不同毒性條銹菌生理小種分泌蛋白基因變異分析

1、xxxxx大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 題 目： 不同毒性條銹菌生理小種分泌蛋白基因變異分析學(xué) 院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)班級(jí)： xx級(jí)生物技術(shù)xx班 學(xué)生姓名： xx 指導(dǎo)教師： xxx教授 撰寫(xiě)日期： 201x 年 x 月 xx日不同毒性條銹菌生理小種分泌蛋白基因變異分析xx生命科學(xué)學(xué)院摘 要：小麥條銹病是世界性小麥病害，在全球大多數(shù)小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重威脅小麥糧食生產(chǎn)安全。小麥條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici，Pst）引起的葉部病害，屬擔(dān)子菌亞門柄銹菌屬。通過(guò)對(duì)CY32（China）、CY23 (China) 、PK-CDRD(P

2、akistan）、Pst-78 (US)菌種的擴(kuò)繁，收集到了足量的條銹菌,然后對(duì)其用CTABSDS法提取條繡菌基因組DNA；通過(guò)對(duì)重測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)候選分泌蛋白基因striiformis_Gene7472進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在四個(gè)生理小種之間存在單核苷酸多態(tài)性（SNP） 、小片段插入缺失（InDel)變異。關(guān)鍵詞: 小麥條銹病；單核苷酸多態(tài)性；短序列的插入/缺失variation analysis of different isolates secretory protein gene HE Sheng(College of Life Sciences)Abstract:Wh

3、eat stripe rust is a worldwide wheat disease, occurring in most of the wheat producing regions, threatening the safety of wheat grain production.Wheat stripe rust (Puccinia striiformis f. sp. tritici. Pst) caused by leaf disease, belongs to basidiomycotina Puccinia.We inoculate CY32 (China), CY23 (C

4、hina), PK-CDRD (Pakistan), Pst-78 (US) on the wheat cultivars MX169, collected plenty of stripe rust;Then we extract the genomic DNA by using the method of CTABSDS, and selected a candidate secretory protein gene striiformis_Gene7472 by collating and organizing the re-sequencing results.Finally we i

5、dentify the results and found that the gene between the four isolates exist single nucleotide polymorphisms (SNP) , a small fragment insertion deletion (InDel) variation.Key words : Wheat stripe rust;SNP;InDel引言 小麥銹病是世界性小麥病害，包括條銹病、葉銹病與稈銹病，在全球大多數(shù)小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重威脅小麥糧食安全生產(chǎn)。同時(shí)，銹菌可借助氣流實(shí)現(xiàn)高空遠(yuǎn)距離傳播，導(dǎo)致病害在各個(gè)小麥產(chǎn)區(qū)間流

6、行，是影響糧食安全的重大生物災(zāi)害。小麥銹病曾頻繁造成包括我國(guó)在內(nèi)的全球小麥主產(chǎn)國(guó)毀滅性的產(chǎn)量損失。僅建國(guó)后,條銹病在我國(guó)就發(fā)生了9次大流行，對(duì)小麥生產(chǎn)造成了災(zāi)難性的影響。特別是1950、1964、1990和2002年的四次大流行分別使小麥減產(chǎn)60億kg、32億kg、25億kg和10億kg。進(jìn)入本世紀(jì)以來(lái)，由于小麥條銹菌毒性變異和新小種產(chǎn)生，小麥條銹病已在我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)連續(xù)流行了近10年，年損失小麥在10億公斤左右。 近年來(lái)，小麥銹病在全球的發(fā)生和流行引起各國(guó)科學(xué)家的高度關(guān)注，世界各國(guó)非常重視小麥銹病研究工作。在諾貝爾和平獎(jiǎng)獲得者N. E. Borlaug博士的倡導(dǎo)下，國(guó)際博倫厄全球麥銹病協(xié)作中心

7、（/）組織各國(guó)科學(xué)家開(kāi)展合作研究，在全球范圍內(nèi)共同抵御銹病對(duì)小麥造成的威脅。Hovmøller等在國(guó)際學(xué)術(shù)頂級(jí)期刊“Science”上也特別撰文警示，銹病將在世界范圍內(nèi)引致更為廣泛而嚴(yán)重的暴發(fā)流行。因此，持續(xù)有效控制小麥銹病是確保小麥穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)的重要保障。 小麥條銹菌在小麥上先產(chǎn)生亮黃色的夏孢子堆（urediniospore）和夏孢子（uredium），每個(gè)夏孢子堆均可持續(xù)產(chǎn)孢數(shù)天，由夏孢子堆形成的縱向擴(kuò)展病斑可以維持較長(zhǎng)時(shí)間的產(chǎn)孢。隨著小麥葉片逐漸衰老，以及不適合其夏孢子生長(zhǎng)的逆境刺激下，條銹菌開(kāi)始形成黑色的冬孢子堆（teliospor

8、e），繼而產(chǎn)生雙孢冬孢子（telium），每個(gè)冬孢子細(xì)胞都含有一個(gè)經(jīng)過(guò)核配形成的二倍體細(xì)胞核（姚娟妮等 2012）。冬孢子成熟萌發(fā)后，產(chǎn)生擔(dān)孢子（basidiospore）和擔(dān)子（basidium），擔(dān)孢子在適宜的條件下可以侵染轉(zhuǎn)主寄主小檗，并在小檗葉片的正面形成性孢子器（pycnium）和性孢子（pycniospore），隨后在小檗葉片的背面，與正面性子器相對(duì)的地方，產(chǎn)生乳突狀的銹孢子器（aecium），銹子器發(fā)育成熟后可以釋放銹孢子（aecidospore），而銹孢子可以侵染小麥，在小麥上產(chǎn)生條銹菌夏孢子，完成其有性生活史周期1。這一驚人的發(fā)現(xiàn)證明了小麥條銹菌存在著有性階段，為更深入的研究

9、小麥條銹病發(fā)生流行的規(guī)律和病原菌遺傳變異的機(jī)制提供了重要途徑。 小麥條銹病菌主要以夏孢子在小麥上完成周年的侵染循環(huán)。目前尚未發(fā)現(xiàn)病菌的轉(zhuǎn)主寄主。其侵染循環(huán)可分為越夏、侵染秋苗、越冬及春季流行四個(gè)環(huán)節(jié)。小麥條銹菌在我國(guó)甘肅的隴東、隴南、青海東部、四川西北部等地夏季最熱月份旬均溫在20以下的地區(qū)越夏。秋季越夏的菌源隨氣流傳播到我國(guó)冬麥區(qū)后，遇有適宜的溫濕度條件即可侵染冬麥秋苗，秋苗的發(fā)病開(kāi)始多在冬小麥播后1個(gè)月左右。秋苗發(fā)病遲早及多少，與菌源距離和播期早晚有關(guān)，距越夏菌源近、播種早則發(fā)病重。當(dāng)平均氣溫降至12時(shí)，條銹菌開(kāi)始進(jìn)入越冬階段。一月份平均氣溫低于67的德州、石家莊、介休一線以北，病菌不能越

10、冬，而這一線以南地區(qū)，冬季最冷月均溫不低于上述溫度的四川、云南、湖北、河南信陽(yáng)、陜西關(guān)中、安康等地則可以菌絲狀態(tài)在病葉里越冬，成為當(dāng)?shù)丶班徑渽^(qū)春季流行的重要菌源基地。翌年小麥返青后，越冬病葉中的菌絲體復(fù)蘇擴(kuò)展，當(dāng)旬均溫上升至5時(shí)顯癥產(chǎn)孢，如遇春雨或結(jié)露，病害擴(kuò)展蔓延迅速，引致春季流行，成為該病主要為害時(shí)期。在具有大面積感病品種前提下，越冬菌量和春季降雨成為流行的兩大重要條件。如遇較長(zhǎng)時(shí)間無(wú)雨、無(wú)露的干旱情況，病害擴(kuò)展常常中斷。因此常年發(fā)生春旱的華北發(fā)病輕，華東春雨較多，但氣溫回升過(guò)快，溫度過(guò)高不利該病擴(kuò)展，發(fā)病也輕。只有早春低溫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，又有春雨的條件發(fā)病重。品種抗病性差異明顯，但大面積

11、種植具同一抗源的品種，由于病菌小種的改變，往往造成抗病性喪失。 國(guó)內(nèi)外研究表明，病菌毒性變異是導(dǎo)致小麥品種抗病性“喪失”，病害大規(guī)模流行的根本原因。因此，揭示小麥病原菌毒性變異的基礎(chǔ)是解決品種抗性“喪失”，實(shí)現(xiàn)病害持久控制的必由之路。銹菌毒性變異的根源是遺傳物質(zhì)的變異，在分子水平揭示毒性及其變異的物質(zhì)基礎(chǔ)至關(guān)重要。生物遺傳變異的重要表現(xiàn)是其基因組及其表達(dá)的變異，包括基因組序列和結(jié)構(gòu)的變異。序列變異主要有單核苷多態(tài)性（SNP）、短序列的插入/缺失（indel）、微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）和轉(zhuǎn)座子等類型；結(jié)構(gòu)改變主要包括有/無(wú)變異（presense/absence variation，PAV）

12、和基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），主要為基因組區(qū)域大范圍的插入、缺失、復(fù)制、倒置（inversion）和移位（translocation）2。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。日益完善測(cè)序技術(shù)和低廉的成本正在使基因組研究發(fā)生革命性變化，大大促進(jìn)了銹菌基因組學(xué)研究。2011年，兩個(gè)植物銹菌-楊柵銹菌（Melampsora. larici-populina）和小麥稈銹菌（P. graminis f. sp. tritici）基因組測(cè)序工作同時(shí)完成，并對(duì)其中專性寄生菌基因組特性進(jìn)行了分析3。比較基因組發(fā)現(xiàn)，

13、活體專性寄生菌與腐生菌、兼性寄生菌之間基因譜系中保守基因沒(méi)有顯著變化。但具有明顯的活體專性寄生菌的典型特性，如分泌組中存在種內(nèi)特異候選效應(yīng)子、類效應(yīng)子小分泌蛋白，氮、硫吸代謝途徑有缺失，氨基酸及寡肽的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族擴(kuò)增等4。本課題組也于近期已完成了中國(guó)小麥條銹菌生理小種CYR32的測(cè)序以及CY23 (China) 、PK-CDRD(Pakistan）、Hu09-2 (Hungary)、104E137A- (Australia) 、Pst-78 (US)的重測(cè)序工作，比較基因組學(xué)分析將大大加深和促進(jìn)對(duì)條銹菌的進(jìn)化、毒性變異及致病機(jī)制的研究。小麥銹菌菌基因組數(shù)據(jù)為我們?nèi)娼馕霾【亩拘宰儺惙肿訖C(jī)制

14、提供了信息資源和物質(zhì)基礎(chǔ)?；谌蚪M關(guān)聯(lián)分析的方法為研究變異規(guī)律提供了思路。2009年Kentaro Yoshida實(shí)驗(yàn)室對(duì)水稻稻瘟菌進(jìn)行重測(cè)序，全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示三個(gè)新的無(wú)毒基因（AVR-Pia,AVR-Pii, AVR-Pik/km/k）5。 最近，HIGS（Host-Induced Gene Silencing，寄主誘導(dǎo)的基因沉默）已應(yīng)用于植物病害研究，為小麥銹菌功能基因組學(xué)研究提供了新的方法和途徑。Daniela（2010）等應(yīng)用HIGS研究小麥白粉菌病，表明寄主誘導(dǎo)的基因沉默通過(guò)沉默效應(yīng)基因Avr10的獲得證明，效應(yīng)基因Avra10可以抑制真菌的發(fā)展但不能消除其存在。小麥銹菌關(guān)鍵

15、生長(zhǎng)發(fā)育和代謝基因、關(guān)鍵效應(yīng)蛋白基因的鑒定，將為借助HIGS技術(shù)利用這些基因來(lái)實(shí)現(xiàn)持久控制小麥病害提供基因資源和技術(shù)保障6。 總結(jié)，通過(guò)對(duì)菌系CY32(China)、CY23(China) 、PK-CDRD (Pakistan）、Pst-78(US）的擴(kuò)繁，收集到了足量的夏孢子；然后對(duì)其用CTABSDS法提取條繡菌DNA；通過(guò)對(duì)重測(cè)序結(jié)果基因組分析，選擇了兩個(gè)候選分泌蛋白基因striiformis_Gene7472進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)四個(gè)生理小種之間存在SNP 、InDel變異，為下一步進(jìn)行熒光定量分析以及功能分析奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 植物材料及培養(yǎng)材料取自不同國(guó)

16、家的菌系CY32 (China) 、CY23 (China) 、PK-CDRD (Pakstan）、Pst-78 (US)。優(yōu)良小麥種子、營(yíng)養(yǎng)土、蛭石、塑料盆等植物培養(yǎng)材料。1.1.2 培養(yǎng)基及常用溶液配制LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂粉15g，pH7.0，高壓滅菌15min。DNA提取液:200mmol/L Tris-HCl (PH7.4)、25mmol/L EDTA (PH8.0) 、250mmol/L NaCl 、0.5% SDS。1.1.3 各種試劑及耗材異丙醇、75%乙醇、鑷子、移液槍、 1.5ml 離心管（EP管）、槍頭、小研磨棒、玻璃棒

17、、小試管、Master Mix、PCR熱循環(huán)儀，移液槍、槍頭、96孔樣板、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖凝膠電泳儀、微波爐、稱量紙、三角瓶、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、超低溫冰箱、高壓滅菌鍋、渦旋混勻器、凝膠成像體統(tǒng)、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、有PCR儀、電泳儀、常溫離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、全智能光照培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、分析天平、顯微鏡、通風(fēng)櫥、純水儀等。1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及技術(shù)路線DNA提取菌種的收集 基因組變異分析（SNP、InDel 揭示小麥條銹菌基因組變異與其毒性變異關(guān)系測(cè)序鑒定，確定變異區(qū)段1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 小麥的種植以及條銹菌的收集：小麥條銹病菌屬于專性寄生菌，尚不能進(jìn)行離

18、體培養(yǎng)（不能在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)），限制了通過(guò)分子手段對(duì)小麥條銹病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)和生理小種變化的研究，只能通過(guò)侵染小麥，收集，再侵染，再收集的方法富集小麥條銹菌，以進(jìn)行下一步的研究。1) 準(zhǔn)備階段：1 材料：森林土壤、蛭石、篩好的細(xì)黃土、小麥種子（銘賢169，特點(diǎn)不抗小麥條銹病，即易被侵染），小花盆，托盤(pán)，噴壺、量杯、一次性手套，鑷子等。2 栽培土壤的準(zhǔn)備：森林土壤和蛭石按2：1的比例混合，再添加適量的水混合均勻，以混合后的土壤可以捏成團(tuán)，但不會(huì)有水滲出為宜。將處理好的土壤分批裝入到小花盆中去，并將表面弄平、壓實(shí)。（為下一步小麥的播種做準(zhǔn)備）3 小麥的播種：在壓好的土壤表面，按五行五列的標(biāo)準(zhǔn)

19、播種小麥（間距要均勻）。4 覆土的準(zhǔn)備：將處理好的細(xì)黃土和森林土壤（1：1）混合，揉搓均勻，不要留有的較大的顆粒。將處理好的覆土均勻的灑在小麥種子上，覆蓋一層，不要太厚也不要太薄，太厚小麥不容易出苗，太薄小麥苗容易長(zhǎng)不穩(wěn)。5 后處理：將栽種好的小花盆均勻的擺放在托盤(pán)上，并將托盤(pán)放置在室溫向陽(yáng)的地方，在托盤(pán)中澆上適量的水。待小麥出苗后轉(zhuǎn)移到控溫控濕的培養(yǎng)室。記錄下播種時(shí)間。6 待小麥苗長(zhǎng)到合適的高度后進(jìn)行下一步的操作，一般為一周左右。2) 人工接菌階段1 菌種：一般有CY32 (China) 、CY23 (China) 、PK-CDRD (Pakstan）、Pst-78 (US)的菌種。2 器材

20、：噴壺，燒杯，泡沫盒、空氣加濕器，玻璃棒，剪刀，大頭針等3 步驟：1、處理和篩選：對(duì)所有小花盆中長(zhǎng)出的小麥苗進(jìn)行處理，用剪刀將未長(zhǎng)到對(duì)應(yīng)高度的、高度過(guò)高的、倒伏的苗剪去不要。并將所剩苗過(guò)少的小花盆予以淘汰。最終剩下的就是我們進(jìn)行下一步操作需要的。 2、脫臘：a、原理：小麥葉片的表面有一層角質(zhì)層，會(huì)增加銹病菌侵染失敗的幾率，所以我們要先脫臘。b、方法：用燒杯盛取潔凈的水，用食指和大拇指蘸水，捏住葉片來(lái)回的捋動(dòng)即可完成脫臘目的。注意：不要太大力，掙斷或損傷葉片。4 潮濕環(huán)境的創(chuàng)造：空氣加濕器中加入潔凈的水，源源不斷的向干凈的泡沫盒中通入潮濕空氣，以創(chuàng)造潮濕的環(huán)境。5 接菌：（麥苗經(jīng)過(guò)脫臘后就可以進(jìn)

21、行接菌操作了） a、取一張錫箔紙，倒取少量的某一菌種 b、先用噴壺噴灑苗，保持濕潤(rùn)，取一根潔凈的大頭針，將葉片表層多余的水刮去 c、用大頭針蘸取錫箔紙上的菌種，順著葉片紋路涂抹在小麥葉片的上表皮 d、確定每一葉片均接菌種后，用噴壺以懸噴的方式噴水，使水霧自然飄落在葉片上e、將接完菌的花盆做好標(biāo)簽放入泡沫盒中，保濕等待下步處理注意事項(xiàng)：1、取菌的時(shí)候要本著用多少取多少的原則。2、接菌的時(shí)候不能損傷葉片。3、接菌完成后的噴水不能對(duì)著噴，在泡沫盒中也不能直接對(duì)著通氣的管子，以防將接上的菌噴落。4、不同的菌種接種時(shí)要分開(kāi)接種，防止污染。6 暗處理：在泡沫盒中加水，并用黑色塑料袋蓋住頂部（但不能太嚴(yán)，保

22、持通氣），轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中進(jìn)行控溫控濕培養(yǎng)24h48h。7 暗處理完成后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室正常處理。8 其他重要細(xì)節(jié)操作：套袋，暗處理完成后，將塑料紙制成桶裝整齊的套在小花盆上，注意過(guò)程中不要損傷葉片，目的為了避免相互之間的交叉感染。要注意經(jīng)常澆水和噴水。3) 菌種的收集 侵染成功的小麥苗會(huì)呈現(xiàn)出相應(yīng)的條銹病病理狀態(tài)，并開(kāi)始萌發(fā)孢子，且大約15天后到達(dá)高峰期，我們則要趁這段時(shí)間收集菌種孢子。器材：玻璃棒，試管，剪刀等（均要潔凈，避免污染）步驟：1 收菌要一盆一盆的來(lái)，使小花盆傾斜的靠在托盤(pán)上，且托盤(pán)處于桌子的邊緣。輕輕的取下塑料套，使小麥葉片自然緩慢的下垂。2 取之前準(zhǔn)備好的試管將一片小麥葉片伸入

23、其中，用玻璃棒敲動(dòng)試管，使孢子震落在試管中即完成收集。重復(fù)此操作，直到確定每一片葉片上的孢子都收集完了。3 重復(fù)操作把所有的小麥苗都收集完。收集完的小麥苗要重新套袋，培養(yǎng)，進(jìn)行下次收集。4 收集菌種孢子的試管要做好標(biāo)簽，放入干燥器，低溫保存。注意事項(xiàng)：1 整個(gè)過(guò)程要經(jīng)可能的輕柔，避免碰撞，以防孢子的損失。2 收菌時(shí)要保證所選的葉片與其他葉片盡量不交聯(lián)，且敲動(dòng)時(shí)不要震動(dòng)到其他葉片造成損失。3 收完菌后要注意剪二葉，即剪去多余的葉片保證營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，新長(zhǎng)出的苗業(yè)應(yīng)剪去。整個(gè)過(guò)程注意不要損傷長(zhǎng)有菌斑的葉片。4 不同的菌種要分開(kāi)收集防止交叉，混合，影響后期的實(shí)驗(yàn)。4）菌種的保存 要保存在干燥器里，且試管

24、口用塑料紙包裹?。ㄓ闷そ罾p?。?，放4冰箱里低溫保存！1.3.2 CTABSDS法提取條繡菌DNA:1) 稱取50g夏孢子，液氮研磨至粉狀，轉(zhuǎn)入兩個(gè)2ml離心管。2) 加入1mL預(yù)熱的CTAB(PH8.0）提取液:(2%CTAB,1.4M NaCl,0.02M EDTA,0.1MTris-cl, 0.2%巰基乙醇），充分混勻。3) 置65水浴1h左右，上下翻轉(zhuǎn)幾次保證混勻，10min一次4) 加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）輕輕顛倒混勻冰水浴5min，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清。5) 加入等體積氯仿，輕輕顛倒混勻冰水浴5min，1min搖一次，4，12000rpm離心1

25、0min，轉(zhuǎn)移上清。6) 取上清液移入1.5ml離心管，加入1/2體積的7.5M pH7.5 NH4OAc，2倍體積異丙醇到樣品中，混勻，-2010min，12000rpm離心15min;用75%乙醇洗一次，12000rpm，4，離心5min，室溫晾干10min。7) 加500l 10mM Tris-Hcl（PH8.0)溶解，5l RNase（10mg/ml) 37溫浴20min，加等體積的氯仿輕輕顛倒混勻冰水浴5min，12000rpm，4，10min。8) 取上清，加入1/10體積的3M pH5.3的NaOAc，2.5倍體積無(wú)水乙醇，-20靜置10min。12000rpm，4,15min，

26、75%乙醇洗兩次，加適量50l 10mM Tris-Hcl（pH8.0)溶解，20保存?zhèn)溆谩?.3.3 PCR擴(kuò)增7（1）用Cobuddy Super Fidelity DNA polymerase PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：試劑 20l 終濃度 5×Cobuddy PCR Buffer 4l 1×dNTP Mix，2.5mM each 1.6l 200 M eachForward Primer，10M 0.8l 0.4 MReverse Primer，10M 0.8l 0.4 MTemplate DNA <250ng <250ngCobuddy Super F

27、idelity DNA polymerase 0.2l 0.4U/20lPCR反應(yīng)RNase-Free Water up to 20l （2）按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增 94 ， 5min 94 ， 30s 58 ， 30s × 30次 72 ， 1min 72 ， 10min 4保存1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（1）選擇并制備瓊脂糖凝膠：用電子秤取0.8g瓊脂糖放入三角瓶中，加入100mlTAE緩沖液，置于微波爐上加熱至完全溶化，室溫逐步冷卻，至適宜溫度加入適量EB（2）制備膠板： 取有機(jī)玻璃作膠托盤(pán)，洗凈晾干，放置于一水平位置，放好擋板。 在適當(dāng)?shù)奈恢梅藕脴悠肥嶙樱ㄊ嶙痈叨?.5

28、1mm，與擋板平行安放）。 倒膠：將冷卻到50左右的瓊脂糖凝膠倒入作膠托盤(pán)中（倒膠時(shí)應(yīng)防止氣泡產(chǎn)生，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察） 待膠充分凝固后，取出梳子，去掉擋板（拔出梳子時(shí)應(yīng)小心的平行拔出，以免造成凝膠、點(diǎn)樣孔破裂）。 將作膠托盤(pán)連同膠一起放入電泳槽中。 加入TE電泳緩沖液至電泳槽中，淹沒(méi)膠面12mm注：因EB有劇毒，故上述操作需帶手套進(jìn)行操作（3）加樣：將PCR擴(kuò)增的目的產(chǎn)物點(diǎn)樣入點(diǎn)樣孔注：加樣時(shí)應(yīng)小心，以免弄破膠，如使得樣孔破裂，造成樣品外溢，可能會(huì)跑不出好的條帶，或條帶不清楚，不利于結(jié)果的鑒定（4）電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，注意正負(fù)極，DNA從負(fù)極向正極移動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)電泳儀的初始電壓

29、調(diào)為150V，即不在調(diào)動(dòng)，待染料移動(dòng)出點(diǎn)樣孔至膠的1/2處即可。（5）紫外分析儀掃膠:將膠置于紫外分析儀中電腦操作自動(dòng)成像，拍照進(jìn)行結(jié)果分析。1.3.5 割膠回收1. 柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 l平衡液BL，12000 rpm (13400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）2. 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量。3. 向膠塊中加入等倍體積溶液PN（如果凝膠重為0.1 g，其體積可視為100 µl，則加入100 µ

30、l PN溶液），50水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可繼續(xù)放置幾分鐘或再補(bǔ)加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解 (若膠塊的體積過(guò)大，可事先將膠塊切成碎塊)。 注意：對(duì)于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶膠后再加入1/2膠塊體積的異丙醇以提高回收率；膠塊完全溶解后最好將溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谑覝貢r(shí)結(jié)合DNA的能力較強(qiáng)。4. 將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12000 rpm (13400×g )離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。

31、注意：吸附柱容積為800l，若樣品體積大于800l可分批加入。5. 向吸附柱CA2中加入600l漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000 rpm (13400×g )離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議PW加入后靜置2-5 min再離心。6. 重復(fù)操作步驟5。7. 將吸附柱CA2放回收集管中，12000 rpm (13400×g )離心2 min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。注意

32、：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。8. 將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB（Buffer EB），室溫放置2min。12000 rpm (13400×g )離心2 min收集DNA溶液。1.3.6 連載體1) 克隆反應(yīng)體系：1 室溫下（20-30），按照如下體系操作：PCR擴(kuò)增好的DNA片段 0.58lPCloneEZ-TOPO載體 1l10×Enhancer 1lddH2O Xl 總反應(yīng)體積 10l加完試劑后，輕輕混勻，然后低速短暫離心，使溶液集中在離心管底。此步驟不要在低溫條件下（如碎冰）上操作。2

33、 室溫下（20-30)放置5min，然后將離心管放置于冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將連接產(chǎn)物放置-20保存。2） 轉(zhuǎn)化1. 取5l連接液至50100l剛剛?cè)诨腄H10B感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。2. 42水浴鍋中熱激30sec。3. 立即放置于冰上靜置2min。4. 加入300-500l無(wú)菌SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），37,200-250rpm振蕩培養(yǎng)60min注<2kb片段連AMP載體可以不復(fù)蘇，直接涂平板。5. 吸取200l菌液鋪板，為得到更多克隆，可先3000g離心2min棄掉部分上清，用移液器輕吹菌體，至充分懸浮，取全部菌液涂板，然后37過(guò)夜培養(yǎng)（12-16

34、h）。3） 陽(yáng)性重組子的鑒定(菌落PCR)1. 挑取大小中等的克隆菌至10l無(wú)菌水中，充分混合。2. 取2l混合液作為PCR反應(yīng)的模板，用試劑盒提供的M13F/M13R作為鑒定重組子的引物。3.PCR反應(yīng)條件：94 2min94 30sec56 30sec 30cycles72 1kb/min （根據(jù)片段的大小確定延伸時(shí)間）72 10min4.取10lPCR產(chǎn)物電泳鑒定，若載體自連，則引物M13F/M13R擴(kuò)增出片段大小為143bp。5.確定重組子后，將剩下的8l混合液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中（含相應(yīng)抗生素）過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，用M13F/M13R測(cè)序。1.3.7測(cè)序結(jié)果分析CY32（Chi

35、na）基因組序列長(zhǎng)度1356 bp;1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGCAAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC241 GGACT

36、AACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACAATC TTGCTTCAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC CCCTCAG

37、AAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CTTTCCTTA

38、C GCAGAATTGT781 TTTTGGCCAA TCCTCTGAGG CTGAGGGAAA GCAAAATCAA TATTACATCA CCTGTGGACA841 GATGGCACTC CCCAAACCAG AAATCAACCC ACCAATCTCT ATCGAAAGCT TAGAAAGCGT901 ACGATTTCCA GGCGCATACA AAAACGGAAA CATTGATCCA GAAGATCCTT TACCAGGCCC961 AAATGTCGTG GACTTCTCCG GGGAAGCCCA GGGCTCTGCC AAAGCATCGT CAACAGTTCG1021 ACAGAGT

39、ACT CCTTCTCCTA CCCCTTCTCC TAACGACAGC GGCGAAGATG AAGGATCCAG1081 GCTTTCGGGT AGCGTGCCCG AGTGCGCTAG AGCTTGTCTT GCCAAAAAGA TTTCGGAAAA1141 CGCCGAGGGA AAACTCGGCG TAATTTGCGC CACACCATCA CCTCAACCAG GACAAACCCA1201 AGCACTTTGT CAATGCAAGG ATGAAAAATT TACTGAGGCC TTTGCAAATT GCGCGAGAGA1261 TCATTGTCAG GTAATTTTTT GTTGA

40、AATCT TCTCCCTTTG AATGTAACAT AAGCTGATTT1321 TCCTCTTGAC TATCCGTTCA AACAGCCGGG CTGTGA Pst-78 (US)基因組序列長(zhǎng)度1465bp1 ATGATGGGCA TTTCGATCAA AACCAATGCT ATCTTTCTGC TTACTGCCAC CCTCTCAACT61 TTACACAACG CGCAACTCGG ACTCTGTCAC GGTTACATCA AAGCGTGGTC TGCGGATGAT121 GGCCATACTT GGACTTTGGG ACAAAAGCAA GATCTGGCAA CATCTTCGAT

41、 CCGTGGTTTC181 TCAGAAAACA CTGGTTGGAT TGGAAGCAAG TTTCTGACCA AACCTGCCAT CGTTTGCAGT241 TCCGGACTAA CACCGAGTCT GAAGGTCGTT GCGCCAAGTG GGGACCTCTT CAGTCAAGCT301 GATCAAAGCG CCGGGAAAAC TTTGTCGGTG GCATCCGGGG CTACAGTGCG CTTGCTAATC361 AATGACGAAC CTCATAAAAT GTGAGTCGGG CAAATCGAGA CTCTTGAACA ATCTTGCTAC421 AAATTTTGG

42、C TTACCTTTTC ACCTTCGGAT CTAGATATCC ACATGAGAAC GGACATATTC481 AGATTTATCT GGGCTACTGC GGCCCCTCAG AAACCGCGTG CGAAAAATTT GATGCCGCAT541 CCATTAGTTA CTTCAAAATC TTGTCATTGA AGCATGGGTT AGGATCCAAG GAAGAATTTC601 CTTACAACAA ACACAAGGAC GGAAATGAAG TCAAAGTGCC GATCCCCAAA AATCTACCAA661 TGGGTAGTTA CATCATGCGG ATCGAATTGT

43、AAGAGTTGTT TCCTTAAGCC CCTCCTCTTT721 TCAAGTCGAC GTGAATGTGT GGTATTGACT CCCAAACACC CTTCTTTCCT TACGCAGAAT781 TGTTTTTGGC CAATCCTCTG AGGCTGAGGG AAAGCAAGAT CAATATTACA TCACCTGTGG841 ACAGATGGCA CTCCCCAAAC CAGAAATCAA CCCACCAATC TCTATCGAAA GCTTAGAAAG901 CGTACGATTT CCAGGCGCAT ACAAAAACGG AAACATTGAT CCAGAAGATC CT

44、TTACCAGG961 CCCAAATGTC GTGGACTTCT CCGGGGAAGC CCAGGGCTCT GCCAAAGCAT CGTCAACAGT1021 TCGACAGAGT ACTCCTTCTC CTACCCCTTC TCCTAACGAC AGCGGCGAAG ATGAAGGATC1081 CAGGCTTTCG GGTAGCGTGC CCGAGTGCGC TAGAGCTTGT CTTGCCAAAA AGATTTCGGA1141 AAACGCCGAG GGAAAACTCG GCGTAATTTG CGCCACACCA TCACCTCAAC CAGGACAAAC1201 CCAAGCAC

45、TT TGTCAATGCA AGGATGAAAA ATTTACTGAG GCCTTTGCAA ATTGCGCGAG1261 AGATCATTGT CAGGTAATTT TTTGTTGAAA TCTTCTCCCT TTGAATGTAA CATAAGCTGA1321 TTTTCCTCTT GACTATCCGT TCAAACAGCC GGGCTGTGAA GTAGAAGATG CAATCAATTC1381 ATTCAGCAAT TTGTGTGGAC TAAAGACTAA GCCTTCAAGA TGTCAAAATA ACAACAAAAG1441 AGAAAGACCA GTGTTACTCA TTTGAC

46、Y23 (China) 基因組序列長(zhǎng)度1346bp1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGCAAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC24

47、1 GGACTAACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACAATC TTGCTACAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC

48、CCCTCAGAAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CT

49、TTCCTTAC GCAGAATTGT781 TTTTGGCCAA TCCTCTGAGG CTGAGGGAAA GCAAGATCAA TATTACATCA CCTGTGGACA841 GATGGCACTC CCCAAACCAG AAATCAACCC ACCAATCTCT ATCGAAAGCT TAGAAAGCGT901 ACGATTTCCA GGCGCATACA AAAACGGAAA CATTGATCCA GAAGATCCTT TACCAGGCCC961 AAATGTCGTG GACTTCTCCG GGGAAGCCCA GGGCTCTGCC AAAGCATCGT CAACAGTTCG1021

50、ACAGAGTACT CCTTCTCCTA CCCCTTCTCC TAACGACAGC GGCGAAGATG AAGGATCCAG1081 GCTTTCGGGT AGCGTGCCCG AGTGCGCTAG AGCTTGTCTT GCCAAAAAGA TTTCGGAAAA1141 CGCCGAGGGA AAACTCGGCG TAATTTGCGC CACACCATCA CCTCAACCAG GACAAACCCA1201 AGCACTTTGT CAATGCAAGG ATGAAAAATT TACTGAGGCC TTTGCAAATT GCGCGAGAGA1261 TCATTGTCAG GTAATTTTT

51、T GTTGAAATCT TCTCCCTTTG AATGTAACAT AAGCTGATTT1321 TCCTCTTGAC TATCCGTTCA AACAGCCGGG CTGTGA注釋(劃線的部分為內(nèi)含子序列）PK-CDRD(Pakistan）基因組序列長(zhǎng)度1356bp1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGC

52、AAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC241 GGACTAACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACA

53、ATC TTGCTTCAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC CCCTCAGAAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CTTTCCTTAC GCAGAATTGT7