流式細胞術基本原理

1、流式細胞術流式細胞術 -原理、操作及應用原理、操作及應用生物化學與分子細胞生物學系 流式實驗室地址：西7樓107室電話：63846590-776423教學參考書教學參考書 實用流式細胞術彩色圖譜。實用流式細胞術彩色圖譜。王樹奎、周振英主編。2004.4 臨床流式細胞分析臨床流式細胞分析。王建中主編。上?？茖W技術出版社。2005.8 流式細胞術原理與應用教程流式細胞術原理與應用教程。吳后男編。北京大學醫(yī)學出版社。2008.2 實用流式細胞術實用流式細胞術-血液病篇血液病篇。劉艷榮主編。北京大學醫(yī)學出版社。2010.9 流式細胞術流式細胞術。陳朱波、曹雪濤編?？茖W出版社。2010.10主要內(nèi)容主要

2、內(nèi)容 一、流式細胞儀結構和原理一、流式細胞儀結構和原理 流式細胞術簡介流式細胞術簡介 流式細胞儀的結構組成流式細胞儀的結構組成 流式細胞儀的光信號檢測流式細胞儀的光信號檢測 流式細胞術數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析流式細胞術數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 流式分選流式分選 二、流式細胞術操作與技巧二、流式細胞術操作與技巧 三、流式細胞術在生物醫(yī)學中的應用三、流式細胞術在生物醫(yī)學中的應用1.1 流式細胞術簡介流式細胞術簡介 流式細胞術（流式細胞術（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術。 流式細胞儀（流

3、式細胞儀（Flow Cytometer ）是集細胞與分子生物學、流體力學、激光技術、光電子技術、計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞術的特點流式細胞術的特點 檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒；檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒； 檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測參數(shù)：多參數(shù)； 檢測特點：單細胞水平分析；檢測特點：單細胞水平分析； 檢測速度：高速，最高達上萬個細胞檢測速度：高速，最高達上萬個細胞/秒；秒； 檢測結果：精度高、準確性好；檢測結果：精度高、準確性好； 可對目標細胞進行分選；可對目標細胞進行分選； 流式：流式：單個細胞單個細胞分析，收集每個細胞的數(shù)據(jù)，更精準

4、；分析，收集每個細胞的數(shù)據(jù)，更精準； WB ：群體群體分析，得到多個細胞的平均值。分析，得到多個細胞的平均值。流式細胞儀的發(fā)展及商品化流式細胞儀的發(fā)展及商品化 1934 Moldavanl: First try (固定式細胞分析固定式細胞分析-流動式流動式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系統(tǒng)鞘流系統(tǒng)(解決難題解決難題)； 1956 Coulter原理原理(血細胞計數(shù)器血細胞計數(shù)器)； 1965 Kamentsky: 分光光度計定量細胞成分和散射光應用；分光光度計定量細胞成分和散射光應用； 1967 Kamentsky等設計了細胞分選的裝置；等設計了細胞分選的裝置； 196

5、9 Vandilla等等: 第一臺熒光檢測細胞計第一臺熒光檢測細胞計(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大學斯坦福大學: 研制出熒光激活細胞分選儀研制出熒光激活細胞分選儀(FACS)； 1973 BD公司與斯坦福大學合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流公司與斯坦福大學合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流 式細胞儀式細胞儀-FACS 。 1975 Kohler和和Milstein: 單克隆抗體技術單克隆抗體技術(促進流式發(fā)展促進流式發(fā)展)。1979年年 國家科委重點項目：國家科委重點項目： 研制國內(nèi)第一臺激光流式細胞儀；研制國內(nèi)第一臺激光流式細胞儀；1982年年 國內(nèi)第一臺三參數(shù)激光流式細胞儀誕生；

6、國內(nèi)第一臺三參數(shù)激光流式細胞儀誕生；1984年年 國家科委組織科研成果的鑒定驗收；國家科委組織科研成果的鑒定驗收；1985年年 獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎；獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎；1985年年-1990年年 靈敏度靈敏度、信噪比信噪比、更多參數(shù)；更多參數(shù)； 流式分選儀研制開發(fā)；流式分選儀研制開發(fā)； 計算機四參數(shù)軟件；計算機四參數(shù)軟件； 樣品制備、醫(yī)學生物學應用。樣品制備、醫(yī)學生物學應用。流式細胞儀的分類流式細胞儀的分類 分析型分析型流式細胞儀流式細胞儀 細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用。細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用。 分選型分選型流式細胞儀流式細胞儀 既能流式分析，

7、還能對分析的目的細胞進行分選；既能流式分析，還能對分析的目的細胞進行分選； 進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細胞儀一般只用于分選。式細胞儀一般只用于分選。BD公司分析型流式細胞儀公司分析型流式細胞儀FACS Calibur 雙激光四色，市場覆蓋率最高LSR II 雙激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 雙激光六色，三激光八色FACS Verse雙激光六色，三激光八色BD公司分選型流式細胞儀公司分選型流式細胞儀FACSVantage SEFACSAria IIIInfluxBeckman Coult

8、er流式細胞儀流式細胞儀Epics XL 單激光四色，市場覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 單激光或雙激光五色，市場覆蓋率高，分析型Gallios 三激光十色，分析型MoFlo XDP 高端分選型1.2 流式細胞儀的結構組成流式細胞儀的結構組成 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 流動室流動室 液流驅動系統(tǒng)液流驅動系統(tǒng) 光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) 激發(fā)光源激發(fā)光源 光束收集系統(tǒng)光束收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉換器光電轉換器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) 噴嘴噴嘴 電偏轉板電偏轉板 樣本收集器樣本收集器1.2.1 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 鞘流技術：根據(jù)層流原理發(fā)鞘流技術：根據(jù)層流

9、原理發(fā)展起來的技術，可以實現(xiàn)兩展起來的技術，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細種液體的同軸流動，樣本細胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。 流體動力學聚焦：穩(wěn)定的液流體動力學聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細胞流直個聚焦收縮作用，細胞流直徑被約束在徑被約束在10-20um，避免，避免了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。鞘液鞘液鞘液鞘液細胞流細胞流激光照射點激光照射點流體動力學聚焦示意圖流體動力學聚焦示意圖（一）（一）流動室流動室和和

10、液流驅動系統(tǒng)液流驅動系統(tǒng) 流動室流動室(flow cell, flow chamber)是流式細胞儀的核心部件。是流式細胞儀的核心部件。流動室中，被測細胞逐個通過，并在此與激光正交。流動室中，被測細胞逐個通過，并在此與激光正交。鞘液Sheath流動室結構圖：單細胞發(fā)生器流動室結構圖：單細胞發(fā)生器液流驅動系統(tǒng)液流驅動系統(tǒng)（二）進樣速率控制（二）進樣速率控制10 psi10.2 psi10 psi10.8 psi 通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進樣速率，而這并通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細胞之間的距離

11、。 高速時樣本流變寬，單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細高速時樣本流變寬，單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細胞數(shù)就增加，這樣會導致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會導致變異系數(shù)增加。1.2.2 光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)（一）（一）激發(fā)光源激發(fā)光源 ：激光器：激光器 氣體激光器：氬離子氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪離子、氪離子 (647nm)、氪氬、氪氬(568nm)； 染料激光器：如氬離子激光泵浦的染料激光器：如氬離子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，發(fā)出光器，發(fā)出550-650nm可變波長激發(fā)光；可變波長激發(fā)光； 半導體激光器半導體激光器：

12、價格低、結構簡單、壽命長。價格低、結構簡單、壽命長。BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半導體激光器。半導體激光器。 激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。 現(xiàn)在儀器常配有儀器選配現(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器，波長多為根激光器，波長多為488nm、633nm和和355nm、405nmUV；（二）光（二）光束成行系統(tǒng)束成行系統(tǒng)FCMFCM的的單細胞照明技術單細胞照明技術：這種：這種橢圓形光斑橢圓形光斑的檢測的檢測區(qū)保區(qū)保證樣證樣本中的細胞是一個一個分別受到最大光照。本中的細胞是一個一個分別受到最大光照。細胞

13、流動方向細胞流動方向（三）光收集系統(tǒng)（三）光收集系統(tǒng) 濾光片濾光片的組成的組成 長通濾片長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；：只允許特定波長以上的光束通過； 短通濾片短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；：只允許特定波長以下的光束通過； 帶通濾片帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long pass Short pass Band pass460 500 540460 500 540460 500 540FACSCalibur流式細胞儀信號檢測系統(tǒng)流式細胞儀信號檢測系統(tǒng) 透射光路透射光路 全反射光路全反射光路FACS Ari

14、a流式細胞儀器信號檢測系統(tǒng)流式細胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.2.3 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電檢測器光電檢測器將光信號轉換成電子信號。將光信號轉換成電子信號。 前置放大電路前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。 模數(shù)轉換器模數(shù)轉換器將模擬的電脈沖信號轉換成數(shù)字信號。將模擬的電脈沖信號轉換成數(shù)字信號。 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。（一）（一）光電檢測器光電檢測器(photodetector) 光電二極管光電二極管(photodiode)光靈敏度

15、低，測定強信號（光靈敏度低，測定強信號（FSC）；）； 光電倍增管光電倍增管(photomultiplier, PMT)光靈敏度高，測定弱信號（光靈敏度高，測定弱信號（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光前向散射光光電二極管光電二極管（二）（二）電信號兩種放大方式電信號兩種放大方式 由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用處理，一般信號的放大可以使用線性線性或或對數(shù)對數(shù)兩種方式。兩種方式。 線性線性(linear; lin) 對數(shù)對數(shù)(logarithmic; log) 一般一

16、般FSC和和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。（三）（三）電脈沖信號的面積電脈沖信號的面積A、高度、高度H和寬度和寬度WCreation of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0Quantification of a Voltage PulseWidth = Area/Height 光信號電信號數(shù)字信號光信號電信號數(shù)字信號 通道通道(channel) 一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管一個光電檢

17、測器就是一個通道，有多少個光電二極管/倍倍增管，就有多少個通道：增管，就有多少個通道： 散射光通道散射光通道: FSC通道和通道和SSC通道；通道； 熒光通道熒光通道 通道命名方式：通道命名方式： 以以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。 以該通道接收的主要熒光素命名，如以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。 For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm兩根激光器，兩根激光器，488nm能檢測能檢測FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3

18、(PerCP)，635能檢測能檢測FL4(APC)，代表，代表Calibur有有6個通道，最多能同時個通道，最多能同時檢測檢測4個熒光，個熒光，6種參數(shù)。種參數(shù)。1.3 流式細胞術光信號檢測流式細胞術光信號檢測 光信號的類型光信號的類型 散射光信號散射光信號：與標記熒光素無關，與標記熒光素無關， 是細胞的固有參數(shù)。是細胞的固有參數(shù)。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC); 側向散射光側向散射光(side scatter, SSC). 熒光信號熒光信號 自發(fā)熒光自發(fā)熒光 ：微弱：微弱 特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出 的熒光，比自發(fā)熒光強很

19、多倍。的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。1.3.1 散射光信號散射光信號（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在信號方向與激光束平行，偏離度一般在1 -6度范圍內(nèi)，度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的體積大小和活力體積大小和活力。（二）側向散射光（二）側向散射光SSC SSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散度散射光，其信號強度反映射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結構的變化細胞內(nèi)部顆粒度和精細結構的變化。（三）散射光的作用（三）散射光的作用 實驗中，常利

20、用實驗中，常利用FSC和和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。粒細胞粒細胞單核細胞單核細胞淋巴細胞淋巴細胞紅細胞、死細胞和碎片紅細胞、死細胞和碎片死細胞死細胞或碎片或碎片粘連粘連細胞細胞腫瘤細胞株腫瘤細胞株FSC/SSC散點圖散點圖死細胞死細胞加藥處理后加藥處理后FSC/SSC散點圖散點圖 通過通過FSC/SSC散點圖，散點圖，gate出目標細胞進行分析。出目標細胞進行分析。（三）閾值（三）閾值 Threshold 閾值：溶液中的雜質或者死細胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾閾值：溶液中的雜

21、質或者死細胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號，所以必須設置閾值，排除雜質、細胞碎片或體積較信號，所以必須設置閾值，排除雜質、細胞碎片或體積較小的死細胞。小的死細胞。 FSC反映細胞體積的大小，反映細胞體積的大小，F(xiàn)CM應用時常選取應用時常選取FSC設定閾值。設定閾值。5%32%默認閾值默認閾值升高閾值后升高閾值后1.3.2 熒光信號熒光信號（一）熒光：（一）熒光： 物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。為高能狀態(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長發(fā)射波長(熒光波長熒光波長)Emission wavelength激發(fā)波長

22、激發(fā)波長Excitation wavelength（二）常用熒光素（二）常用熒光素499nm 藍色熒光（藍色熒光（Blue）； 500-549nm，綠色熒光（，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（，黃色熒光（Yellow）； 585-615nm，橙色熒光（，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（，紅色熒光（Red）； 700nm，遠紅外熒光（，遠紅外熒光（Far-Red）。標記抗體的熒光素標記抗體的熒光素熒光素分子熒光素分子激發(fā)光波長激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長發(fā)射光波長（nm）中文名中文名FITC490520異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE488575藻紅

23、蛋白藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665核酸熒光染料核酸熒光染料PI（碘化丙啶（碘化丙啶 535, 623） 可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于于DNA分析，需要用分析，需要用RNase處理細胞排除處理細胞排除RNA對對DNA熒光定量的影響；熒光定量的影響；PI不能透過活細胞膜，

24、常用于鑒定死細胞。不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。7-AAD（7-氨基放線菌素氨基放線菌素D 545, 647 ） 以插入的方式與以插入的方式與DNA鏈的鏈的G-C堿堿基對結合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞?；鶎Y合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式與可以非嵌入方式與DNA鏈上鏈上的的A-T堿基對特異性結合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的堿基對特異性結合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。定量染料。Hoechst（343, 450）常見為常見為Hoechst33342

25、和和Hoechst33258，非嵌入的，非嵌入的方式與方式與DNA鏈上的鏈上的A-T堿基對結合。能對活細胞染色，用于活細胞堿基對結合。能對活細胞染色，用于活細胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側群細胞的分選。定量分析，如精子分選；還用于側群細胞的分選。PY（派若寧（派若寧 560, 573） RNA染料，能進入活細胞。染料，能進入活細胞。AO（吖啶橙（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進行呈橙黃色熒光，可進行DNA/RNA雙參數(shù)分析。雙參數(shù)分析。其他常用熒光染料其他常用熒光染料測量參數(shù)測量參數(shù)熒光染料熒光

26、染料激發(fā)波長激發(fā)波長(nm)熒光波長熒光波長(nm)報告基因GFP475509YFP514527細胞示蹤染料CFSE495519FAM488525細胞膜電位DiO-C6485505Rhodamine123511546細胞內(nèi)pH值SNARF-1514587/640細胞內(nèi)鈣濃度Fluo3506528Indo-1(low）361485Indo-1(high）330405氧自由基DCFHDA505535（三）熒光抗體的選擇（三）熒光抗體的選擇A 根據(jù)流式細胞儀選擇抗體根據(jù)流式細胞儀選擇抗體 流式細胞儀能檢測的通道數(shù)流式細胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用由激光器種類、數(shù)量和使用的光學濾片決定

27、的光學濾片決定)。如。如FACSCalibur： 多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP 530/30515-545FITC、AF488FL2BP 585/42564-606PEFL3670 LP670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP 661/16653-669APC、AF647（三）熒光抗體的選擇（三）熒光抗體的選擇 本實驗室的本實驗室

28、的FACSCantoII配置兩根激光器激發(fā)六色熒光。配置兩根激光器激發(fā)六色熒光。第一激光器：第一激光器：488nm藍色固態(tài)激光器激發(fā)四色。藍色固態(tài)激光器激發(fā)四色。第二激光器：第二激光器：633nm紅色氦氖激光器激發(fā)二色。紅色氦氖激光器激發(fā)二色。熒光濾片：熒光濾片：488nm激光：激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：激光：660/20nm、780/60nm總共可以檢測總共可以檢測6色熒光色熒光可選擇的熒光如下：可選擇的熒光如下：帶通濾片（帶通濾片（530/30nm）：）：代表允許代表允許530nm 15nm波長波長(515-545nm)的光

29、通過的光通過B 根據(jù)抗原表達強弱合理選擇根據(jù)抗原表達強弱合理選擇抗體抗體 不同的熒光素強度有所不同；不同的熒光素強度有所不同； 高表達的抗原可用不太高表達的抗原可用不太“亮亮”的染料，更的染料，更“亮亮”的熒光素分的熒光素分配給表達低的抗原：配給表達低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進行組合，選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進行組合，同時需要正確的調(diào)節(jié)補償。同時需要正確的調(diào)節(jié)補償。CD51.4 FCM數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析 標準的標準的FCM數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)采用列表模式（列表模式（list mode），記錄

30、了每個，記錄了每個細胞的所有參數(shù)的信息。細胞的所有參數(shù)的信息。 每個細胞檢測每個細胞檢測5個參數(shù)，那么獲取個參數(shù)，那么獲取10000個細胞，容量為個細胞，容量為510000（字或雙字）。（字或雙字）。Event #FSCSSCFL1 FITCFL2 PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015FCM數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖(Histogram) 雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示： 散點圖散點圖(Dot Plot) 偽彩圖偽彩圖(Pseudo-color Plot) 等高線圖等高線圖(Cont

31、our Plot) 密度圖密度圖(Density Plot) 假三維圖假三維圖(Pseudo 3D Plot) 三維圖三維圖(3D Plot) 常用分析軟件常用分析軟件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express直方圖直方圖Histogram 細胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標表示熒光信細胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，單位是道數(shù)，縱坐標一般號或散射光信號相對強度的值，單位是道數(shù)，縱坐標一般是細胞數(shù)。是細胞數(shù)。Event #FL1 FITC110270037204150101001000CountsFITC

32、熒熒光強度光強度 橫坐標既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。橫坐標既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。DNA倍體分析倍體分析抗原表達分析抗原表達分析Overlay圖圖散點圖散點圖 散點圖中每個點代表一個細胞，散點圖中每個點代表一個細胞，X軸與軸與Y軸分別代表一種參軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點是比直方圖直觀。數(shù)，優(yōu)點是比直方圖直觀。FL1FL2散點圖和偽彩圖散點圖和偽彩圖等高圖和密度圖等高圖和密度圖 等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細胞數(shù)目等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細胞數(shù)目越多。相等，越在里面的曲線代表細胞數(shù)目越多。 密度圖：點密度越大的地方細胞越多

33、，點密度越小的地方密度圖：點密度越大的地方細胞越多，點密度越小的地方細胞少。細胞少。假三維圖和三維圖假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 設門與數(shù)據(jù)分析設門與數(shù)據(jù)分析 門門(Gate，簡寫，簡寫G)是流式細胞術中的一個重要術語，是流式細胞術中的一個重要術語，F(xiàn)CM數(shù)數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設門的過程。據(jù)分析過程實際上就是選門和設門的過程。橢圓形橢圓形圓形圓形矩形矩形任意形狀任意形狀 R(Region，區(qū)域，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域。門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾，也可以是幾個區(qū)域組合在一起：個區(qū)域組合在一起：G=R1 an

34、d R2; G=R1 or R2; G=R1 not R2。十字門十字門線性門線性門1.5 流式分選流式分選 電荷式電荷式分選分選超聲振動器超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉板高壓偏轉板收集裝置收集裝置(流式管、培養(yǎng)板流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點斷裂點(充電充電)高壓偏轉板高壓偏轉板四路分選原理四路分選原理電荷式分選裝置電荷式分選裝置液滴延遲液滴延遲 在含有分選細胞的液滴上在含有分選細胞的液滴上準確加電是有效分選的關準確加電是有效分選的關鍵，但是細胞經(jīng)過檢測區(qū)鍵，但是細胞經(jīng)過檢測區(qū)(激光照射點激光照射點)到加電位置到加電位置(斷裂點斷裂點)有一個時間差，這有

35、一個時間差，這稱為液滴延遲稱為液滴延遲(drop delay)。 延遲時間直接影響著分選延遲時間直接影響著分選純度，準確測定延遲時間純度，準確測定延遲時間是一個重要步驟。是一個重要步驟。液滴延遲液滴延遲激光激光斷裂點斷裂點照射點照射點分選指標分選指標 分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。 分選時間由三方面決定：進樣速度、目標細胞所占比例、分選時間由三方面決定：進樣速度、目標細胞所占比例、需要收集的細胞數(shù)。需要收集的細胞數(shù)。需要細胞數(shù)目標細胞所占比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062

36、.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分選時間表分選時間表(機器流速機器流速10000個個/s時時) 分選純度分選純度指被分選出來的細胞所占的百分比，一般能達指被分選出來的細胞所占的百分比，一般能達99%以上。以上。 分選收獲率分選收獲率是指被分選出的細胞與原來總細胞的百分比。是指被分選出的細胞與原來總細胞的百分比。 分選純度和收獲率永遠是相互矛盾的，純度提高，收獲率分選純度和收獲率永遠是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。降低，反之亦然。 富集模式富集模式(enrich mode) 純化模式純化模式(purify mode) 單細胞模式單細胞模式(

37、single cell mode)流式分選和磁珠分選流式分選和磁珠分選 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) 流式分選流式分選 MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) 磁珠分選磁珠分選磁性標記磁性標記未標記的細未標記的細胞先行流出胞先行流出洗脫陽洗脫陽性細胞性細胞陽性分選策略陽性分選策略比較項目比較項目流式分選流式分選(FACS)磁珠分選磁珠分選(MACS)設備要求分選型流式細胞儀專用的磁鐵和柱子操作員要求要求高，需專門培訓 操作簡單，要求不高試劑熒光素偶聯(lián)抗體磁珠結合抗體對細胞刺激刺激大刺激小多參數(shù)分選可以

38、不可以低表達群細胞分選可以不可以胞內(nèi)熒光分選可以不可以流式分選與磁珠分選比較流式分選與磁珠分選比較 流式分選結合磁珠分選的方法，常應用于分選低比例細胞流式分選結合磁珠分選的方法，常應用于分選低比例細胞群。如分選調(diào)節(jié)性群。如分選調(diào)節(jié)性T細胞細胞CD4CD25 CD127low ，先用磁珠分，先用磁珠分選純化選純化CD4 T細胞，再用流式分選的方法分選細胞，再用流式分選的方法分選CD4CD25 CD127low調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T細胞。細胞。二、流式細胞術操作與技巧二、流式細胞術操作與技巧流式細胞術操作流程流式細胞術操作流程：培養(yǎng)細胞血液骨髓新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光染色上機檢測表型測定細胞分選

39、繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學分析 2.1 單細胞懸液制備單細胞懸液制備 2.2 免疫熒光標記免疫熒光標記 2.3 對照的設置對照的設置 2.4 光譜重疊與補償光譜重疊與補償2.1 單細胞懸液制備單細胞懸液制備 2.1.1 新鮮實體組織的樣本制備新鮮實體組織的樣本制備 對于不同組織來源的實體組織和實體瘤標本，應該根據(jù)各對于不同組織來源的實體組織和實體瘤標本，應該根據(jù)各自特點選擇不同的分散細胞方法，以期達到單細胞自特點選擇不同的分散細胞方法，以期達到單細胞產(chǎn)量高產(chǎn)量高、損傷小損傷小的目的。常用方法有：的目的。常用方法有：酶消化法酶消化法機械法機械法化學試劑處理法化學試劑處理法 酶消化法酶消化法：根

40、據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：胰蛋白酶胰蛋白酶水解酯鍵、肽鍵；水解酯鍵、肽鍵；膠原酶膠原酶降解幾種分子類型的膠原；降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶溶菌酶水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶彈性蛋白酶消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。1. 將新鮮組織置于離心管中，加入將新鮮組織置于離心管中，加入1-2ml酶消化酶消化20-30min（恒溫（恒溫37或室溫），間斷振蕩或吹打；或室溫），間斷振蕩或吹打；2. 終止消化，收集細胞懸液，終止消化，收集細胞懸液，300目尼龍網(wǎng)過濾，除去目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團塊，低速離心除去細胞

41、碎片；細胞團塊，低速離心除去細胞碎片；3. 將制備好的單細胞懸液進行熒光標記或保存?zhèn)溆谩⒅苽浜玫膯渭毎麘乙哼M行熒光標記或保存?zhèn)溆谩?注意注意：酶的使用濃度、溫度、消化時間、酶活性的酶的使用濃度、溫度、消化時間、酶活性的pH值。值。機械法特點機械法特點：易造成細胞碎片和團塊，實際操作時，應注意：易造成細胞碎片和團塊，實際操作時，應注意碎片和團塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用碎片和團塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用。組織解離器 機械法機械法：有有剪碎法剪碎法、網(wǎng)搓法網(wǎng)搓法、研研磨法磨法等。等。利用機械方法、物理方利用機械方法、物理方法給予組織交大的壓力，法給予組織交大的壓

42、力，使細胞從組織間分散開使細胞從組織間分散開來。來。 化學處理法化學處理法：作用原理：將組織細胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置作用原理：將組織細胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細胞分散開來，常用試劑有換出來，從而使細胞分散開來，常用試劑有EDTA、EGTA、TPB等。等。EDTA是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成螯合物，實際運用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白螯合物，實際運用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。酶）。 特點特點：用化學法細胞存活率低、細胞產(chǎn)額低，細胞碎片：用化學法細胞存活率低、細胞產(chǎn)額低，細胞碎片和聚集量不穩(wěn)定。和聚

43、集量不穩(wěn)定。 機械法往往造成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低的細胞機械法往往造成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低的細胞產(chǎn)量，注意去除細胞碎片和團塊以免影響產(chǎn)量，注意去除細胞碎片和團塊以免影響FCM結果，如低結果，如低速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團塊等。速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團塊等。 酶消化法、化學試劑處理法對實體組織的分散效果較理想，酶消化法、化學試劑處理法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成分的不良影響。但會造成所測化學成分的不良影響。 根據(jù)實驗目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，最終要根據(jù)實驗目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，最終要求細胞呈單個分散狀態(tài)；細胞碎片、團塊盡量少；細胞活求

44、細胞呈單個分散狀態(tài)；細胞碎片、團塊盡量少；細胞活性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。2.1.2 石蠟包埋組織樣本制備石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um厚的組織片4-5片，放入1試管中；脫脂：加入二甲苯3-5ml脫脂，室溫下1-2天，脫凈后棄二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸餾水3-5ml，3-5min后棄水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒溫水浴30 min，每隔5-10min振蕩一次；終止消化：加冷的PBS或生理鹽水終止消化；過濾：用30

45、0目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；收集細胞懸液：將過濾液離心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速離心沉淀去除碎片；根據(jù)實驗目的標記熒光抗體，或保存細胞備用。2.1.3 血液、骨髓樣本制備血液、骨髓樣本制備 外周血單個核細胞外周血單個核細胞PBMC的分離的分離血液層Ficoll層血漿層PBMCFicoll層紅細胞層離心前離心后Ficoll密度梯度離心法分離密度梯度離心法分離PBMC注意：注意： 由于多核粒細胞比較大，由于多核粒細胞比較大，粒細胞沉降在紅細胞層，粒細胞沉降在紅細胞層，所以該法不適合粒細胞所以該法不適合粒細胞研究；研究； 該法操作過程中可能丟該法操作過程中可能丟失一些有意義

46、的細胞或失一些有意義的細胞或細胞亞群，所以臨床上細胞亞群，所以臨床上一般不主張分離血液或一般不主張分離血液或骨髓的單個核細胞。骨髓的單個核細胞。 紅細胞裂解液去除紅細胞紅細胞裂解液去除紅細胞原理：紅細胞裂解液成分為低滲的原理：紅細胞裂解液成分為低滲的NH4Cl溶液，利用雙溶液，利用雙凹型的紅細胞膜抗性差，白細胞膜抗性比較好的特點，凹型的紅細胞膜抗性差，白細胞膜抗性比較好的特點，加入低滲透壓的紅細胞裂解液時，紅細胞膜脹破，而白加入低滲透壓的紅細胞裂解液時，紅細胞膜脹破，而白細胞膜不受影響，從而達到去除紅細胞的目的。細胞膜不受影響，從而達到去除紅細胞的目的。 溶血溶血/免洗免洗(lyse/no w

47、ash)技術技術臨床上應用溶血臨床上應用溶血/免洗技術，既簡化了操作步驟，又避免洗技術，既簡化了操作步驟，又避免了洗滌過程中可能造成的某些亞群細胞的丟失。尤其免了洗滌過程中可能造成的某些亞群細胞的丟失。尤其在檢測嚴重污染性標本時，避免了因離心等處理可能導在檢測嚴重污染性標本時，避免了因離心等處理可能導致氣溶膠產(chǎn)生引起病毒感染的可能。致氣溶膠產(chǎn)生引起病毒感染的可能。2.1.4 培養(yǎng)細胞單細胞懸液制備培養(yǎng)細胞單細胞懸液制備2.1.5 體液脫落細胞樣本制備體液脫落細胞樣本制備懸浮生長細胞懸浮生長細胞吸管反復吹打吸管反復吹打貼壁生長細胞貼壁生長細胞消化處理消化處理離心獲得單離心獲得單細胞懸液細胞懸液洗

48、脫液洗脫液尿液尿液胸腹水胸腹水離心收集細胞，離心收集細胞，用生理鹽水或用生理鹽水或PBS洗滌洗滌3次次300目尼龍膜目尼龍膜過濾后離心過濾后離心沉淀去上清沉淀去上清單細胞單細胞懸液懸液FCM可檢測下列細胞成分：可檢測下列細胞成分： 表面標記物表面標記物 胞漿標記物胞漿標記物 核內(nèi)標記物核內(nèi)標記物 可溶性成分可溶性成分2.2 免疫熒光染色免疫熒光染色黏附因子黏附因子表面受體表面受體細胞因子細胞因子分泌到胞外的分泌到胞外的細胞因子細胞因子胞內(nèi)抗原胞內(nèi)抗原核酸含量核酸含量核內(nèi)抗原核內(nèi)抗原 熒光素偶聯(lián)抗體熒光素偶聯(lián)抗體 抗體上偶聯(lián)熒光素抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等等)，通過，通過抗原抗體反應讓目

49、標細胞特異性的帶抗原抗體反應讓目標細胞特異性的帶上熒光。上熒光。 染色過程即抗原抗體反應過程。染色過程即抗原抗體反應過程。 熒光染料熒光染料/熒光化合物熒光化合物 PI、DAPI等插入核酸鏈中；等插入核酸鏈中； CFSE和蛋白質共價結合；和蛋白質共價結合； Annexin V-FITC檢測凋亡。檢測凋亡。 熒光蛋白熒光蛋白 如如GFP，不需要染色，直接檢測。，不需要染色，直接檢測。 免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標記的方法難以進行多色標記，而且操作復雜、信噪間接標記的方法難以進行多色標記，而且操作復雜、信噪比高，所以

50、一般首先直標熒光抗體。比高，所以一般首先直標熒光抗體。熒光抗體熒光抗體熒光二抗熒光二抗第一抗體第一抗體直接標記直接標記間接標記間接標記 一般檢測時，獲取一般檢測時，獲取12萬個細胞，標記萬個細胞，標記0.51106細胞即細胞即可。可。 下述情況細胞量需相應增加：檢測胞內(nèi)下述情況細胞量需相應增加：檢測胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細胞周期乙醇固定損失細胞多；檢測細胞在標本次數(shù)多；細胞周期乙醇固定損失細胞多；檢測細胞在標本中比例低中比例低 0.51106個細胞個細胞孵育體積孵育體積50-100ul上機體積上機體積200-500ul終濃度約終濃度約1106個個/ml加染料加染料洗滌后補洗

51、滌后補加液體加液體細胞表面抗原標記細胞表面抗原標記 表面抗原分析是流式應用中最廣泛的，標記步驟表面抗原分析是流式應用中最廣泛的，標記步驟也相對簡單。也相對簡單。 標記：取標記：取0.51106細胞，加入適量抗體細胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說根據(jù)抗體說明書明書)，充分混勻后，充分混勻后(總體積總體積50-100ul)， 4 避光孵育避光孵育10-30min。 洗滌：加入洗滌：加入1ml PBS洗液，洗液，300g離心洗滌離心洗滌5min。 上機檢測：棄去上清后加入上機檢測：棄去上清后加入200-500ul PBS，重懸細胞，重懸細胞后立即上機檢測；如不能及時上機檢測，則加入同樣后立即上機檢測；如

52、不能及時上機檢測，則加入同樣體積的體積的1%多聚甲醛，混勻后置于多聚甲醛，混勻后置于4 冰箱內(nèi)保存，一冰箱內(nèi)保存，一般不超過般不超過24h。胞內(nèi)抗原熒光標記胞內(nèi)抗原熒光標記 細胞內(nèi)抗原：如細胞內(nèi)抗原：如MPO； 核內(nèi)抗原：如核內(nèi)抗原：如FoxP3； 細胞內(nèi)細胞因子細胞內(nèi)細胞因子(胞內(nèi)因子胞內(nèi)因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。等。 固定：固定：4多聚甲醛多聚甲醛 破膜破膜/透化透化 0.05%皂素皂素(saponin)； 0.01% Triton X-100 70% 乙醇乙醇 膜表面抗原染色：分別加入相應的熒光素標記抗體和適量膜表面抗原染色：分別加入相應的熒光素標記抗體和適量細胞標本，充分混勻后避光孵育細胞標本，充分混勻后避光孵育10-30min。 洗滌：加洗滌：加1ml PBS洗液，洗液，300g離心離心5min。 固定：去上清后加入固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲醛，固定多聚甲醛，固定20min。 透化：離心洗去固定劑后，加皂素透化：離心洗去固定劑后，加皂素500 ul，透化，透化10min。 胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后，加入相應熒光素標記胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后，加入相應熒光素標記抗體，混勻后室溫避光孵育抗體，混勻后室溫避光孵育30 min。 洗滌：加洗滌