大腸癌早期診斷技術(shù)

1、Septin9基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷 早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌早期發(fā)現(xiàn)大腸癌 無創(chuàng)傷無創(chuàng)傷無恐懼感無風(fēng)險無恐懼感無風(fēng)險 高靈敏高靈敏與腸鏡符合率與腸鏡符合率95.6% 易采樣易采樣僅需抽取靜脈血僅需抽取靜脈血u已經(jīng)獲得了國際專利；u獲得了歐盟CE認(rèn)證；u即將取得美國FDA認(rèn)證，完成了近萬例臨床試驗。u美國和歐洲的著名臨床檢測中心已列為常規(guī)檢測項目，至今已檢測幾十萬例。u美國和歐洲已將此檢測列入醫(yī)療保險。u國內(nèi)正在進行SFDA申報的臨床實驗。u參與國內(nèi)重大課題“五癌”篩查國家項目，并已經(jīng)啟動。Epi公司Septin9基因甲基化進行結(jié)直腸癌早期診斷的國際認(rèn)證1結(jié)直腸

2、癌背景介紹3大腸是消化系統(tǒng)的最后一部分，是一個長約1.5米的較粗的管狀器官。大腸由兩個主要部分組成：結(jié)腸和直腸。它們在腹部彎曲病形成一個圍繞著小腸的長方形。4世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率高u癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年全球約800萬人死于癌癥，其中結(jié)直腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三位，隨著人口趨向老齡化，生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等因素的影響，在西方發(fā)達國家，結(jié)直腸癌已成為僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤。u結(jié)直腸癌是腫瘤中第二大殺手，每年在美國有140,000新發(fā)病例，以及每年導(dǎo)致50,000人死亡；u在發(fā)達國家中，北美和歐洲發(fā)病率最高，每10萬人中

3、就有15-20人死于結(jié)直腸癌； 中國結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率呈急劇上升趨勢u近十年發(fā)病率逐年攀升u每年新發(fā)約40萬人u每年死亡約19.5萬人u每年增速約為4.2%，遠超2%的國際平均水平u已從第六位躍為第三位u在上海是第二位，僅次于肺癌21 2012 中國腫瘤登記年報2 2013年第九屆上海國際大腸癌高峰論壇報道結(jié)直腸癌早期篩查可以拯救生命病人病人5 5年生存率年生存率早期篩查73%73%不做早期篩查46%u結(jié)直腸癌患者在診斷時，80%為中晚期，早期診斷的比例僅為11.8%。u有效的早期篩查和干預(yù)治療可使癌的發(fā)生率下降60%，病死率下降80%篩查可提高結(jié)直腸癌篩查可提高結(jié)直腸癌5 5年生存率年生

4、存率 Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院，上海市疾控中心李世榮, 大腸癌早期診斷的基本策略.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2007. 21(9): p. 22-25 目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：n便潛血檢測 (FOBT)和糞便免疫化學(xué)法（FIT）：主要針對消化道出血；糞便樣本，采樣不方便；假陽性率高，結(jié)果穩(wěn)定性差；受檢率3%n結(jié)腸鏡檢查: 雖然是檢測金標(biāo)準(zhǔn)， 但患者對檢查有恐懼感，存在腸道出血及感染等風(fēng)險，依從性差； 左右半腸結(jié)果差異明顯。受檢率5%n現(xiàn)有方法受檢率低

5、，急需更易于患者接受的早期檢測方法。結(jié)直腸癌的方法和面臨的主要問題便潛血（FOBT) 檢測結(jié)腸鏡檢查患者的需求？早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌無創(chuàng)傷無創(chuàng)傷沒有恐懼感，沒有風(fēng)險沒有恐懼感，沒有風(fēng)險高靈敏高靈敏檢出率高檢出率高易采樣易采樣不臟，不煩，不痛不臟，不煩，不痛v我們提供的方法：我們提供的方法：v采采10ml10ml血樣血樣v95.6%95.6%與腸鏡吻合與腸鏡吻合v可檢測到可檢測到I I期結(jié)腸癌期結(jié)腸癌v當(dāng)日拿到檢測結(jié)果當(dāng)日拿到檢測結(jié)果2Septin9基因檢測項目介紹1011熒光定量PCR技術(shù) 包括 oligos, 聚合酶、和專利的緩沖液對照是基于博爾誠提供的細胞系基于

6、磁珠提取及專利的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化技術(shù)12SEPTIN9SEPTIN9的生物學(xué)功能的生物學(xué)功能人類SEPTIN (SEPT) 蛋白家族成員-13個在在SeptinSeptin蛋白家族中，蛋白家族中，Septin9Septin9蛋白最明顯的蛋白最明顯的特征：特征：長延伸的N端可變區(qū)非極性的脯氨酸富集區(qū)缺少C端螺旋區(qū)Septin蛋白復(fù)合物的形成Septin9 Septin9 獨特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置獨特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置 缺少C端螺旋區(qū)的Septin9 蛋白，使其位于在八聚體復(fù)合中末端。 暴露的Septin9 N端可變區(qū)影響復(fù)合物的整體功能。 保守的Septin9 N端的脯

7、氨酸富集區(qū)決定了復(fù)合物的非極性末端。哺乳動物的Septin蛋白家族形成非極性、棒狀八聚體的復(fù)合物（SEPT9-SEPT7SEPT6SEPT2SEPT2SEPT6SEPT7-SEPT9)。SEPTIN蛋白復(fù)合物在細胞分裂期的作用Septin蛋白復(fù)合物參與細胞分裂的功能： Cytoskeletal scaffold （細胞骨架的支架），平行于肌動蛋白應(yīng)力纖維（Actin filament），為參與肌球蛋白II（Myosin II）活性的分子提供附著點，參與Rho信號通路，涉及細胞類型和功能變化。 Diffusion barrier（膜蛋白擴散障礙），束縛跨膜蛋白和胞內(nèi)膜蛋白的無序擴散。腫瘤細胞具有

8、很高的膜動力學(xué)特征。若若Septin9Septin9蛋白蛋白失調(diào)，失調(diào)，SeptinSeptin蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細胞分裂過程，導(dǎo)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細胞分裂過程，導(dǎo)致細胞朝癌變發(fā)展致細胞朝癌變發(fā)展甲基化5甲基胞嘧啶基因啟動子區(qū)甲基化效應(yīng)：基因表達下降或失活，蛋白水平下降效應(yīng)：基因表達下降或失活，蛋白水平下降甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件Epigenetic changes resulting in transcriptional silencing of cancer genes are among the most frequently discovered even

9、s in human tumor samples and altered chromain structure in 5-regulatory region. Hypermethylation of gene promoter associated CpG islands occurs early during colorectal cancer development, suggesting its utility as a molecular marker for both early detection and monitoring progression of the disease.

10、- Glockner, S.C., et al., Cancer Research, 2009, 69:4691-9在基因啟動子區(qū)域CpG島區(qū)域發(fā)生的甲基化事件，通常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，因此可以把甲基化作為結(jié)直腸癌早期診斷和監(jiān)測疾病進展的分子標(biāo)記物。Septin9基因啟動子gamma區(qū)域的甲基化導(dǎo)致該基因的表達發(fā)生改變發(fā)生甲基化的發(fā)生甲基化的septin9septin9基基因從腫瘤細胞中脫落，因從腫瘤細胞中脫落，進入血管進入血管血液血液游離甲基化片段游離甲基化片段和腫瘤細胞和腫瘤細胞結(jié)直腸癌的癌變與septin9基因甲基化游離游離DNADNA血紅細胞血紅細胞 腫瘤細胞腫瘤細胞德國EpiGen

11、omics公司專利的外周血游離DNA甲基化檢測技術(shù)提高了微量甲基化DNA檢測的靈敏度Blocker引物屏蔽非甲基化的DNA，避免其與探針結(jié)合。特異水解探針的應(yīng)用提高了血液中甲基化基因的檢出率。德國Epigenomics公司在世界不同國家，包括中國都申請了該技術(shù)的專利游離的腫瘤游離的腫瘤細胞細胞DNADNA大腸大腸 血管血管Septin 9Septin 9基因基因的甲基化在腫的甲基化在腫瘤中特異發(fā)生瘤中特異發(fā)生 SEPTIN9 基因甲基化結(jié)直腸癌的檢測原理n外周血采樣n甲基化基因檢測n熒光定量PCR法n自動化結(jié)果判讀自動化結(jié)果判讀腫瘤細胞正常細胞CE數(shù)據(jù)2011.9德國埃爾蘭根大學(xué)醫(yī)學(xué)院提交FD

12、A關(guān)鍵臨床數(shù)據(jù)FDA補充實驗2012.12病例對照 ARUP實驗室 腫瘤病理分期pT1pT4pT1pT4pT0/Tis pT4pT0/Tis pT4病例數(shù)2471847,940300144敏感性80.6%179.3%68%171%190%2特異性99.3%199%80%186%188%2注：CE要求是I期期腫瘤病人。FDA要求腺瘤，原位癌和I期期腫瘤病人。 1) Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.12) Case control study results with ARUPs LDT test published Nov 16, 20112

13、4國內(nèi)臨床驗證實驗顯示SEPTIN9檢測針對中國人群同樣具有高靈敏性和特異性總數(shù)靈敏性特異性結(jié)直腸癌組4785.1% （4047)健康正常組36100% （3636）u檢測樣本總數(shù)83例，包括47例結(jié)直腸癌和36例健康對照u結(jié)果：靈敏性85.1%，特異性100%SEPTIN9 檢測可檢出大部分早期大腸癌Warren, J.D., et al., Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med, 2011. 9: p. 133. SEPTIN9檢測結(jié)腸左右側(cè)

14、無差異左側(cè)腫瘤右側(cè)腫瘤Septin9檢測96.4%94.4%便潛血檢測83.3%50.0%Grutzmann, R., et al., Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3759.注：注：FIT 國內(nèi)不常用。國內(nèi)不常用。這組數(shù)據(jù)結(jié)果是這組數(shù)據(jù)結(jié)果是Epigenomics在美國采用目前最先進靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三在美國采用目前最先進靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者

15、連續(xù)三天取便樣，檢測天取便樣，檢測3次大便標(biāo)本。次大便標(biāo)本。1)Chin J Gastroenterol，2001，Vo|6，No 4 244-2512) Case control study results with Epi proColon 2.0 final product published Sep 19, 2011 3) Case control study results with ARUPs LDT test published Nov 16, 2011方法靈敏性特異性Septin9 2,380.6%99.3%愈刨木酯法gFOBT1便潛血試驗45.8%78.9%免疫法iFOBT1

16、便潛血試驗52.9%86.1%免疫化學(xué)法 FIT(美國數(shù)據(jù)）便潛血（3次便樣）2,368.2%70.6%癌胚抗原CEA2、351.8%85.3%28SEPTIN9結(jié)直腸癌檢測適用于哪些人群u1）一般風(fēng)險人群：大于40歲人群u2）高風(fēng)險人群：結(jié)直腸癌家族史和家族性腺瘤性息肉病,大于20歲人群。炎癥性腸病多年不愈、病變范圍較廣的潰瘍性結(jié)腸炎化放療治療效果評估，術(shù)后檢測。u建議上述人群，每年進行一次結(jié)直腸癌早期篩查。 The Best Screening Test Is the Screening Test That Gets Done .最好的篩查項目是容易操作的項目 -Sidney Winawe

17、r, MD Chief of Gastroenterology at Memorial Sloan Kettering Cancer Center ASCO 2001 The Best Test Is the Test the Patients Can Get and Will Take.最好的檢測是病人能夠做并愿意做的檢測-Durado BrooksAmerican Cancer Societyhttp:/ -2009專家評語SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查檢測周期短DNA提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 5小時整個結(jié)果在8小時內(nèi)完成10ml10ml外周血外周血SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查就診流程u與腸鏡檢測“優(yōu)勢互補”，提高腸鏡的一次陽性檢出率u與腸鏡檢測有很高的符合率可使用的四種熒光定量PCR儀Applied Biosystems 7500 Fast Dx配有SDS 1.4軟件帶有21 CFR part 11Roche LightCycler 480 Instrument ISoftware Version 1.5Roche LightCycler 480 Instrument IISoftware Version 1.5Applied Biosystems 7500 Fast配有SDS 1.4軟件SEPTIN9 結(jié)直腸癌早期篩查早發(fā)現(xiàn)、無創(chuàng)傷、高靈敏、易采樣世界上