生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)則 為了保證生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行， 培養(yǎng)同學(xué)們掌握良好、 規(guī)范的生物化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能， 特制定以下實(shí)驗(yàn)細(xì)則，請同學(xué)們嚴(yán)格遵守。 1. 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)提前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書并復(fù)習(xí)相關(guān)知識。 2. 嚴(yán)格按照生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)分組，分批進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，不得遲到。非本實(shí)驗(yàn)組的同學(xué)不準(zhǔn)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。 3. 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿實(shí)驗(yàn)服。各位同學(xué)進(jìn)入各自實(shí)驗(yàn)小組實(shí)驗(yàn)臺后，保持安靜，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實(shí)驗(yàn)臺隨便走動。絕對禁止用實(shí)驗(yàn)儀器或藥物嬉耍。 4. 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)臺的整潔，廢液倒入廢液桶中，用過的濾紙放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟。 5. 實(shí)驗(yàn)中要注意節(jié)約藥品與試劑，愛護(hù)儀器，使用前應(yīng)

2、了解使用方法，使用時(shí)要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實(shí)驗(yàn)儀器。否則，因非實(shí)驗(yàn)性損壞，由損壞者賠還。 6. 使用水、火、電時(shí)，要做到人在使用，人走關(guān)水、斷電、熄火。 7. 做完實(shí)驗(yàn)要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。 8. 實(shí)驗(yàn)后，要及時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、 實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)課前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)，將實(shí)驗(yàn)名稱、目的和要求、原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、操作方法和步驟等簡單扼要地寫在記錄本上。實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)，應(yīng)該及時(shí)地直接記在記錄本上，絕對不可以用單片紙做記錄或草稿。原始記錄必須準(zhǔn)確、簡練、詳盡、清楚。從實(shí)驗(yàn)課開始就應(yīng)養(yǎng)成這種良好的習(xí)慣。記錄時(shí)，應(yīng)做到正確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果、切忌夾雜主觀因素，

3、這是十分重要的。在實(shí)驗(yàn)條件下觀察到的現(xiàn)象，應(yīng)如實(shí)仔細(xì)地記錄下來。在定量實(shí)驗(yàn)中觀測的數(shù)據(jù)，如稱量物的重量、滴定管的讀數(shù)、光電比色計(jì)或分光光度計(jì)的讀數(shù)等，都應(yīng)設(shè)計(jì)一定的表格準(zhǔn)確記下正確的讀數(shù)，并根據(jù)儀器的精確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。例如，光密度值為0.050不應(yīng)寫成0.05。每一個(gè)結(jié)果最少要重復(fù)觀測兩次以上，當(dāng)符合實(shí)驗(yàn)要求并確知儀器工作正常后再寫在記錄本上。實(shí)驗(yàn)記錄上的每一個(gè)數(shù)字，都是反映每一次實(shí)驗(yàn)的測量結(jié)果，所以，重復(fù)觀測時(shí)即使數(shù)據(jù)完全相同也應(yīng)如實(shí)記錄下來。數(shù)據(jù)的計(jì)算也應(yīng)該寫在記錄本的另一頁上，一般寫在正式記錄左邊的一頁?？傊?，實(shí)驗(yàn)的每個(gè)結(jié)果都應(yīng)正確無遺漏地做好記錄。實(shí)驗(yàn)中使用儀器的類型、編號以及試

4、劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、準(zhǔn)確的濃度等，都應(yīng)記錄清楚，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對和作為查找成敗原因的參考依據(jù)。如果發(fā)現(xiàn)記錄的結(jié)果有懷疑、遺漏、丟失等，都必須重做實(shí)驗(yàn)。因?yàn)?，將不可靠的結(jié)果當(dāng)作正確的記錄，在實(shí)際工作中可能造成難于估計(jì)的損失。所以，在學(xué)習(xí)期間就應(yīng)一絲不茍，努力培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)。二、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫應(yīng)使用黑色或藍(lán)色鋼筆或圓珠筆，可使用鉛筆作圖或用Excel電腦打印制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，目的和要求、原理以及操作方法部分應(yīng)簡單扼要的敘述，但是對于實(shí)驗(yàn)條件（試劑配制及儀器）和操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)必須寫清楚。對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分，應(yīng)根據(jù)實(shí)

5、驗(yàn)課的要求將一定實(shí)驗(yàn)條件下獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析和對比，并盡量總結(jié)成各種圖表，如原始數(shù)據(jù)及其處理的表格、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以及比較實(shí)驗(yàn)組與對照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表等。另外，還應(yīng)針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行必要的說明和分析。討論部分可以包括：思考題；實(shí)驗(yàn)的正常結(jié)果和異?，F(xiàn)象；關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法（或操作技術(shù)）和有關(guān)實(shí)驗(yàn)的一些問題；對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識、體會和建議；對實(shí)驗(yàn)課的改進(jìn)意見等（要針對實(shí)驗(yàn)操作方面內(nèi)容，對于應(yīng)付寫缺少儀器設(shè)備的不給分）。實(shí)驗(yàn)報(bào)告規(guī)范格式：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?分二、實(shí)驗(yàn)原理: 15分三、實(shí)驗(yàn)步驟: 20分四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 20分五、討論分析: 30分六、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)建議: 10分1糖類的顏色反應(yīng)目的：

6、應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類內(nèi)容：Molisch反應(yīng)、Seliwanoff反應(yīng)2總糖和還原糖含量的測定目的：掌握樣品中還原糖和總糖的提取和測定方法內(nèi)容：總糖和還原糖的測定3總氮量的測定（凱氏定氮法）目的：掌握總氮含量測定的原理和技術(shù)內(nèi)容：凱氏定氮法測定總氮4.Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度目的：掌握蛋白質(zhì)濃度測定的原理和方法內(nèi)容：Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度5氨基酸的分離鑒定（紙層析法）目的：掌握氨基酸的性質(zhì)，紙層析法的基本原理及操作方法內(nèi)容:氨基酸的紙層析6蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)和等電點(diǎn)的測定目的：了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)內(nèi)容：蛋白質(zhì)沉淀，等電點(diǎn)測定7肝細(xì)胞核中核酸的分離和測定目的：掌握核酸的分

7、離和測定方法內(nèi)容：從肝細(xì)胞中分離核酸（DNA和RNA），并測定其含量8維生素C的定量測定目的：掌握維生素C的測定原理和方法內(nèi)容：2,4-二硝基苯肼法測定維生素C9血液中轉(zhuǎn)氨酶活性分析分光光度法目的：了解轉(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)及臨床意義。掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定方法。內(nèi)容：酶活力測定10脂肪酸的-氧化目的：掌握脂肪酸的-氧化的過程及產(chǎn)物內(nèi)容：脂肪酸-氧化的檢測方法11蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定目的：學(xué)會獨(dú)立設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)策略、摸索和設(shè)計(jì)樣品處理等操作細(xì)節(jié)，并通過獨(dú)立思考分析結(jié)果。內(nèi)容：學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在給定實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡那疤嵯?，使學(xué)生能夠自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，掌握一種測定未知蛋白質(zhì)的分子量的方法； 實(shí)驗(yàn)一 糖類的顏色反應(yīng)一

8、、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解糖類某些顏色反應(yīng)的原理。2學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1.-萘酚反應(yīng)（Molisch反應(yīng)）原理糖在濃無機(jī)酸（硫酸、鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與-萘酚生成紫紅色物質(zhì)。因?yàn)榭啡┘翱啡┭苌飳Υ朔磻?yīng)均呈陽性，故此反應(yīng)不是糖類的特異反應(yīng)。2.間苯二酚反應(yīng)（Seliwanoff反應(yīng)）原理在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物質(zhì)。此反應(yīng)是酮糖的特異反應(yīng)。醛糖在同樣條件下呈色反應(yīng)緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時(shí)間較長時(shí)，才呈微弱的陽性反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)條件下蔗糖有可能水解而呈陽性反應(yīng)。三、器材1.試管及試管架 2.滴管3.水浴鍋四、

9、試劑1.莫氏（Molisch）試劑： 5% -萘酚的酒精溶液，稱取-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使總體積達(dá)100mL，貯于棕色瓶內(nèi)。此試劑需新鮮配制。2.塞氏（Seliwanoff）試劑：稱取間苯二酚0.05g溶于30 mL濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 mL，此試劑需新鮮配制。3.1%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖1g，溶于100mL蒸餾水中。4.1%果糖溶液：稱取果糖1g，溶于100mL蒸餾水中。5.1%蔗糖溶液：稱取蔗糖1g，溶于100mL蒸餾水中。6.1%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉1g與少量冷蒸餾水混合成薄漿狀物，然后緩緩傾入沸蒸餾水中，邊加邊攪，最后以沸蒸餾水稀釋至100mL。7.

10、0.1%糠醛溶液：稱取糠醛0.1g，溶于100mL蒸餾水中。8.濃硫酸 500mL五、操作1.-萘酚反應(yīng)（Molisch反應(yīng)）取5支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑，充分混合。斜執(zhí)試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸約1mL，慢慢立起試管，切勿搖動。濃硫酸在試液下形成兩層。在二液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記錄各管顏色。試劑現(xiàn)象解釋現(xiàn)象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.間苯二酚反應(yīng)（Seliwanoff反應(yīng)）取3支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶

11、液各5mL。再向各管分別加入塞氏試劑2mL，混勻。將3支試管同時(shí)放入沸水浴中，注意觀察、記錄各管顏色的變化及變化時(shí)間。六、思考題1可用何種顏色反應(yīng)鑒別酮糖的存在？2-萘酚反應(yīng)的原理是什么？實(shí)驗(yàn)二 還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法一、目的與要求掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學(xué)習(xí)比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用。二、實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，

12、可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540 nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料 小麥面粉(1000 g) 2主要儀器（1）具塞玻璃刻度試管：20 mL×11 （2）

13、 濾紙 （3）燒杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒溫水浴鍋 （8）煤氣爐 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度計(jì)3 試劑（1）1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取80 烘至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆谩?（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5 g DNS溶于

14、少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化鉀溶液：稱取5 g碘和10 g碘化鉀，溶于100 mL蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分別取59.19 mL 37%濃鹽酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步驟1. 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支20 mL具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不

15、同葡萄糖含量的反應(yīng)液。表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，取出，用冷水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻。調(diào)分光光度計(jì)波長至540 nm，用0號管調(diào)零點(diǎn)，等后面710號管準(zhǔn)備好后，測

16、出16號管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線光密度值葡萄糖含量（mg）2. 樣品中還原糖和總糖的測定（1）還原糖的提取準(zhǔn)確稱取3.00 g食用面粉，放入100 mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50 mL蒸餾水，攪勻，置于50 恒溫水浴中保溫20 min，不時(shí)攪拌，使還原糖浸出。過濾，將濾液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。（2）總糖的水解和提取準(zhǔn)確稱取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸餾水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加熱水解30 min,

17、取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解畢。冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100 mL，過濾取濾液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。（3）顯色和比色取4支20 mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待測液和顯色劑，將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，取出，冷水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長540 nm，用0號管調(diào)零點(diǎn)，測出710號管的光密度值。表2 樣品

18、還原糖測定管 號還原糖待測液（mL）總糖待測液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲線葡萄糖量（mg）平均值70.5 1.51.5  80.5 1.51.5  9 111.5  10 111.5  五、結(jié)果與計(jì)算計(jì)算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量(以葡萄糖計(jì))。還原糖（%）=查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)× 提取液總體積測定時(shí)取用體積

19、15;100 =樣品毫克數(shù)總糖（%）=查曲線所得水解后葡萄糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)×0.9×100 =樣品毫克數(shù)六、注意1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品測定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行顯色，并使用同一空白調(diào)零點(diǎn)和比色。2. 面粉中還原糖含量較少，計(jì)算總糖時(shí)可將其合并入多糖一起考慮。七、思考題1.在樣品的總糖提取時(shí)，為什么要用濃HCl處理？而在其測定前，又為何要用NaOH中和？2.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度和樣品含糖量的測定為什么應(yīng)該同步進(jìn)行？比色時(shí)設(shè)0號管有什么意義？3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是什么？實(shí)驗(yàn)三 動物組織中核酸的分離及定量核酸廣泛的存在于一切生物細(xì)胞中，亦為病毒的主要成分。業(yè)已證實(shí)核酸在蛋白質(zhì)

20、的生物合成，病毒的傳染、癌瘤的發(fā)生以及生物遺傳等方面均有重要作用，引起科學(xué)界對核酸研究的重視。本實(shí)驗(yàn)通過生物材料中核酸的分離及定量使學(xué)生初步了解RNA和DNA的基本測定方法，對生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的研究具有一次意義。核酸基本組成單位是核苷酸類，即由有機(jī)含氮堿、戊糖及磷酸所構(gòu)成，作為RNA核苷酸成分的特點(diǎn)是含有核糖，而DNA則含脫氧核糖，此外有機(jī)堿可有所不同，如RNA含尿嘧啶，而DNA含胸腺嘧啶等?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆蘸怂岱蛛x定量的原理和方法【實(shí)驗(yàn)原理】根據(jù)核酸與組織其它有機(jī)物質(zhì)在溶劑中溶解性的不同，而逐步使之與脂類，蛋白質(zhì)以及其它小分子物質(zhì)分離。然后根據(jù)兩種核酸所含戊糖的性質(zhì)分別進(jìn)行定量。（l）除去低分子

21、物質(zhì)： 用三氯乙酸將細(xì)胞中的高分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)及脂類（呈脂蛋白形式存在）沉淀下來，而使一些小分子物質(zhì)溶于三氯乙酸中，離心進(jìn)行分離。（2）除去脂類：用熱乙醇提取沉淀中脂類。（3）提取核酸及定量。向沉淀（只含有核酸及蛋白質(zhì)）中加三氯乙酸，并在90加熱，使核酸水解為其組成成分而溶于酸，這時(shí)蛋白質(zhì)不受影響，離心后將核酸的水解產(chǎn)物（在上清中）與蛋白質(zhì)（沉淀部分）分開，取上清以二苯胺或地衣酚試劑呈色?？煞謩e測定DNA及RNA的量。呈色的基本原理是當(dāng)RNA中的核糖及DNA中的脫氧核糖在酸的存在下加熱時(shí)則脫水生成醛類衍生物并分別同地衣酚（35一二羥基甲苯，或二本胺試劑反應(yīng)產(chǎn)生呈色物質(zhì)。 【實(shí)驗(yàn)操作】（1）取

22、新鮮鼠肝 0.4g，用小剪刀剪碎，放勻漿管中，用吸管取 15三氯乙酸 8mL，先加約23mL于上述勻漿管中，用勻漿器研磨35分鐘。然后移入一離心管中（注意在轉(zhuǎn)移過程中避免損失），再以 15三氯醋酸2mL洗勻漿管，重復(fù)洗 23次，注意將勻漿管洗凈，全部移入離心管中此時(shí)總量約8mL靜止5分鐘后離心10分鐘（3000rpm）（2）傾棄上清（用玻璃輕棒管口，迅速傾泄之）。（3）在離心管中加入8mL無水乙醇（醋酸鈉飽和的）。用玻璃棒攪起沉淀。（4）準(zhǔn)備好一沸騰水浴，將火關(guān)閉（注意：此項(xiàng)操作要嚴(yán)格遵守，否則可能造成事故），然后手持試管央夾將離心管放在水浴中，待乙醇沸騰后兩分鐘取出（注意；勿使乙醇在沸騰時(shí)沖

23、出管外），離心2000轉(zhuǎn)分，10分鐘，棄上清（此上清中含有脂類）。（5）在離心管中加入 8mL5三氯醋酸，用玻璃棒攪起沉淀，在90水浴中加熱 15分鐘取出稍冷后離心 2000轉(zhuǎn)分，10分鐘，傾上清于10mL量杯中加水至 10mL（此液含有核酸，可用以定量）。將沉淀?xiàng)壷＃?） RNA定量：取試管4支，按表加入試劑（加地衣酚試劑時(shí)可用滴管）試管H2O標(biāo)準(zhǔn)RNA液檢品（由操作所得上清）地衣酚123（標(biāo)準(zhǔn)）4（空白）1.8mL1.8mL2.0mL - -2.0mL-0.2mL0.2mL - -4.0mL 4.0mL4.0mL4.0mL 將各管內(nèi)容物混勻后在沸水浴中加熱25分鐘后，用水道水冷卻以后用6

24、65nm或紅色濾光板比色。（7）DNA定量取試管4支，按下表加入試劑（加二苯胺試劑可用滴管）試管H2O標(biāo)準(zhǔn)DNA液樣品（由操作5所得上清）二苯胺試劑123（標(biāo)準(zhǔn)管)4（空白管）-2.0mL-2.0mL-2.0mL2.0mL - -4.0mL4.0mL4.0mL4.0mL各管內(nèi)容物混勻后在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后比色，用595nrn或紅色濾光板。（8）計(jì)算：RNA含量： RNAg/100mg新鮮組織=Du/Ds×80（g）×10/0.2×100/400=Du/Ds×1000 DNA含量DNAg/100mg新鮮組織=Du/Ds×200（g）&#

25、215;10/2×100/400=Du/Ds×250 【注】（1）RNA及DNA定量比色時(shí)，注意勿使比色液外濺，以免損傷儀器及衣物。因地衣酚試劑及二苯胺試劑中含濃酸，比色完畢后廢液倒入水道時(shí)，必須用大量水沖洗水道，否則試劑中濃酸會腐蝕水道，比色杯及時(shí)洗凈空干。（2） 鼠肝的RNA含量約9001000g100mg組織；DNA含量約為220g100mg組織。實(shí)驗(yàn)四 微量凱氏定氮法目的1. 掌握微量凱氏定氮法測定樣品總氮量和蛋白質(zhì)的原理和方法2. 學(xué)會使用凱氏定氮儀原理凱氏(Kjeldahl)定氮法常用于測定天然有機(jī)物(如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等)的含氮量。天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共

26、熱時(shí)，其中的碳、氫被分別氧化成CO2和H2O，而氮則變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。該反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀/硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：NH2濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量及一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)(相當(dāng)于待測物中氨的當(dāng)量數(shù))計(jì)算出待測物中的氮量。(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4

27、 + 2 NH4OHNH4OH H2O + NH3NH3 + H3BO3 NH4H2BO3NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.25.6，將NH4H2BO3的藍(lán)/綠色滴至原來H3BO3的藍(lán)紫色即為終點(diǎn)。本法適用范圍0.21.0mg氮，相對誤差應(yīng)小于2%。材料、試劑與器具材料卵清蛋白、面粉等含蛋白質(zhì)樣品試劑1. 濃硫酸(化學(xué)純)2. 30%氫氧化鈉(分析純)溶液3. 0.9%NaCl溶液4. 硫酸鉀-硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末5. 2%硼酸6. 混合指示劑(田氏)：0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶

28、液50ml與0.1%甲基紅乙醇溶液200ml混合配成(貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍窄且靈敏)7. 0.0500M HCl8. 硼酸-指示劑混合液： 2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可(約加1ml左右混合指示劑)。9. 標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(0.3mg N/ml)器具凱氏燒瓶 消化架 吸量管(1ml, 2ml) 量筒(10ml) 凱氏定氮蒸餾裝置微量滴定管(3ml, 5ml, 可讀至0.02ml) 錐形瓶(50100ml) 容量瓶(50ml)操作步驟 樣品的處理血清樣品：取人血(或豬血)放于離心管中，于冰箱中放置過夜，次日離心除去凝

29、血塊，上層黃色透明清液即為血清。準(zhǔn)確吸取血清1.0ml加入0.9%NaCl 4.0ml，仔細(xì)混勻備用。固體樣品：在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，置105 (非游離的水不能在100以下烘干)烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)至恒重。 消化在50ml凱氏燒瓶內(nèi)加2ml稀釋血清溶液或0.10.5g干燥樣品(直接加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上)。 向該燒瓶加入硫酸鉀-硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸310ml，小瓷片兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化。在消化開始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直

30、至消化液呈透明藍(lán)綠色為止。消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10ml (注意慢加，邊加邊搖)。冷卻后將瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。 蒸餾 1、儀器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。 蒸餾器有幾種，應(yīng)用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：開放自來水龍頭，使水E進(jìn)入G，從K管流出(水不宜開得過大以免水從G管溢出)。開放P3，使水進(jìn)入A室，漏斗D中加蒸餾水約10ml入B室。用拇指將管口按緊，同時(shí)開放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸餾器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用(可用pH試紙檢查)。A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關(guān)，P1為出水開關(guān)，B為蒸餾室，與出氣管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為冷凝管，E為進(jìn)水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時(shí)依次在B室加入消化好的樣品及NaOH, 二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶由硼酸吸收。圖1-1 凱氏微量定氮蒸餾裝置2、蒸餾標(biāo)準(zhǔn)樣品先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液試驗(yàn)23次。蒸餾器洗凈后，開放P3