MOI為100的感染組感染率超過80%，MOI為200和400的感染組感染效率超過90%，且熒光強度較強(圖3)。經(jīng)流式細胞術(shù)分析，作用24h，MOI為100、200和400的感染組感染效率分別為88.94%(圖4A)、99.65%(圖4B)和98.88%(圖4C)，平均熒光強度分別為194.87、818.38和586.79。2.3 GFP感染對MSCs增殖的影響 感染后16d，與未感染的MSCs(MOI為0)相比，作用24h，MOI為100和200的感染組細胞生長速度無明顯變化;MOI為400的感染組細胞生長速度相對較慢，4d后生長速度則明顯加快。MTT檢測結(jié)果顯示：各組細胞

16、在接種后24h，開始進入明顯的增殖期，MOI為400的感染組，細胞增殖相對較慢，4d后生長速度明顯加快(圖5)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，MOI為400的感染組，相對未感染組細胞增殖較慢(P=0.001);MOI為100和200的感染組，相對于未感染組細胞增殖無顯著性差異(P=0.285，P=0.070)。2.4 感染1月后GFP在MSCs中的表達 MOI為200作用24h的感染組感染后1月，細胞仍保持成纖維細胞樣形態(tài)，GFP的表達仍維持在較高的水平，但熒光強度稍有減弱，且熒光強弱不等。經(jīng)流式細胞儀檢測分析，GFP的表達率為99.38%，平均熒光強度為785.32(圖4D)。圖4 不同感染條件及觀察時間M

17、SCs的感染效率及熒光強度分析Fig.4 Analysis of infection efficiency and fluorescence intensity of MSCs infected at different MOI and time pointsA：作用24h，MOI為100感染后1周的感染效率;B：作用24h，MOI為200感染后1周的感染效率;C：作用24h，MOI為400感染后1周的感染效率;D：作用24h，MOI為200感染后1月GFP的表達;E：作用24h，MOI為200感染組單克隆細胞1月后GFP的表達。2.5 標記的MSCs單克隆細胞生長特征及其GFP的表達 將MO

18、I為200作用24h感染的MSCs以低密度均勻接種至培養(yǎng)皿，12h后，可見形態(tài)呈梭形的單個細胞均勻分布于培養(yǎng)皿中。2436h后，單個細胞開始增殖并形成第一個子代細胞，呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)(圖6A)。7d左右，單個細胞可生長成60100個大小和形態(tài)一致的細胞克隆集落，其熒光均勻一致，強度很強(圖6B)。1月后，經(jīng)流式細胞儀檢測分析，GFP的表達率為99.95%，平均熒光強度為999.49(圖4E)。3 討 論MSCs可通過分泌相關(guān)細胞因子和向心肌方向分化而改善受損的心臟功能710;同時因其具有取材方便、增殖快速、無倫理學(xué)問題等優(yōu)勢而成為研究心血管組織再生的熱點細胞之一。對MSCs進行標記和示

19、蹤是研究其在不同微環(huán)境下生物學(xué)行為的基礎(chǔ)。我們通過慢病毒載體介導(dǎo)GFP標記大鼠骨髓MSCs可獲得感染率高、表達穩(wěn)定持久、熒光強度較強的MSCs，為進一步研究和長期觀察其在體內(nèi)環(huán)境下的生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。本研究顯示：不同感染條件下，MOI為200作用24h的感染組細胞形態(tài)無明顯改變，其感染效率及平均熒光強度最高，分別達到99.65%和818.38;MTT分析顯示此感染條件對MSCs的增殖無明顯影響。故將MOI為200作用24h作為慢病毒載體介導(dǎo)GFP標記大鼠骨髓MSCs的理想條件。MOI為200作用24h的感染組連續(xù)體外觀察1月，細胞形態(tài)未見明顯改變，GFP的表達率為99.38%，平均熒光強度

20、為785.32，提示感染后1月，GFP的表達及熒光強度仍然維持在相對較高的水平。但熒光強度相比感染后1周稍有減弱，結(jié)合感染后不同時間點觀察，各感染組細胞均存在熒光強弱不均一的問題。我們進一步通過細胞單克隆技術(shù)獲得了MOI為200感染24h的MSCs單克隆細胞，觀察1月后，其GFP的表達率為99.95%，平均熒光強度為999.49，且其熒光強弱及細胞大小形態(tài)均勻一致。因此，其可成為進一步進行體內(nèi)研究所需的帶有示蹤標記的理想種子細胞。病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，其感染效率隨MOI值及作用時間的增加而增高，但作用時間和MOI值過高，可能會造成明顯的細胞毒性。本實驗中MOI為400作用24h時，即造成了明顯

21、的細胞毒性;其他組未見明顯細胞毒性，且感染效率隨MOI值及作用時間的增加而增高，但MOI為400作用24h時，感染效率和熒光強度則低于MOI為200作用24h的感染組，可能因濃度過高引起細胞中毒、生長狀態(tài)不佳所致。目前標記活細胞的方法主要有基因標記法、磁性標記法、5溴脫氧尿嘧啶(5BrdU)標記法、熒光染料標記法等。磁性標記法11適用于臨床研究和大動物的實驗研究，同時需要特殊儀器;5BrdU和染料DAPI、CMDiI12、CFSE13等標記細胞，標記效率高，但隨時間的延長和細胞的分裂增殖，標記物會逐漸衰減消失;基因標記使用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于短時間的活細胞示蹤，且轉(zhuǎn)染率相對較低。本實驗建立的穩(wěn)定

22、高表達GFP的MSCs可為活細胞示蹤特別是長時間觀察其生物學(xué)行為提供了一種理想的選擇?！緟⒖嘉墨I】 1YOKOYAMA M, MIWA H, MAEDA S, et al. Influence of fetal calf serum on differentiation of mesenchymal stem cells to chondrocytes during expansion J. J Biosci Bioeng, 2008, 106(1):4650.2GRECO SJ, ZHOU C, YE JH, et al. A method to generate human mesench

23、ymal stem cellderived neurons which express and are excited by multiple neurotransmitters J. Biol Proced Online, 2008,10:90101.3GAO F, WU DQ, HU YH, et al. In vitro cultivation of isletlike cell clusters from human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells J. Transl Res, 2008, 151(6):293302

24、.4POPOV BV, SERIKOV VB, PETROV NS, et al. Lung epithelial cells induce endodermal differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism J. Tissue Eng, 2007, 13(10):2441.5BAUER G, DAO MA, CASE SS, et al. In vivo biosafety model to assess the risk of adverse events from re

25、troviral and lentiviral vectors J. Mol Ther, 2008, 16(7):13081315.6WANG TZ, XU ZY, JIANG WH, et al. Celltocell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell J. Int J Cardiol, 2006, 109(1):7481.7Hu XY, Yu SP, FRASER JL, et al. Transplantation of hypoxiapreconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis J. J Thorac Cardiov Sur, 2008, 135(4):799808.8POTAPOVA IA, DORONIN SV, KELLY DJ, et al. Enhanced recover