熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中α突觸核蛋白毒性的作用

1、熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中-突觸核蛋白毒性的作用【摘要】 目的探討HSP70在因-突觸核蛋白過表達(dá)或突變所致的帕金森病(PD)細(xì)胞模型中的作用及其機(jī)制。方法構(gòu)建過表達(dá)野生型和PD相關(guān)突變型(A53T)-突觸核蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)細(xì)胞后得PD細(xì)胞模型;然后在細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染表達(dá)HSP70的質(zhì)粒。采用免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染HSP70細(xì)胞模型中-突觸核蛋白表達(dá)量的改變;采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HSP70后細(xì)胞模型活力的變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染HSP70后，細(xì)胞模型-突觸核蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞活性增加。結(jié)論HSP70通過降低-突觸核蛋白表達(dá)水平對(duì)PD細(xì)胞模型發(fā)揮保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】

2、-突觸核蛋白;熱休克蛋白70;過表達(dá)-突觸核蛋白是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前表達(dá)的可溶性蛋白,具有調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性和神經(jīng)可塑性等生理功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，-突觸核蛋白基因過表達(dá)或突變可引起-突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊、有毒蛋白寡聚體和多聚體的形成，使其結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)致多巴胺能系統(tǒng)損傷，最終導(dǎo)致帕金森病(PD)。研究認(rèn)為神經(jīng)保護(hù)劑可能是治療PD的一個(gè)新的有效途徑，而熱休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。HSP70是分子伴侶家族中的一員,作為一種重要的應(yīng)激蛋白,能與錯(cuò)誤折疊的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70還有助于錯(cuò)誤折疊蛋白的降解1，2。在果蠅及酵母的PD模型中

3、發(fā)現(xiàn)，HSP70能減輕-突觸核蛋白的毒性及其引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡3，4,而HSP70抑制-突觸核蛋白毒性可能與其能夠與-突觸核蛋白相互作用，阻止-突觸核蛋白纖維樣聚集，降低-突觸核蛋白表達(dá)量有關(guān)5，6。為進(jìn)一步證實(shí)HSP70在-突觸核蛋白所致PD的作用，本實(shí)驗(yàn)首次在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)PD模型中檢測(cè)了HSP70的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HSP70可以通過降低-突觸核蛋白水平發(fā)揮對(duì)PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司;QIAprep TIP100 Kit購(gòu)自QIAGEN公司;人胎腦cDNA文庫(kù)、胎牛血清(FBS

4、)、Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司;蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)自Sigma公司;anti-synuclein 204抗體、anti-beta-actin抗體購(gòu)自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自Millipore公司。1.2方法1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板，PCR獲得-突觸核蛋白可編碼序列(CDS序列)以Not和Hind連接到pCDNA3.1真核表達(dá)載體中，通過overlap PCR方法，構(gòu)建A53T突變體，同樣以Not和Hind連接到pCDNA3.1真核表達(dá)載體中。按照QlAprep TIP100 Kit Protoc

5、ol抽取并純化質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)。pCDNA3.1-HSP70質(zhì)粒由湘雅二醫(yī)院肝移植中心李杰群博士惠贈(zèng)。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入含2 l Lipofectamine2000及0.8 g質(zhì)粒DNA、不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基500 l，在37，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h。1.2.3免疫熒光將穩(wěn)定表達(dá)蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞接種到有蓋

6、玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于37、5% CO2培養(yǎng)箱中36 h后，棄去培養(yǎng)基，3.7%的多聚甲醛/磷酸緩沖液(PBS)室溫下固定15 min。PBS洗2次，每次5 min。0.2%的TritonX-100/PBS透化10 min，PBS洗2次，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫封閉30 min。加入1400稀釋的anti-synuclein204一抗室溫孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封閉液，室溫封閉20 min。加入1200稀釋的anti-鼠IgG-Cy2二抗100 l，避光室溫下孵育60 min。1×PBS洗3次，每次5 mi

7、n。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核，室溫，避光反應(yīng)2 min。PBS洗2次，每次5 min。去離子水洗1次，封片，用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。1.2.4免疫印跡取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCl，20% Glycerol，4% SDS，0.1% bromphenol blue，pH 6.8)加入蛋白酶抑制劑cocktail裂解細(xì)胞，超聲后，使用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。均取20 g總蛋白經(jīng)18% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入

8、相應(yīng)一抗，4過夜，Tris緩沖生理鹽水溶液(TBST)洗膜后，加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜后，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECL)發(fā)光，曝光。內(nèi)參照為鼠抗-actin單克隆抗體。1.2.5細(xì)胞活力測(cè)定調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度約5×104/ml，以100 l/孔接種于96孔板，24 h后分別轉(zhuǎn)染pCDNA3.1+HSP70;-突觸核蛋白野生型+ pCDNA3.1;-突觸核蛋白野生型+HSP70;-突觸核蛋白A53T+pCDNA3.1;-突觸核蛋白A53T+HSP70;每種處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)

9、4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜(DMSO)100l振蕩混勻，待顆粒溶解后置于酶標(biāo)儀上，空白孔調(diào)零，以570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異比較。2結(jié)果2.1PD細(xì)胞模型的構(gòu)建-突觸核蛋白野生型和突變型A53T在轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，胞漿和胞核都有分布，以胞漿分布為主，部分細(xì)胞-突觸核蛋白呈點(diǎn)狀分布，可能為其聚集體。免疫印跡也顯示，SH-SY5Y細(xì)胞中-突觸核蛋白野生型和突變型A53T都得到了過表達(dá)，說明PD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖1A、B。2.2HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型中-突觸核蛋白的影響了探討HSP70對(duì)PD細(xì)胞模

10、型中過表達(dá)的-突觸核蛋白的作用，將HSP70與-突觸核蛋白進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染，通過免疫印跡檢測(cè)HSP70對(duì)-突觸核蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，無論是在-突觸核蛋白野生型還是突變型PD細(xì)胞模型中，HSP70均能降低-突觸核蛋白的表達(dá)。見圖2。A：免疫熒光檢測(cè)-syunclein 野生型(左圖)與A53T突變體(右圖)在SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為anti -syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為cy2標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。B：western印跡檢測(cè)-syunclein在SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為anti -syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為HR

11、P標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白beta actin。圖1-syunclein過表達(dá)PD模型的建立Western印跡檢測(cè)-syunclein與HSP70共轉(zhuǎn)染后，HSP70對(duì)-syunclein 野生型和突變性表達(dá)量的影響。一抗為anti -syunclein 鼠單克隆抗體，antiHSP70單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白-actin。圖2HSP70降低-synuclein的表達(dá)量2.3HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型活力的影響轉(zhuǎn)染野生型和突變體-突觸核蛋白后，SH-SY5Y細(xì)胞活性明顯降低，說明-突觸核蛋白對(duì)SH-SY5

12、Y具有毒性作用，PD細(xì)胞模型建立成功。而增加HSP70的表達(dá)后，對(duì)比-突觸核蛋白野生型(-synuclein WT)+ pCDNA3.1組和-突觸核蛋白突變型(-synucleinA53T)+pCDNA3.1組，表達(dá)HSP70能分別提高-synuclein WT和-synuclein A53T引起的細(xì)胞活性降低(P<0.01)，見表1。表1MTT檢測(cè)HSP70對(duì)過表達(dá)-syunclein SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響3討論-突觸核蛋白是一種分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢，約1520 kD的可溶性蛋白質(zhì)。自然狀態(tài)下呈一種非折疊構(gòu)象，不形成明顯的三維結(jié)構(gòu)，但其N末端2/3的序列可以形成

13、一系列雙極性區(qū)域，可能介導(dǎo)其與膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合;當(dāng)高濃度或異常修飾時(shí)，構(gòu)象改變形成寡聚體甚至是聚集體，具有細(xì)胞毒性7，8。與單體不同，這類寡聚體富含8片層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡聚體形成過程中，一般先呈包含2030個(gè)-突觸核蛋白分子的圓狀結(jié)構(gòu);隨后因彼此聚合形成鏈狀結(jié)構(gòu)，最終轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的纖維狀結(jié)構(gòu)。這種由單體向纖維狀結(jié)構(gòu)的改變，可能是-突觸核蛋白產(chǎn)生毒性作用的重要原因5，10。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與家族性PD有關(guān)的-突觸核蛋白 A53T及A30P突變蛋白在體外均可以促進(jìn)寡聚體的形成，同時(shí)，野生型-突觸核蛋白的過量表達(dá)也可以導(dǎo)致寡聚體的增加11，12。當(dāng)機(jī)體無法處理有毒的-突觸核蛋

14、白中間體時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致-突觸核蛋白形成聚集體，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生11，13，14。分子伴侶作為一類介導(dǎo)協(xié)助蛋白形成與維持天然構(gòu)象的重要細(xì)胞因子，在-突觸核蛋白蛋白結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中可能發(fā)揮著很重要的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)表明，路易小體中除-突觸核蛋白外，還含有其他蛋白質(zhì)，而HSP是其中重要的蛋白之一15。當(dāng)-突觸核蛋白本身結(jié)構(gòu)的改變或分子伴侶、降解系統(tǒng)出現(xiàn)異常時(shí)，-突觸核蛋白的毒性作用就體現(xiàn)出來了。在模型動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，分子伴侶(HSP70、HSP40)的表達(dá)可減輕-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性。譬如，在PD果蠅模型中，HSP70的表達(dá)可以減輕或阻止-突觸核蛋白引起的神經(jīng)元損傷;而在酵母中HSP70水平的增

15、加也可以有效地減緩或抑制PD的發(fā)生3，4。因此，分子伴侶蛋白可能通過協(xié)助-突觸核蛋白形成并維持正確構(gòu)象而防止其聚集產(chǎn)生有毒害作用的聚集體。本研究中，利用-突觸核蛋白過表達(dá)細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HSP70后能使PD細(xì)胞活性增加，說明HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。過表達(dá)HSP70后，-突觸核蛋白的表達(dá)量也降低，而目前已知-突觸核蛋白是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要因素11，13，14，因此認(rèn)為HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用是通過減少-突觸核蛋白的表達(dá)量的表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的。由于-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性作用與其由單體向寡聚體轉(zhuǎn)化有關(guān)9，10，因此推測(cè)，HSP70可能通過參與維持-突觸核蛋白的正確構(gòu)象，減少其

16、向有毒的寡聚體和聚集體狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞的毒性作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Hartl FU,Hayer-Hartl M.Molecular chaperones in the cytosol：from nascent chainto folded proteinJ.Science，2002;295(5561)：1852-8.2Dzaman-Serafin S,Telatynska-Mieszek B,Ciechanowski K.Heat shock proteins andtheir characteristicsJ.Pol Merkur Lekarski，2005;19(110):215-9

17、.3Auluck PK,Chan HY,Trojanowski JQ,et al.Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinsons diseaseJ. Science，2002;295(5556):865-8.4Flower TR，Chesnokova LS，F(xiàn)roelich CA,et al.Heat shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of Parkinsons disea

18、seJ.J Mol Biol，2005;351(5)：1081-100.5Huang C，Cheng H，Hao S,et al.Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril formation via interactions with diverse intermediatesJ.J Mol Biol，2006;364(3):323-36.6Dedmon MM,Christodoulou J，Wilson MR，et al.Heat shock protein 70 inhibitsalpha-synuclein fibril

19、formation via preferential binding to prefibrillar speciesJ.J Biol Chem，2005;280(15):14733-40.7Jo E,McLaurin J,Yip CM,et al.alpha-Synuclein membrane interactions and lipid specificityJ.J Biol Chem，2000;275(44)：34328-34.8Jo E，Darabie AA，Han K，et al.alpha-Synuclein-synaptosomal membrane interactions：i

20、mplications for fibrillogenesisJ.Eur J Biochem,2004;271(15):3180-9.9Cookson MR，van der Brug M.Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synucleinJ.Exp Neurol，2008;209(1)：5-11.10Goedert M.Parkinsons disease and other alpha-synucleinopathiesJ. Clin Chem Lab Med，2001;39(4)：308-12.11Goedert M.Alpha-synuclein and neurodegenerative diseasesJ.Nat Rev Neurosci,2001;2(7)：492-501.12Moussa CE,Wersinger C,Tomita Y，et al.Differential cytotoxicity of hu