微生物學(xué)第四章 2015

1、第一節(jié)第一節(jié) 微生物的分離和純培養(yǎng)微生物的分離和純培養(yǎng)第二節(jié)第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)繁殖微生物的生長(zhǎng)繁殖第三節(jié)第三節(jié) 微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因素微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因素& 微生物的分離和純培養(yǎng)微生物的分離和純培養(yǎng)一、一、無菌技術(shù)無菌技術(shù)二、獲得二、獲得純培養(yǎng)純培養(yǎng)的方法的方法|用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)|用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)|單細(xì)胞單細(xì)胞(單孢子單孢子)分離分離|選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)分離|二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物三、三、微生物的保藏技術(shù)微生物的保藏技術(shù) |無菌技術(shù)無菌技術(shù)在微生物研究及應(yīng)用中，不僅需要在微生物研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜天然微生通

2、過分離純化技術(shù)從混雜天然微生物群中物群中分離出分離出特定微生物，且還必特定微生物，且還必須隨時(shí)須隨時(shí)注意保持注意保持微生物純培養(yǎng)物的微生物純培養(yǎng)物的“純潔純潔”，防止防止其他微生物的混入。其他微生物的混入。分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止被其他微生物污染的技術(shù)被稱為被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無無菌技術(shù)，菌技術(shù)，它是保證微生物學(xué)研究正它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵常進(jìn)行的關(guān)鍵。 微生物培養(yǎng)常用器具及滅菌微生物培養(yǎng)常用器具及滅菌試管、玻璃燒瓶、平皿試管、玻璃燒瓶、平皿等是最為等是最為常用的培養(yǎng)微生物的器具，在使常用的培養(yǎng)微生物的器具，在使用前必須用前必須先行滅菌先

3、行滅菌，使容器中不使容器中不含任何生物。含任何生物。培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱為稱為培養(yǎng)培養(yǎng)基基(culture medium)可以加到器皿可以加到器皿中后一起滅菌，也可在單獨(dú)滅菌中后一起滅菌，也可在單獨(dú)滅菌后加到無菌的器具中。后加到無菌的器具中。最常用的滅菌方法是最常用的滅菌方法是高壓蒸汽高壓蒸汽滅菌滅菌，它可殺滅所有生物，包，它可殺滅所有生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高溫干高溫干熱滅菌熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣

4、中雜菌為防止雜菌，特別是空氣中雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜塞子塞口，通常采用適宜塞子塞口，通常采用棉花塞棉花塞，也可采用各種也可采用各種金屬、塑料及硅膠金屬、塑料及硅膠帽帽，它們只可讓空氣通過，而空，它們只可讓空氣通過，而空氣中其他微生物不能通過。氣中其他微生物不能通過。平皿平皿是由正反兩平面板互扣而成，是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生這種器具是專為防止空氣中微生物污染而設(shè)計(jì)。物污染而設(shè)計(jì)。接種操作接種操作用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個(gè)培養(yǎng)器皿無菌條件下把微生物由一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接

5、到另一個(gè)培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，是轉(zhuǎn)接到另一個(gè)培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，是微生物學(xué)研究中微生物學(xué)研究中最常用的基本操作最常用的基本操作。因打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)因打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此境中的其他微生物污染，因此微生物微生物實(shí)驗(yàn)的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)實(shí)驗(yàn)的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行行：在火焰附近進(jìn)行熟練無菌操作，：在火焰附近進(jìn)行熟練無菌操作，或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進(jìn)行操作。進(jìn)行操作。純培養(yǎng)純培養(yǎng)：微生物學(xué)把從一個(gè)細(xì)胞或同：微生物學(xué)把從一個(gè)細(xì)胞或同一個(gè)細(xì)胞群繁殖得到的子代，稱純一個(gè)細(xì)胞群繁殖得到的子代，稱純培養(yǎng)或純種。培

6、養(yǎng)或純種。純培養(yǎng)的類型：純培養(yǎng)的類型： 菌種純（菌落純）：菌種純（菌落純）：是分離菌落而是分離菌落而得到的；得到的； 菌株純（細(xì)胞純）菌株純（細(xì)胞純）：是分離單個(gè)細(xì)：是分離單個(gè)細(xì)胞得到的。胞得到的。稀釋倒平板法稀釋倒平板法涂布平板法涂布平板法平板劃線分離法平板劃線分離法稀釋搖管法稀釋搖管法用用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)|用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 不同微生物在特定培養(yǎng)基上形成的不同微生物在特定培養(yǎng)基上形成的菌落或菌苔一般都具穩(wěn)定特征，可菌落或菌苔一般都具穩(wěn)定特征，可成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。重要依據(jù)。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌

7、，大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌，以及許多真菌和單細(xì)胞藻類能在固以及許多真菌和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立菌落，采用適體培養(yǎng)基上形成孤立菌落，采用適宜的平板分離法很易得到純培養(yǎng)。宜的平板分離法很易得到純培養(yǎng)。所謂（所謂（培養(yǎng)培養(yǎng)）平板，平板，是指熔化是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。的平皿。固體培養(yǎng)方法可將單個(gè)微生物固體培養(yǎng)方法可將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面?；蚶锩?。固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基，可使每個(gè)孤立活，可使每個(gè)孤立活微生物體生長(zhǎng)、繁殖形成微生物體生長(zhǎng)、繁殖形成菌落菌落，形

8、成的菌落便于移植。形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。平板。Koch建立的建立的平板分離微平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，簡(jiǎn)便易行，100多年來一直是各種菌種分離多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。的最常用手段。稀釋倒平板法稀釋倒平板法 待分離材料用無菌水作一系列稀釋，取待分離材料用無菌水作一系列稀釋，取不同稀釋液少許，與熔化且冷卻至不同稀釋液少許，與熔化且冷卻至50左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成滅過菌培養(yǎng)皿

9、中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間，可可能含菌平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間，可能出現(xiàn)在平板表面的能出現(xiàn)在平板表面的單個(gè)菌落單個(gè)菌落，該菌落，該菌落可能是由一個(gè)菌體繁殖形成。隨后挑取可能是由一個(gè)菌體繁殖形成。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可可得到純培養(yǎng)得到純培養(yǎng)。涂布平板法涂布平板法 在微生物學(xué)研究中更常用的純種分在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。離方法是涂布平板法。其做法其做法是先是先將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的

10、樣品懸液滴加定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。 Pour plate Pour plate Pour plate |平板劃線分離法平板劃線分離法 用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式連平行劃線、扇形劃線或其他形式連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)增加而減少，并逐步分散開線次數(shù)增加而減少，并逐步分散開來

11、，如果劃線適宜，微生物能一一來，如果劃線適宜，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。到單菌落。 |稀釋搖管法稀釋搖管法 對(duì)厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離對(duì)厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法稀釋搖管培養(yǎng)法。將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后，冷卻并保管加熱使瓊脂熔化后，冷卻并保持在持在50左右，梯度稀釋待分離左右，梯度稀釋待分離材料，試管均勻，冷凝，傾注一材料，試管均勻，冷凝，傾注一層滅菌液體石蠟和固體石蠟混合層滅菌液體石蠟和固體石蠟混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌

12、落形成在瓊脂柱中間，培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱中間，挑取和移植單菌落。挑取和移植單菌落。液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 1)接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋。2)高度稀釋高度稀釋,一支試管分配不到一個(gè)微生物。一支試管分配不到一個(gè)微生物。3)必須在同一個(gè)稀釋度的許多平等試管中，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平等試管中，大多數(shù)（大多數(shù)（95%以上）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。以上）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。4)有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物就認(rèn)有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物就認(rèn)為是純培養(yǎng)。為是純培養(yǎng)。適宜于不能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物如適宜于不能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物如一一 些細(xì)胞

13、大的細(xì)菌、些細(xì)胞大的細(xì)菌、 原生原生 動(dòng)物和藻動(dòng)物和藻 類。類。 較大的微生物較大的微生物，可用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，可用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去并在大量滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染?？稍诘捅讹@微鏡，如解較小微生物的污染。可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。剖顯微鏡下進(jìn)行。 個(gè)體相對(duì)個(gè)體相對(duì)較小的微生物較小的微生物，需采用顯微操作儀。，需采用顯微操作儀。市售顯微操作儀種類多，一般是通過機(jī)械、市售顯微操作儀種類多，一般是通過機(jī)械、空氣或油壓傳動(dòng)裝置來減小手的動(dòng)作幅度，空氣或油壓傳動(dòng)裝置來減小手的動(dòng)作幅度，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑在顯

14、微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。對(duì)取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，操作技術(shù)有比較高的要求，多限于多限于高度專業(yè)高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用?；目茖W(xué)研究中采用。單細(xì)胞單細(xì)胞(單孢子單孢子)分離分離 |選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)基直接分離選擇培養(yǎng)基直接分離 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng) |選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)分離沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生條件能夠滿足自然界中一切生物生長(zhǎng)要求，在一定程度上所物生長(zhǎng)要求，在一定程度上所有培養(yǎng)基都是選擇性的。迄今，有培養(yǎng)基都是選擇性的。迄今，能培養(yǎng)的微生物能培養(yǎng)

15、的微生物1%，不可培，不可培養(yǎng)養(yǎng)99%。在一種培養(yǎng)基上接種。在一種培養(yǎng)基上接種多種微生物，只有能生長(zhǎng)的才多種微生物，只有能生長(zhǎng)的才生長(zhǎng)，其他被抑制。生長(zhǎng)，其他被抑制。 如果某微生物生長(zhǎng)需要是已知的，也如果某微生物生長(zhǎng)需要是已知的，也可設(shè)計(jì)一套特定環(huán)境使之特別適合這可設(shè)計(jì)一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長(zhǎng)，因而能從自然界混種微生物的生長(zhǎng)，因而能從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，即使在混雜的微生物群體培養(yǎng)出來，即使在混雜的微生物群體中這種微生物可能中這種微生物可能只占少數(shù)。只占少數(shù)。通過選通過選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物

16、純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為稱為選擇培養(yǎng)分離，選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，是十分重要的，特別對(duì)于從自然界中分離、尋找有用特別對(duì)于從自然界中分離、尋找有用的微生物。的微生物。 無氮培養(yǎng)基無氮培養(yǎng)基篩出篩出固氮菌固氮菌；加剛果紅或結(jié)晶紫的加剛果紅或結(jié)晶紫的YMA篩出篩出根瘤菌根瘤菌；無有機(jī)碳源的培養(yǎng)基無有機(jī)碳源的培養(yǎng)基篩出篩出硝化細(xì)菌硝化細(xì)菌；無有機(jī)碳源的培養(yǎng)基且無氧有光環(huán)境無有機(jī)碳源的培養(yǎng)基且無氧有光環(huán)境篩篩出出光合細(xì)菌光合細(xì)菌；高濃度高濃度NaCl的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基篩出篩出耐鹽菌株耐鹽菌株;伊紅伊紅美藍(lán)的培養(yǎng)基美藍(lán)的培養(yǎng)基篩出篩出大腸桿菌大腸桿菌；青霉素的培養(yǎng)基青霉素的培養(yǎng)基篩出篩出酵母菌、霉菌酵母菌、

17、霉菌;加某抗生素的平板加某抗生素的平板篩出相應(yīng)篩出相應(yīng)抗生素抗生素抗性抗性菌株菌株;陽(yáng)性克隆子陽(yáng)性克隆子的篩選；的篩選；溶磷菌溶磷菌解鉀菌解鉀菌拮抗菌拮抗菌 富集培養(yǎng)：富集培養(yǎng)：主要是指利用不同主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，而使其在群落中的數(shù)量大大增加，更易從自然界中分離到所需的特更易從自然界中分離到所需的特定微生物。定微生物。富集條件富集條件可據(jù)分離的微生物特點(diǎn)可據(jù)分離的微生物特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物及綜合多個(gè)從

18、物理、化學(xué)、生物及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫、紫外線、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)外線、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)等許多方面。等許多方面。 用途：用途：富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無窮盡組合形式可生理?xiàng)l件的幾乎無窮盡組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，只要掌握這種物種類的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富

19、集培養(yǎng)微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計(jì)的特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物，計(jì)的特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長(zhǎng)。這種特定的環(huán)境中生長(zhǎng)。例：例：采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對(duì)羥基苯甲酸的微生物的實(shí)驗(yàn)過程： （1）首先配制以對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間，原來透明的培養(yǎng)液會(huì)變得渾濁，說明已有大量微生物生長(zhǎng)。（2）取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)

20、，該過程經(jīng)數(shù)次中重新培養(yǎng)，該過程經(jīng)數(shù)次重復(fù)后能利用對(duì)羥基苯甲酸的微生重復(fù)后能利用對(duì)羥基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中大大提高，將物的比例在培養(yǎng)物中大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對(duì)培養(yǎng)液涂布于以對(duì)羥基苯甲酸為唯羥基苯甲酸為唯一碳源一碳源的瓊脂平板，得到的微生物的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對(duì)羥基菌落中的大部分都是能降解對(duì)羥基苯甲酸的微生物。苯甲酸的微生物。（3）挑取一部分單菌落分別接挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對(duì)羥基苯甲酸種到含有及缺乏對(duì)羥基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中大部分在含有對(duì)羥基苯甲酸中大部分在含有對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在沒有

21、對(duì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在沒有對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為不生長(zhǎng)，說明通過該富集程序不生長(zhǎng)，說明通過該富集程序得到了欲分離的目標(biāo)微生物。得到了欲分離的目標(biāo)微生物。（4 4）通過富集培養(yǎng)使原本在自然通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過稀釋大大提高后，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到倒平板或平板劃線等操作得到純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物。|二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物 只有一種微生物的培養(yǎng)物稱只有一種微生物的培養(yǎng)物稱純培養(yǎng)純培養(yǎng)物物，含二種以上微生物的培養(yǎng)物稱，含二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為為混合培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物

22、中只，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，且是有意識(shí)地保含有二種微生物，且是有意識(shí)地保持二者間特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱持二者間特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱二元二元培養(yǎng)物培養(yǎng)物。二元培養(yǎng)物是保存病毒的。二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑。對(duì)于這些生物，二元最有效途徑。對(duì)于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實(shí)驗(yàn)室控制條件下可能培養(yǎng)物是在實(shí)驗(yàn)室控制條件下可能達(dá)到最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。達(dá)到最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。 |微生物的保藏技術(shù)微生物的保藏技術(shù)z傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)保藏z冷凍保藏冷凍保藏z干燥保藏法干燥保藏法菌種保藏菌種保藏就是根據(jù)菌種特性就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，

23、使其物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。存活而得以延續(xù)。保藏技術(shù)的要求保藏技術(shù)的要求(不死亡不死亡，不不會(huì)被其他微生物污染，不會(huì)會(huì)被其他微生物污染，不會(huì)因發(fā)生變異而丟失重要的生因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀物學(xué)性狀)菌種或培養(yǎng)物保藏的菌種或培養(yǎng)物保藏的重要性重要性菌種保藏機(jī)構(gòu)：菌種保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(CCCCM)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，美國(guó)典型菌種保藏中心美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)，世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)(WFGC) 。|傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)保藏常用的有常用的有瓊脂斜面瓊脂斜面、半固體瓊半固

24、體瓊脂柱脂柱及及液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)等。等。選擇使用選擇使用適宜的培養(yǎng)基適宜的培養(yǎng)基，并在，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行移種規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行移種。傳代培養(yǎng)十分繁瑣，容易傳代培養(yǎng)十分繁瑣，容易污染污染，特別是由于菌株的特別是由于菌株的自發(fā)突變自發(fā)突變而而導(dǎo)致導(dǎo)致菌種衰退菌種衰退，使菌株的形態(tài)、使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化生變化 。|冷凍保藏冷凍保藏使微生物處于冷凍狀態(tài)，使微生物處于冷凍狀態(tài)，代謝代謝作用停止作用停止以達(dá)到保藏目的。以達(dá)到保藏目的。微生物細(xì)胞對(duì)微生物細(xì)胞對(duì)低溫敏感低溫敏感，可用，可用速凍、快速升溫和添加各種保速凍、快速升溫和添加各種保護(hù)劑等手段。護(hù)劑

25、等手段。液氮保藏或液氮保藏或-70低溫保藏。低溫保藏。用用普通冰箱普通冰箱冷凍保存菌種的效冷凍保存菌種的效果往往遠(yuǎn)低于低溫冰箱，應(yīng)注果往往遠(yuǎn)低于低溫冰箱，應(yīng)注意意經(jīng)常檢查保藏物的存活情況，經(jīng)常檢查保藏物的存活情況，隨時(shí)轉(zhuǎn)種隨時(shí)轉(zhuǎn)種。 |干燥保藏法干燥保藏法水分對(duì)各種生化反應(yīng)和一切水分對(duì)各種生化反應(yīng)和一切生命活動(dòng)至關(guān)重要，因此，生命活動(dòng)至關(guān)重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技術(shù)中另一項(xiàng)經(jīng)常生物保藏技術(shù)中另一項(xiàng)經(jīng)常采用的手段。采用的手段。沙土管保存沙土管保存和和冷凍真空干燥冷凍真空干燥保藏保藏是最常用的二項(xiàng)微生物是最常用的二項(xiàng)微生物干燥保藏技術(shù)。干燥保藏技術(shù)。u沙

26、土管保存沙土管保存主要適用于產(chǎn)孢子微生物主要適用于產(chǎn)孢子微生物，如芽，如芽孢桿菌、放線菌等。將菌種接種孢桿菌、放線菌等。將菌種接種培養(yǎng)，長(zhǎng)出大量的孢子，洗下孢培養(yǎng)，長(zhǎng)出大量的孢子，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙子制備孢子懸液，加入無菌的沙土試管中，減壓干燥，抽干水分，土試管中，減壓干燥，抽干水分，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法簡(jiǎn)便易行，并置冰箱保存。此法簡(jiǎn)便易行，并可以將微生物保藏較長(zhǎng)時(shí)間，適可以將微生物保藏較長(zhǎng)時(shí)間，適合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。種的發(fā)酵工廠采用。 |冷凍真空干燥保藏冷凍真空干燥保藏將

27、加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，經(jīng)真空冰升華作用除水分。達(dá)到干經(jīng)真空冰升華作用除水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體密閉燥的樣品可在真空或惰性氣體密閉環(huán)境中置低溫保存，環(huán)境中置低溫保存，使微生物處于使微生物處于干燥、缺氧及低溫、休眠狀態(tài)，干燥、缺氧及低溫、休眠狀態(tài)，可可達(dá)到長(zhǎng)期保藏目的。達(dá)到長(zhǎng)期保藏目的。冷凍真空干燥保藏冷凍真空干燥保藏是目前使用最普是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，遍，也是最重要的微生物保藏方法，為大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)均采為大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)均采用。用。& 微生物的生長(zhǎng)繁殖微生物的生長(zhǎng)繁殖 一、細(xì)菌的群體生長(zhǎng)繁殖一

28、、細(xì)菌的群體生長(zhǎng)繁殖 （一）分批培養(yǎng)中細(xì)菌的群體生長(zhǎng)分批培養(yǎng)中細(xì)菌的群體生長(zhǎng)繁殖繁殖（二）（二）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)二、微生物二、微生物群體生長(zhǎng)的測(cè)定群體生長(zhǎng)的測(cè)定 l計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法 l重量法重量法l生理指標(biāo)法生理指標(biāo)法 |微生物生長(zhǎng)繁殖微生物生長(zhǎng)繁殖 微生物生長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。的生物學(xué)過程。繁殖繁殖是微生物生長(zhǎng)到一定階段，是微生物生長(zhǎng)到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物即引起生命個(gè)

29、體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。學(xué)過程。生長(zhǎng)與繁殖是兩個(gè)相互聯(lián)系的概念。生長(zhǎng)與繁殖是兩個(gè)相互聯(lián)系的概念。生長(zhǎng)生長(zhǎng)是一個(gè)逐步發(fā)生的是一個(gè)逐步發(fā)生的量變量變過程，過程，繁殖繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新生命個(gè)體的是一個(gè)產(chǎn)生新生命個(gè)體的質(zhì)變質(zhì)變過程。高等生物這兩個(gè)過程可明顯過程。高等生物這兩個(gè)過程可明顯分開，但低等特別單細(xì)胞生物，因分開，但低等特別單細(xì)胞生物，因個(gè)體微小，這兩個(gè)過程很難劃分。個(gè)體微小，這兩個(gè)過程很難劃分。因此在因此在討論微生物生長(zhǎng)時(shí)，往往將討論微生物生長(zhǎng)時(shí)，往往將這兩個(gè)過程放在一起討論這兩個(gè)過程放在一起討論，這是，這是微微生物群體生長(zhǎng)生物群體生長(zhǎng)：在一定時(shí)間和條件：在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加。下細(xì)胞

30、數(shù)量的增加。Prokaryotic Cell(Bacillus megaterium)除某些真菌外，我們?nèi)庋劭吹匠承┱婢猓覀內(nèi)庋劭吹交蚪佑|到的微生物已不是單個(gè)，或接觸到的微生物已不是單個(gè)，而是成千上萬(wàn)個(gè)單個(gè)的微生物而是成千上萬(wàn)個(gè)單個(gè)的微生物組成的群體。組成的群體。微生物接種是群微生物接種是群體接種體接種，接種后的生長(zhǎng)是微生，接種后的生長(zhǎng)是微生物群體繁殖生長(zhǎng)物群體繁殖生長(zhǎng)。分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)：是采用完全封閉容器，：是采用完全封閉容器，一次接種，一次性加入培養(yǎng)基一次接種，一次性加入培養(yǎng)基進(jìn)進(jìn)行的培養(yǎng)，是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物行的培養(yǎng)，是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物最常用的方法。最常用的方法。生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線：細(xì)

31、菌接種到：細(xì)菌接種到液體液體培養(yǎng)培養(yǎng)基后，以裂殖繁殖，子細(xì)胞都具基后，以裂殖繁殖，子細(xì)胞都具生活能力。不補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或移生活能力。不補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積不變，以時(shí)間為橫軸，以菌數(shù)為不變，以時(shí)間為橫軸，以菌數(shù)為縱軸，據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌數(shù)量縱軸，據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌數(shù)量的變化，作一條反映細(xì)菌在整個(gè)的變化，作一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期菌數(shù)的變化規(guī)律曲線培養(yǎng)期菌數(shù)的變化規(guī)律曲線。一條典型的生長(zhǎng)曲線至少可以分一條典型的生長(zhǎng)曲線至少可以分為為遲緩期遲緩期、對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期穩(wěn)定期和和衰衰亡期亡期等四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期。等四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期。遲緩期遲緩期(lag phas

32、e)細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基而處于細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基而處于新新生長(zhǎng)環(huán)境生長(zhǎng)環(huán)境，因此在一段時(shí)間里并，因此在一段時(shí)間里并不馬上分裂不馬上分裂，細(xì)菌，細(xì)菌數(shù)量維持恒定，數(shù)量維持恒定，或增加很少或增加很少。此時(shí)胞內(nèi)的。此時(shí)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量有所增加，相蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量有所增加，相對(duì)地此時(shí)的細(xì)胞體積最大，說明對(duì)地此時(shí)的細(xì)胞體積最大，說明細(xì)菌并不是處于完全靜止的狀態(tài)細(xì)菌并不是處于完全靜止的狀態(tài)等。等。 產(chǎn)生遲緩期的原因，微生物接種到產(chǎn)生遲緩期的原因，微生物接種到一新環(huán)境，暫時(shí)缺乏足夠能量和必一新環(huán)境，暫時(shí)缺乏足夠能量和必需的生長(zhǎng)因子，需的生長(zhǎng)因子，“種子種子”老化老化(即處即處于非對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期于

33、非對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)或未充分活化，接或未充分活化，接種時(shí)造成損傷等。種時(shí)造成損傷等。 在工業(yè)發(fā)酵和科研中遲緩期會(huì)增加生產(chǎn)在工業(yè)發(fā)酵和科研中遲緩期會(huì)增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響，但是遲緩期必周期而產(chǎn)生不利的影響，但是遲緩期必需，因細(xì)胞分裂前，細(xì)胞各成分復(fù)制與需，因細(xì)胞分裂前，細(xì)胞各成分復(fù)制與裝配等需時(shí)間，因此應(yīng)裝配等需時(shí)間，因此應(yīng)采取一定措施采取一定措施縮縮短遲緩期：通過遺傳學(xué)方法改變種的短遲緩期：通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；利用對(duì)數(shù)生遺傳特性使遲緩期縮短；利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為長(zhǎng)期的細(xì)胞作為“種子種子”；盡量使接；盡量使接種前后使用的培養(yǎng)基組成不相差太大；種前后使用的培養(yǎng)基組成不相

34、差太大；適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短遲緩期，適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良影響?？朔涣加绊?。 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(log Phase)：又稱指又稱指數(shù)生長(zhǎng)期數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)菌經(jīng)遲緩期進(jìn)入對(duì)細(xì)菌經(jīng)遲緩期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并以最大速率生長(zhǎng)和數(shù)生長(zhǎng)期，并以最大速率生長(zhǎng)和分裂，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加，分裂，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加，且細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律增且細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律增加，此期內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)是平衡生長(zhǎng)。加，此期內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)是平衡生長(zhǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌代謝活性、酶活對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌代謝活性、酶活性高而穩(wěn)定，大小比較一致，生性高而穩(wěn)定，大小比較一致，生活力強(qiáng)，因而它廣泛地在生產(chǎn)上活力強(qiáng)，因而它廣

35、泛地在生產(chǎn)上用作用作“種子種子”和在科研上作為理和在科研上作為理想的實(shí)驗(yàn)材料。生產(chǎn)上如以獲想的實(shí)驗(yàn)材料。生產(chǎn)上如以獲菌體為目的，該期最好菌體為目的，該期最好 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率可用代時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率可用代時(shí)表示。表示。 代時(shí)代時(shí)，即單個(gè)細(xì)胞完成一次分裂，即單個(gè)細(xì)胞完成一次分裂所需的時(shí)間，亦即增加一代所需所需的時(shí)間，亦即增加一代所需的時(shí)間的時(shí)間(也叫增代時(shí)間或世代時(shí)也叫增代時(shí)間或世代時(shí)間間)。在此階段，由于代時(shí)穩(wěn)定，。在此階段，由于代時(shí)穩(wěn)定，因此，只要知道了對(duì)數(shù)期中任何因此，只要知道了對(duì)數(shù)期中任何兩個(gè)時(shí)間的菌數(shù)，就可求出細(xì)菌兩個(gè)時(shí)間的菌數(shù)，就可求出細(xì)菌的代時(shí)。的代時(shí)。 穩(wěn)定生長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)

36、期(stationary phase)： 因因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等等環(huán)境變化，逐步不適宜細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)環(huán)境變化，逐步不適宜細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率降低直至零致生長(zhǎng)速率降低直至零(即細(xì)菌分裂增即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)量加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)量)，進(jìn)入穩(wěn)，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期?；罴?xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。定生長(zhǎng)期。活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。如及時(shí)采取措施，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或取如及時(shí)采取措施，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對(duì)好走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對(duì)好氧菌進(jìn)行通氣、攪拌或振蕩等可延長(zhǎng)氧菌進(jìn)行通氣、攪拌或振蕩等可延長(zhǎng)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，獲得更多菌體物質(zhì)或代穩(wěn)

37、定生長(zhǎng)期，獲得更多菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。（生產(chǎn)上如以獲代謝產(chǎn)物為謝產(chǎn)物。（生產(chǎn)上如以獲代謝產(chǎn)物為目的，該期最好）目的，該期最好）衰亡期衰亡期： 營(yíng)養(yǎng)物耗盡和有毒代謝物大營(yíng)養(yǎng)物耗盡和有毒代謝物大量積累，細(xì)菌死亡速率逐步量積累，細(xì)菌死亡速率逐步增加和活細(xì)菌逐步減少，標(biāo)增加和活細(xì)菌逐步減少，標(biāo)志進(jìn)入衰亡期。該時(shí)期細(xì)菌志進(jìn)入衰亡期。該時(shí)期細(xì)菌代謝活性降低，衰老并出現(xiàn)代謝活性降低，衰老并出現(xiàn)自溶，且死亡細(xì)菌量以對(duì)數(shù)自溶，且死亡細(xì)菌量以對(duì)數(shù)方式增加，但衰亡期后期，方式增加，但衰亡期后期，因部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使因部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低。細(xì)菌死亡的速率降低。 此外，不同的微生物，甚至此外，不

38、同的微生物，甚至同一種微生物對(duì)不同物質(zhì)的同一種微生物對(duì)不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用質(zhì)可直接被利用(如葡萄糖等如葡萄糖等)；有的需經(jīng)過一定適應(yīng)期后才有的需經(jīng)過一定適應(yīng)期后才能獲得利用能力能獲得利用能力(如乳糖等如乳糖等)。前者通常稱為速效碳源前者通常稱為速效碳源(或氮或氮源源)，后者稱為遲效碳源，后者稱為遲效碳源(或氮或氮源源)。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有這。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有這兩類碳源兩類碳源(或氮源或氮源)時(shí)，微生物時(shí)，微生物在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生二次生在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。長(zhǎng)現(xiàn)象。 |一條典型的生長(zhǎng)曲線至少可以分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四

39、個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期。 .| 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)：在微生物整個(gè)培養(yǎng)間，在微生物整個(gè)培養(yǎng)間，以一定方式使微生物能以恒定比生以一定方式使微生物能以恒定比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)的一種培長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)的一種培養(yǎng)方法。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)養(yǎng)方法。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致微的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)停止的主要原因。因此在生物生長(zhǎng)停止的主要原因。因此在微生物培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物微生物培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實(shí)質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)基本原則?，F(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)基本原則。|連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)|最大優(yōu)點(diǎn)最大優(yōu)

40、點(diǎn)：微生物能在比較恒定的微生物能在比較恒定的生長(zhǎng)條件下以恒定的生長(zhǎng)速度生長(zhǎng)；生長(zhǎng)條件下以恒定的生長(zhǎng)速度生長(zhǎng)；縮短生長(zhǎng)周期，提高生產(chǎn)設(shè)備的利縮短生長(zhǎng)周期，提高生產(chǎn)設(shè)備的利用率，降低產(chǎn)品成本。用率，降低產(chǎn)品成本。|缺點(diǎn)缺點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率低；感營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率低；感染雜菌的機(jī)會(huì)增多；菌體易老化，染雜菌的機(jī)會(huì)增多；菌體易老化，衰退。衰退。| 微生物生長(zhǎng)情況可通過測(cè)定單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量的變化來評(píng)價(jià)。通過微生物生長(zhǎng)的測(cè)定可客觀評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)生長(zhǎng)的影響，或評(píng)價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果，或客觀地反映微生物生長(zhǎng)的規(guī)律。因此微生物生長(zhǎng)的測(cè)量在理論上和實(shí)踐上有著重

41、要的意義。微生物生長(zhǎng)的測(cè)定有計(jì)數(shù)、重量微生物生長(zhǎng)的測(cè)定有計(jì)數(shù)、重量和生理指標(biāo)等方法。和生理指標(biāo)等方法。|微生物生長(zhǎng)的測(cè)定微生物生長(zhǎng)的測(cè)定計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法 此法通常用來測(cè)定樣此法通常用來測(cè)定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。計(jì)數(shù)等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。計(jì)數(shù)法又常分為法又常分為直接計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)和和間接計(jì)間接計(jì)數(shù)數(shù)兩類。兩類。除上述兩種常用的計(jì)除上述兩種常用的計(jì)數(shù)方法外，還有數(shù)方法外，還有膜過濾法膜過濾法、比比濁法濁法。 直接計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)這類方法是利用特定的這類方法是利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里

42、樣品中微生物定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)不的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌。能區(qū)分死菌與活菌。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)4000l000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 間接計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)此法又稱活菌計(jì)數(shù)法，此法又稱活菌計(jì)數(shù)法，其其原理原理是在高稀釋度下，微生物細(xì)胞是在高稀釋度下，微生物細(xì)胞充分分散，成單個(gè)細(xì)胞存在，充分分散，成單個(gè)細(xì)胞存在，每一個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖形每一個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖形成一個(gè)菌落，因而可用平皿培成一個(gè)菌落，因而可用平皿培養(yǎng)的方法使每個(gè)活細(xì)胞生長(zhǎng)并養(yǎng)的方法使每個(gè)活細(xì)胞生長(zhǎng)并形成一個(gè)單獨(dú)的菌落，通過統(tǒng)形成一個(gè)單獨(dú)的菌落，通過統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出

43、的菌落數(shù)來推算待測(cè)樣計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)來推算待測(cè)樣品中的活菌數(shù)。品中的活菌數(shù)。 具體做法：具體做法：將待測(cè)樣品經(jīng)一系列將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，再采作用混菌法或涂布法來進(jìn)液，再采作用混菌法或涂布法來進(jìn)行測(cè)數(shù)。行測(cè)數(shù)。 但在實(shí)際操作中難以做到但在實(shí)際操作中難以做到使所有細(xì)胞完全分開，即不能保證使所有細(xì)胞完全分開，即不能保證每個(gè)菌落都是由個(gè)細(xì)胞分裂而來，每個(gè)菌落都是由個(gè)細(xì)胞分裂而來，所以現(xiàn)在多用菌落形成單位（所以現(xiàn)在多用菌落形成單位（CFU：colony forming units）來表示。來表示。 應(yīng)用應(yīng)用: 此法可因操作不熟練造成污染，或

44、此法可因操作不熟練造成污染，或因培養(yǎng)基溫度過高損傷細(xì)胞等原因造成因培養(yǎng)基溫度過高損傷細(xì)胞等原因造成結(jié)果不穩(wěn)定。但因該法能測(cè)出樣品中微結(jié)果不穩(wěn)定。但因該法能測(cè)出樣品中微量菌數(shù)，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用量菌數(shù)，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的測(cè)定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、的測(cè)定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測(cè)母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測(cè)定。但不適于測(cè)定樣品中絲狀體微生物，定。但不適于測(cè)定樣品中絲狀體微生物，如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍(lán)細(xì)菌等營(yíng)如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍(lán)細(xì)菌等營(yíng)養(yǎng)體等。養(yǎng)體等。 膜過

45、濾法膜過濾法（測(cè)活菌數(shù)測(cè)活菌數(shù)）是當(dāng)樣）是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的潮水、海水或飲用水等體積的潮水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色膜干燥、染色( (活菌指示劑活菌指示劑) )，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中或一定面積中)的的細(xì)菌數(shù)細(xì)菌數(shù). . 比濁法比濁法（測(cè)總菌數(shù)測(cè)總菌數(shù)）原理是在一定范圍內(nèi)，）原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與菌懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因光密度成正比，菌越多，光密度越

46、大。因此可借助分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)此可借助分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度定菌懸液的光密度，以光密度(optical density，即即O.D.)表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比線性一定要控制在菌濃度與光密度成正比線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化儀器和裝置等方法?？焖?、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化儀器和裝置等方法。重量法重量法 此法的原理是根據(jù)每個(gè)細(xì)胞有此法的原理是根據(jù)每個(gè)細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計(jì)的。它可以一定的重量而設(shè)計(jì)的。它可以用于單細(xì)

47、胞、多細(xì)胞以及絲狀用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。微生物濕重微生物濕重微生物干重微生物干重蛋白質(zhì)總量蛋白質(zhì)總量 DNA含量含量 測(cè)定菌體濕重或干重法測(cè)定菌體濕重或干重法 原理是據(jù)每個(gè)細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計(jì)原理是據(jù)每個(gè)細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計(jì)的。它可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲的。它可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。將一定體積的狀體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，如是絲狀體微生物，過濾后用濾紙吸去如是絲狀體微生物，

48、過濾后用濾紙吸去菌絲間的自由水，再稱重求濕重。細(xì)菌菌絲間的自由水，再稱重求濕重。細(xì)菌樣品和絲狀菌樣品，均可將它們放在已樣品和絲狀菌樣品，均可將它們放在已知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于105烘干至烘干至恒重，取出放入干燥器內(nèi)冷卻，再稱量，恒重，取出放入干燥器內(nèi)冷卻，再稱量，求出微生物干重。求出微生物干重。 如要測(cè)定固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放如要測(cè)定固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至線菌或絲狀真菌，可先加熱至50，使瓊脂熔化，過濾得菌絲，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用體，再用50的生理鹽水洗滌菌的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或

49、干重。的濕重或干重。u蛋白質(zhì)總量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主蛋白質(zhì)總量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要成分，含量也較穩(wěn)定，其中要成分，含量也較穩(wěn)定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細(xì)從一定體積的樣品中分離出細(xì)胞，洗滌后，按凱氏定氮法測(cè)胞，洗滌后，按凱氏定氮法測(cè)總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%，細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量占細(xì)菌干物細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量占細(xì)菌干物重重50%80%，一般以一般以65%為代為代表表，有些細(xì)菌則只占，有些細(xì)菌則只占13%14%，這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的。不同所產(chǎn)生的。u因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量因此總含氮量與

50、蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計(jì)之間的關(guān)系可按下列公式計(jì)算：算：蛋白質(zhì)總量含氮量蛋白質(zhì)總量含氮量6.25 細(xì)胞總量蛋白質(zhì)總量細(xì)胞總量蛋白質(zhì)總量(50%80%(或或65%)蛋蛋白質(zhì)總量白質(zhì)總量1.5uDNA含量含量 核酸核酸DNA是微生物的重要遺傳是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個(gè)細(xì)菌的物質(zhì)，每個(gè)細(xì)菌的DNA含量相含量相當(dāng)恒定，平均為當(dāng)恒定，平均為8.410-5ng。因此從一定體積的細(xì)菌懸液中因此從一定體積的細(xì)菌懸液中所含細(xì)菌中提取所含細(xì)菌中提取DNA，求求DNA含量，再計(jì)算這一定體積的細(xì)含量，再計(jì)算這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。 |生理指標(biāo)法生理指標(biāo)法生理指標(biāo)生理指標(biāo)包

51、括微生物呼吸強(qiáng)度、包括微生物呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等。耗氧量、酶活性、生物熱等。據(jù)微生物生長(zhǎng)過程中伴隨出現(xiàn)的據(jù)微生物生長(zhǎng)過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標(biāo)，樣品中這些指標(biāo)，樣品中微生物數(shù)量多微生物數(shù)量多或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可借助特定的儀器如瓦勃氏因此可借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測(cè)呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。定相應(yīng)的指標(biāo)。 &微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因素微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因素一、一、 溫度溫度1 1、微生物生長(zhǎng)的溫度范圍微生物生長(zhǎng)的溫度范圍2、微生物的溫度類型微生物的溫度類型3、溫度在微生物工作中的應(yīng)用溫度在微生物工作中的應(yīng)

52、用 高溫滅菌高溫滅菌：干熱滅菌；濕熱滅：干熱滅菌；濕熱滅菌（煮沸消毒法，高壓蒸汽滅菌（煮沸消毒法，高壓蒸汽滅菌，間歇滅菌，巴斯德消毒菌，間歇滅菌，巴斯德消毒法）。法）。 低溫保藏菌種和食品低溫保藏菌種和食品二、二、 水分和空氣濕度水分和空氣濕度三、三、 氫離子濃度（氫離子濃度（pH）：）：1、不同微生物的生長(zhǎng)不同微生物的生長(zhǎng)pH范圍范圍2、微生物培養(yǎng)過程中微生物培養(yǎng)過程中pH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)措施措施。四、四、 氧氣及氧化還原電位氧氣及氧化還原電位：五、五、輻射輻射、紫外線輻射紫外線輻射（UV）的應(yīng)用的應(yīng)用六、六、 化學(xué)藥物：化學(xué)藥物：有機(jī)化合物有機(jī)化合物、無機(jī)化合物無機(jī)化合物、染色劑染色劑 1、 微生

53、物生長(zhǎng)的溫度范圍微生物生長(zhǎng)的溫度范圍 不同微生物對(duì)溫度的要求不同，各不同微生物對(duì)溫度的要求不同，各種微生物都有其生長(zhǎng)繁殖的最低、種微生物都有其生長(zhǎng)繁殖的最低、最高、最適生長(zhǎng)溫度最高、最適生長(zhǎng)溫度(又稱三基點(diǎn)溫又稱三基點(diǎn)溫度度)。在微生物生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi)，。在微生物生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，微生物的活力及隨著溫度的升高，微生物的活力及酶活力增強(qiáng)。酶活力增強(qiáng)。注意注意：最適的生長(zhǎng)繁殖溫度不一定：最適的生長(zhǎng)繁殖溫度不一定是微生物代謝的最適溫度。是微生物代謝的最適溫度。eg.青霉青霉素產(chǎn)生菌素產(chǎn)生菌-產(chǎn)黃青霉雖在產(chǎn)黃青霉雖在30時(shí)生時(shí)生長(zhǎng)最快，而青霉素產(chǎn)生的最適溫度長(zhǎng)最快，而青霉素產(chǎn)生的最適溫

54、度則在則在20-25。微生物類型微生物類型生長(zhǎng)溫度范圍（生長(zhǎng)溫度范圍（）分布的主要場(chǎng)所分布的主要場(chǎng)所最低最低最適最適最高最高低溫低溫型型專性嗜冷專性嗜冷兼性嗜冷兼性嗜冷-12-5-05-1510-2015-2025-30兩極地區(qū)兩極地區(qū)海水及食品冷藏室海水及食品冷藏室中溫型中溫型10-2025-4040-50哺乳動(dòng)物生活環(huán)境哺乳動(dòng)物生活環(huán)境高溫高溫型型嗜熱嗜熱 極端嗜熱極端嗜熱303045-6070-9070以上以上100以上以上堆肥和沼氣發(fā)酵池堆肥和沼氣發(fā)酵池溫泉的洋底火山口溫泉的洋底火山口微生物生長(zhǎng)的溫度類型微生物生長(zhǎng)的溫度類型注：注：中溫型有的還分為室溫型、體溫型兩類。中溫型有的還分為室

55、溫型、體溫型兩類。冷藏食品的變質(zhì)往往是低溫型微生物作用的結(jié)果冷藏食品的變質(zhì)往往是低溫型微生物作用的結(jié)果。 溫度在微生物工作中的應(yīng)用溫度在微生物工作中的應(yīng)用1、利用高溫致死溫度滅菌、利用高溫致死溫度滅菌（見培養(yǎng)（見培養(yǎng)基的滅菌）基的滅菌）致死溫度：致死溫度：通常把能在通常把能在1010min.min.內(nèi)殺內(nèi)殺死某種微生物的高溫界限。大多死某種微生物的高溫界限。大多數(shù)細(xì)菌、病毒、酵母菌和絲狀真數(shù)細(xì)菌、病毒、酵母菌和絲狀真菌營(yíng)養(yǎng)體的致死溫度是菌營(yíng)養(yǎng)體的致死溫度是50-6550-65，放線菌和真菌孢子的抗熱能力稍放線菌和真菌孢子的抗熱能力稍強(qiáng)，致死溫度為強(qiáng)，致死溫度為75-8075-80；細(xì)菌的；細(xì)菌

56、的芽孢抗熱能力極強(qiáng)，能耐芽孢抗熱能力極強(qiáng)，能耐100100以以上的高溫。上的高溫。2、低溫保藏菌種、低溫保藏菌種二、水分及可給性二、水分及可給性 1、水的可給性：、水的可給性：微生物對(duì)水分的需微生物對(duì)水分的需求可用水活度來表示（常以水活求可用水活度來表示（常以水活度值度值(water activity, w)表示），表示），它是一種反映環(huán)境中水對(duì)微生物它是一種反映環(huán)境中水對(duì)微生物生長(zhǎng)可給性高低的指標(biāo)。生長(zhǎng)可給性高低的指標(biāo)。 水活度水活度值是指在一定的溫度和壓力值是指在一定的溫度和壓力條件下，溶液的蒸氣壓力與同樣條件下，溶液的蒸氣壓力與同樣條件下純水蒸氣壓力之比。條件下純水蒸氣壓力之比。 微生物

57、一般在微生物一般在 w為為0.60-0.99的條的條件下生長(zhǎng)，件下生長(zhǎng)， w過低時(shí)，微生物生過低時(shí)，微生物生長(zhǎng)的遲緩期延長(zhǎng)，比生長(zhǎng)速率和長(zhǎng)的遲緩期延長(zhǎng)，比生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量減少?？偵L(zhǎng)量減少。微生物不同，其生長(zhǎng)的最適微生物不同，其生長(zhǎng)的最適 w不同。不同。一般而言，細(xì)菌生長(zhǎng)最適一般而言，細(xì)菌生長(zhǎng)最適 w較酵較酵母菌和霉菌高，而嗜鹽微生物生母菌和霉菌高，而嗜鹽微生物生長(zhǎng)最適長(zhǎng)最適 w則較低。則較低。微生物微生物 w微生物微生物 w一般細(xì)菌一般細(xì)菌0.91嗜鹽細(xì)菌嗜鹽細(xì)菌0.76酵母菌酵母菌0.88嗜鹽真菌嗜鹽真菌0.65霉菌霉菌0.80嗜高滲酵母嗜高滲酵母0.602 2、滲透壓、滲透壓 在微生物

58、正常生長(zhǎng)下，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)在微生物正常生長(zhǎng)下，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度高于細(xì)胞外溶質(zhì)濃度，所以的濃度高于細(xì)胞外溶質(zhì)濃度，所以水分能通過半透性的質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞水分能通過半透性的質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞壁的保護(hù)作用避免了內(nèi)，由于細(xì)胞壁的保護(hù)作用避免了因水分的無限流入造成的質(zhì)膜破裂。因水分的無限流入造成的質(zhì)膜破裂。而高滲環(huán)境會(huì)使細(xì)胞脫水、造成生而高滲環(huán)境會(huì)使細(xì)胞脫水、造成生理干燥，原生質(zhì)收縮引起質(zhì)壁分離理干燥，原生質(zhì)收縮引起質(zhì)壁分離現(xiàn)象，因而能抑制大多數(shù)微生物生現(xiàn)象，因而能抑制大多數(shù)微生物生長(zhǎng)。長(zhǎng)。(低滲溶液能破壞去壁的細(xì)胞原低滲溶液能破壞去壁的細(xì)胞原生質(zhì)體。生質(zhì)體。)高滲環(huán)境防止食品腐敗高滲環(huán)境防止食品腐敗 ： 鹽漬鹽漬：利用高濃度：利用高濃度(常用常用10-15%)食鹽人工造成高滲環(huán)食鹽人工造成高滲環(huán)境來保存食品，如臘肉；境來保存食品，如臘肉； 糖漬糖漬