引物設(shè)計(jì)和實(shí)時(shí)熒光定量pcr

1、熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)和引物設(shè)計(jì)技術(shù)和引物設(shè)計(jì)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心葛仁山葛仁山 2014.8.4目錄目錄一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論二、引物的設(shè)計(jì)及原則三、內(nèi)參基因的選擇四、定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理五、實(shí)時(shí)定量PCR兩種相對定量方法比較六、誤差分析及操作規(guī)范七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論1 1、熒光定量、熒光定量PCRPCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技

2、術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。1 1、熒光定量、熒光定量PCRPCR技術(shù)概論技術(shù)概論 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過分析軟件對PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。 系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。 常規(guī)常規(guī)PCRvsPCRvs實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR 常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析 定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定

3、量分析常規(guī)常規(guī)PCRvsPCRvs實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR 優(yōu)缺點(diǎn)比較 定量PCR 常規(guī)PCR靈敏度高高精確度安全省時(shí)只能進(jìn)行半定量或定性分析不安全易污染費(fèi)時(shí)費(fèi)力2 2、熒光定量、熒光定量PCRPCR常用的三個概念常用的三個概念 擴(kuò)增曲線、閾值、CT值（1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號的變化量的對數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。2 2、熒光定量、熒光定量PC

4、RPCR常用的三個概念常用的三個概念（2）、閾值線 在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。2 2、熒光定量、熒光定量PCRPCR常用的三個概念常用的三個概念（3）、CT值 PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ) 熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號強(qiáng)度的積累來實(shí)時(shí)反映PCR反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特點(diǎn)： （1）、本底低（2）、熒光強(qiáng)度高（3）、每輪PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒 光強(qiáng)度的增高和每輪

5、循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系（4）、沒有PCR產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光（5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種 熒光不會產(chǎn)生熒光的交叉干擾3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)目前常用的幾種熒光物質(zhì)（1）、Taqman探針類5端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光；探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在Taq酶5-3外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬

6、滅基團(tuán) 熒光基團(tuán)：5端常用熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長：494-495nm，最大 發(fā)射光波長：518-520nm。淬滅基團(tuán)：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長范圍較寬，500 560nm，最佳激發(fā)光波長在560nm附近，對FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬，560650nm，當(dāng)做 多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已 不常用。 BHQ和ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較 為常用，尤其在多重?zé)晒舛縋CR時(shí)常常被采用。3

7、3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異 性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物 的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。（2）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。（3）、常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達(dá)幾十個拷貝) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變 化）。（4）、目前價(jià)格也不是太貴，2OD 1000.00左右3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)（2）、熒光染料類 目前常用的熒光染料

8、為SYBR Green、SYBR Green、 SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為： （a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處 （b）、與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光 （c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學(xué)基礎(chǔ)的化學(xué)基礎(chǔ)熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與 雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；（2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（3）、SYBR Green染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量PCR時(shí)對引物設(shè) 計(jì)的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStar Taq酶，或者操 作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動，冰上操作

9、，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò) 增會嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時(shí)；（4）、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；（5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。（6）、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。兩種化學(xué)試劑的比較兩種化學(xué)試劑的比較化學(xué)試劑化學(xué)試劑工作原理工作原理有否淬滅劑有否淬滅劑信號檢測階段信號檢測階段SYBR Green ISYBR Green I結(jié)合于雙鏈結(jié)合于雙鏈DNADNA的小溝中的小溝中否否延伸延伸TaqManTaqMan水解型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5-35-3外切）外切）有有任何步驟任何步驟4 4、熒光定量、熒光定

10、量PCRPCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理 對于普通的PCR反應(yīng)來說 n Xn=X0（1E）上式中， Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產(chǎn)物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；X0 為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應(yīng)效率，0E1。4 4、熒光定量、熒光定量PCRPCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理 由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強(qiáng)度來代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn總熒光信號強(qiáng)度=本底信號+分子數(shù)量單位信號強(qiáng)度Rn：第n個循環(huán)時(shí)的總信號RB：本底RS：單位信號強(qiáng)度X0：起始DNA數(shù)目E： PCR效率4 4、熒光定量、熒光定量PC

11、RPCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理 當(dāng)循環(huán)數(shù)n等于CT值時(shí)，所有樣品熒光信號強(qiáng)度變化量的對數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs 此時(shí)，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相等； lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個變量之間成一次性方程。 也就是說， 所有樣品的lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣

12、品中所含的模板量CT5 5、熒光定量、熒光定量PCRPCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs（1）、PCR效率相等，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；（2）、RT RB 要相等；也就是說到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒 光本底之差要相等；（3）、樣品的單位信號強(qiáng)度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs 就 是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和 PCR產(chǎn)物的長短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長，結(jié)合的熒光染料越多， Rs 值 越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs 就等于PCR反應(yīng)時(shí)，Taq酶水解掉

13、 探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和PCR產(chǎn)物的長度沒有 直接關(guān)系。5 5、熒光定量、熒光定量PCRPCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn，改圖反映的是各個樣品隨著每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT RB即Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會成立。5 5、熒光定量、熒光定量PCRPCR線性關(guān)系成立的條件分析線性關(guān)系成立的條件分析 LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品

14、可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品初始模板量。6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時(shí)，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，SYBR Green與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來越強(qiáng)，當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時(shí)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從50一直加熱到99，在此過程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個很小的溫度

15、范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖： 6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也能分析出來。 電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線是根據(jù)雙鏈核酸的TM值來分析的，這

16、與瓊脂糖電泳及SSCP有異曲同工之處。7 7、mRNAmRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析 研究基因表達(dá)的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。 實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時(shí)樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同，RNA提取時(shí)得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而

17、變化，所以常被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有RPS16基因、GAPDH基因、-Actin基因、18srRNA基因等。7 7、mRNAmRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-delta Ct法。7 7、mRNAmRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析（1）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。（2）、2 -CT法 該方法的前提

18、條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實(shí)驗(yàn)中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。7 7、mRNAmRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析（2）、2 -CT法 該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實(shí)驗(yàn)中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。 該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)镃T值的差異只要有很小的變化，測得

19、的結(jié)果就會有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。 二、引物設(shè)計(jì)及原則1 1、染料法引物的設(shè)計(jì)原則、染料法引物的設(shè)計(jì)原則：（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（3）、檢測mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個外顯 子；（4）、引物之間的TM相差避免超過2；（5）、典型的引物18到24個核苷長；（6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同（7）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分

20、析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性 2 2、TaqmanTaqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則： 在Taqman探針法中，Taq酶除了5-3聚合酶作用之外，還要5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通PCR的延伸溫度為72，此溫度為Taq酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應(yīng)中，在要求Taq酶5-3聚合酶活性的同時(shí)，還需要Taq酶5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，Taq酶5-3外切酶活性的最佳溫度為60，所以Taqman PCR反應(yīng)的一般采用兩步法，即95變性，60復(fù)性延伸。 在Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)過程中，引物的TM值已經(jīng)確定為60左右，在每輪PCR

21、循環(huán)的復(fù)性過程中（9560），為了確保探針先于引物與模板結(jié)合，這就要求探針的TM值高于引物10左右，所以Taqman探針及引物一般都是引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右。2 2、TaqmanTaqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則：（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、檢測mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個外顯 子；（3）、引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右；（4）、探針的5端應(yīng)避免使用鳥嘌呤G，因?yàn)?G會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用； （5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會降

22、低反應(yīng) 效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； （6）、引物之間的TM相差避免超過2；（7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp；（8）、PCR產(chǎn)物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；（9）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性 2 2、TaqmanTaqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則：探針中GC含量的差異對定量PCR反應(yīng)效率的影響3 3、TaqmanTaqman探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng)探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng)（1）、引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）、先不要急于合成探針，先引

23、物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長度吻合，再看看非特異 性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證；（3）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣?，這樣安排能避免很多以 外的損失；（4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度， 25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測， 95，2min; 95，20s，60，20s，40個cycles；看熒光本底和 熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應(yīng)，熒 光強(qiáng)度不會變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。4、引物設(shè)計(jì)的具體步驟及

24、操作詳解（1 1）、在）、在PubmedPubmed中查找引物基因的全序列；中查找引物基因的全序列；（2 2）、用）、用primer3.0primer3.0引物序列及大小設(shè)計(jì)；引物序列及大小設(shè)計(jì)；在網(wǎng)頁中搜索Primer 3將上一步中在Word中粘貼的基因序列信息，復(fù)制到Primer 3 中，如圖：（3 3）、在）、在PubmedPubmed中找引物序列中各個內(nèi)含子外顯子片段構(gòu)架，中找引物序列中各個內(nèi)含子外顯子片段構(gòu)架，確保設(shè)計(jì)的引物序列跨兩個外顯子；確保設(shè)計(jì)的引物序列跨兩個外顯子；三、內(nèi)參基因的選擇1 1、理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn)、理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn)（1）、不存在假基因；（2）、高度或

25、中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)（3）、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其 表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；（4）、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)；（5）、其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；（6）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的 影響。 理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因?yàn)樗谢蛟诓煌募?xì)胞或組織中、在細(xì)胞的不同生理時(shí)期、在不同的理化等外界刺激下，其表達(dá)量都會有所差異，有時(shí)可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。2 2、常用內(nèi)參基因的表

26、達(dá)情況、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況（1）、GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等)中的表達(dá)升高，在不同個體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等)刺激下，培養(yǎng)細(xì)胞GAPDH mRNA的表達(dá)水平也不同。（2）、-actin 當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，-actin mRNA的表達(dá)水平增加。（3）、Rps16等3 3、內(nèi)參基因的選擇策略、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同的理化條件刺激等，

27、查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。 也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。 對于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。 四、定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理定量定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案定量定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案熒光染料法熒光染料法TaqmanTaqman探針法探針法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量定量PC

28、RPCR實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案（1）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析 的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。（2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達(dá)幾十個拷貝) 及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實(shí)驗(yàn)。（4）、 2 -CT法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基 因種類相對較多的實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費(fèi)情況等來選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。絕對定量與相對定量絕對定量與相對定量 絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度

29、（絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（DNADNA，RNARNA） 相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量定量定量PCR-PCR-絕對定量絕對定量 標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線 已知濃度的相應(yīng)已知濃度的相應(yīng)DNADNA模板，按不同濃度稀釋模板，按不同濃度稀釋 根據(jù)實(shí)時(shí)根據(jù)實(shí)時(shí)PCRPCR反應(yīng)得到相應(yīng)的反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品樣品 與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)C(t)值值unknown104103使用定量使用定量PCRPCR進(jìn)行絕對定量的優(yōu)勢進(jìn)行絕

30、對定量的優(yōu)勢 敏感性高敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝 大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測10100 010101010 省時(shí)有效省時(shí)有效定量定量PCR-PCR-相對定量相對定量 相對定量的目的相對定量的目的 比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系） 相對定量的問題相對定量的問題 樣品材料不均一造成的差別樣品材料不均一造成的差別 內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因 內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是b-actinb-actin、GAPDHGAPDH、18SrRNA18SrRNA等看家基因（內(nèi)等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素

31、影響）標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響） 對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差誤差SYBR Green I法進(jìn)行相對定量的問題問題：問題：SYBR Green ISYBR Green I可以與非特異性雙鏈結(jié)合可以與非特異性雙鏈結(jié)合 非特異產(chǎn)非特異產(chǎn)物信號物信號 結(jié)果不準(zhǔn)確結(jié)果不準(zhǔn)確解決辦法：解決辦法：引入熔鏈曲線分析引入熔鏈曲線分析熔鏈曲線分析 決定退火溫度決定退火溫度Non-specific productspecific productspecific product五、實(shí)時(shí)定量PCR兩種相對定量方法比較 相對雙標(biāo)

32、準(zhǔn)曲線法和相對雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-c(t) 法法1.1.相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法 用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)C(t)值值 用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化均一化 處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異適用范圍適用范圍 目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大目

33、標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大 擴(kuò)增效率較低擴(kuò)增效率較低2.2-c(t) 法 公式推導(dǎo)公式推導(dǎo) M:M:目標(biāo)基因，目標(biāo)基因，N N：內(nèi)標(biāo)基因：內(nèi)標(biāo)基因 X XC(t)MC(t)M=X=X0M0M* *2 2C(t)MC(t)M=A(=A(域值域值) (1) (1) X XC(t)NC(t)N=X=X0N0N* *2 2C(t)NC(t)N=A(=A(域值域值) (2) (2) 均一化均一化 (1)/(2):(1)/(2): X X0M0M/X/X0N0N=2=2 C(t)N- C(t)M C(t)N- C(t)M=2=2-C(t)-C(t) 處理處理2 2與處理與處理1 1相比：相比： (X

34、(X0M20M2/X/X0N20N2): (X): (X0M0M/X/X0N0N)= 2)= 2-C(t)2-C(t)1-C(t)2-C(t)1=2=2-C(t)-C(t) C(t)=(C(t)C(t)=(C(t)M2M2-C(t)-C(t)N2N2)-(C(t)-(C(t)M1M1-C(t)-C(t)N1N1) ) 當(dāng)有多個樣品時(shí)（如時(shí)間點(diǎn)），各樣品均一當(dāng)有多個樣品時(shí)（如時(shí)間點(diǎn)），各樣品均一化后都與同一時(shí)間點(diǎn)相比化后都與同一時(shí)間點(diǎn)相比一般步驟一般步驟 選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因 設(shè)計(jì)一步法或兩步法設(shè)計(jì)一步法或兩步法RT-PCRRT-PCR反應(yīng)反應(yīng) 數(shù)據(jù)獲得及處理數(shù)據(jù)獲得及處

35、理 目標(biāo)基因目標(biāo)基因C(t)C(t)值（處理，未處理）值（處理，未處理） 內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因C(t)C(t)值（處理，未處理）值（處理，未處理） 計(jì)算計(jì)算2 2-c(t)-c(t) 作圖作圖適用范圍適用范圍 當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率比較一致當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率比較一致 不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差； 2 -CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起 誤差； Taqman探針法誤差相對較小； 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較

36、小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時(shí)，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度）； 定量PCR儀的誤差 耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范1 1、誤差分析、誤差分析（3）、相對定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。2 2、操作規(guī)范、操作規(guī)范 熒光定量PCR是一項(xiàng)對操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達(dá)到這個目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測

37、，每一步都要規(guī)范操作。（1）、樣品的處理及選取 處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。六、誤差分析及操作規(guī)范2 2、操作規(guī)范、操作規(guī)范（2）、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保 得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測核算質(zhì)量，RNA OD260/280 2.0左右，DNA OD260/2801.8左右，最好再做電泳

38、檢測；同一樣 品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA要用看家基因檢測。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管 中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。六、誤差分析及操作規(guī)范2 2、操作規(guī)范、操作規(guī)范（7）、重復(fù)操作 讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時(shí) 就重復(fù)，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是