植物多靶點CRISPR-Cas9載體使用方法(2015-5-1)

1、CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉耀光課題組(ygliu)1. pYLCRISPR/Cas9多靶點載體介紹CRISPR/Cas9是新近發(fā)展的基因組編輯技術(shù)（圖1）。CRISPR/Cas9切割靶序列僅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引導(dǎo)的C

2、as9蛋白，比鋅指核酸酶（ZFNs），TALENs更加簡便，高效，因而成為基因組編輯工具的首選。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)可方便地進行多重靶向的特征，構(gòu)建了一套用于單子葉和雙子葉植物的多靶點CRISPR/Cas9基因打靶載體系統(tǒng)。本套載體將Cas9蛋白表達盒整合到雙元載體上，用于裝載多個sgRNA表達盒的多克隆位點Bsa I位于靠近雙元載體RB位置。sgRNA表達盒元件設(shè)在中間質(zhì)粒載體上，利用酶切連接和PCR方法拼裝好，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法組裝到雙元載體上。本載體系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)表（Ma et al., 2015, Molecular Plan

3、t, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).2CRISPR/Cas9載體與sgRNA載體圖譜2.1CRISPR/Cas9雙元載體本套載體系統(tǒng)的雙元載體骨架為pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p為本實驗室設(shè)計合成的植

4、物優(yōu)化密碼子基因，它模擬了禾本科植物基因具有5端GC含量較高的特征 (Figure 2)。這些質(zhì)粒在E. coli TOP10F(LacIq) 菌株繁殖，該菌株LacIq基因型產(chǎn)生的阻礙蛋白可抑制ccdB大腸桿菌致死基因的表達。我們對pYLCRISPR/Cas9載體采用了新的命名，與舊的命名對應(yīng)關(guān)系見表1。pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B載體中的Cas9p用PUbi驅(qū)動，優(yōu)選用于單子葉植物的基因打靶；對于雙子葉植物，我們前期使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H在擬南芥獲得了uniform簡單突變（雙等位突變，雜合突變，純合突變）以及嵌合突變（Ma et al., 201

5、5）。但是，我們最近發(fā)現(xiàn)用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在擬南芥的打靶效果效率比使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H的效果效率更高，能得到更多的簡單突變。因此也推薦在雙子葉植物優(yōu)先使用PUbi驅(qū)動Cas9p的載體pYLCRISPR/Cas9P35S-H或pYLCRISPR/Cas9P35S-B。Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H), Ba

6、r (-B), and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cuttin

7、g sties Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R) for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene.表一 pYLCRISPR/Cas9載體新舊命名對應(yīng)關(guān)系新命名原命名適用植物種植物抗性pYLCRISPR/Cas9Pubi-HpYLCRISPR/Cas9-MH,pYLCRISPR/Cas9-MTmono單子葉/雙子葉潮霉素pYLCRISPR/Cas9Pubi-BpYLCRISPR/Cas9-MB單子葉/雙

8、子葉草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-HpYLCRISPR/Cas9-DH雙子葉潮霉素pYLCRISPR/Cas9P35S-BpYLCRISPR/Cas9-DB雙子葉草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-NpYLCRISPR/Cas9-DN雙子葉卡那霉素2.2 CRISPR/sgRNA vectors sgRNA序列全長97 nt，分為兩部分，5決定靶序列的20nt (seed sequence)和3區(qū)域為保守的結(jié)構(gòu)序列。因此構(gòu)建針對特定靶位點的sgRNA，只需要克隆決定靶序列的5端20 nt。 sgRNA用small nuclear (sn) RNA U6/U3啟動子驅(qū)動，以

9、保證轉(zhuǎn)錄出的sgRNA停留在細胞核中與Cas9結(jié)合。本方案用PCR擴增的方法構(gòu)建包含靶序列的sgRNA表達盒，并在擴增引物5端引入順次排列的位置特異Bsa I 酶切位點，用于Golden Gate克隆?；蛟跀U增引物5端加入互補序列用于Gibson Assembly 連接克隆。為了提高構(gòu)建好的多靶點載體的穩(wěn)定性，避免在農(nóng)桿菌或者植物基因組中sgRNA表達盒之間發(fā)生同源重組，從水稻克隆了4個不同snRNA啟動子(OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c)，用于單子葉植物；從擬南芥中克隆了4個不同snRNA啟動子（AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29），用于雙子葉植物。Figur

10、e 3(A) Overall structure of eight basic sgRNA intermediate vectors. (B) The two Bsa I cutting sequences are given in twelve sgRNA vectors (in a linear form), including other four vectors (pYLsgRNA-OsU3/LacZ, pYLsgRNA-OsU6a/LacZ, pYLsgRNA-AtU3b/LacZ, and pYLsgRNA-AtU3d/LacZ) that have an additional L

11、acZ gene (198 bp) as a cloning selection marker. The U3 and U6 promoters from rice (Os) and Arabidopsis (At) and the sgRNA sequence are separated by the vector backbone, to avoid amplification of the uncut plasmids by PCR with short extension time during the construction of sgRNA expression cassette

12、s. Cutting (small arrows) with Bsa I produces different non-palindromic sticky ends to the promoters and an end to the sgRNA sequence. (C) A representative regular target and an irregular target, their target adaptors for the OsU6a promoter, and the transcribed 5 sequences are shown. A ligated targe

13、t-sgRNA expression cassette is amplified by nested PCR using primers U-F/gR-R and Pps/Pgs. Pps and Pgs are position-specific primers with Bsa I sites for the Golden Gate ligation (Table S1), or with overlapping ends for Gibson Assembly (Table S3). 3.靶位點選擇和接頭設(shè)計3.1 靶位點選擇建議對1個目的基因設(shè)計2個靶點(尤其只有一個靶基因)，以降低某

14、靶點打靶不成功的風險?？稍贠RF 5區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域各設(shè)計1個靶點，使之任何1個靶點的突變都可以產(chǎn)生功能缺失，或2個靶點之間的序列被敲除。設(shè)計靶點的原則：(1) 目的基因(轉(zhuǎn)錄方向)的正鏈和負鏈靶點的打靶效率大致相同，都可以設(shè)計靶點；(2) Regular targets & irregular targets (見以下說明)有同等打靶效率；(3) 靶點的GC%盡量不要低于40%，靶點序列GC%偏高(50-70%)有較高的打靶效率。靶點內(nèi)(按5-N20NGG-3方向)不要有連續(xù)4個以上的T，以防RNA Pol III將其作為轉(zhuǎn)錄終止信號；(4) 雖然非特異打靶（脫靶）對植物基因打靶不是很

15、重要的問題，但應(yīng)進行靶點特異性分析：用靶點+NGG（前后各加幾十堿基）與基因組做blast (選Somewhat similar sequences），避免使用與同源序列差異少于5個堿基的靶點(在切點附近和PAM可有2個堿基差異就具有特異性)?？梢允褂迷诰€軟件CRISPR-P ( targets (AN19NGG或GN19NGG)，見以下關(guān)于Regular target & irregular target說明。(5) 打算用一個靶序列敲除2個或以上的同源基因時，選擇同源基因中堿基完全相同的區(qū)域為靶位點。(6) 把靶點序列連接到sgRNA序列的5端(20 bp target)GTTTT

16、AGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT,利用在線軟件RNA Folding Form (/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)做二級結(jié)構(gòu)分析。靶序列與sgRNA序列產(chǎn)生連續(xù)配對7 bp（注意：RNA可以產(chǎn)生U-G配對）以上會抑制其與染色體DNA靶序列結(jié)合靶點，因此要避免使用連續(xù)配對7 bp以上的靶序列。3.2靶點接頭設(shè)計U6/U3基因由III型RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄起始點是確定的堿基位置。例如，U6為G

17、堿基，U3為A堿基。因此，由U6/U3啟動子驅(qū)動的sgRNA首堿基一定是G或者A。但是設(shè)計的靶序列的首堿基不一定剛好是G或者A，因此設(shè)計接頭引物時需分兩種情況考慮：（1）如果目標區(qū)NGG(PAM)上游第20堿基是A（用U3啟動子）或G(用U6啟動子），作為常規(guī)靶點(regular target)，將A/G下游19堿基可按下圖所示合成接頭。常規(guī)靶點（regular target）接頭（target adaptor）的形式注：接頭正向引物T#-F和反向引物T#-R命名是根據(jù)靶點在sgRNA表達盒的連接方向決定，不是基因方向決定，否則這些引物用于檢測陽性克隆時容易搞錯方向; 另外注意設(shè)計引物（尤其反

18、向引物）時的5-3方向。（2）如果NGG上游第20堿基不是A或G，作為非常規(guī)靶點(irregular target)，將20堿基為靶序列合成接頭的形式非常規(guī)靶點（irregular target）接頭的形式也就是說，所用啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點與NGG上游第20堿基相同的regular靶點就是合成19堿基+4堿基粘性末端(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的靶點配對序列為A/G+19 =20)；不相同的irregular靶點就是合成20堿基+4堿基粘性末端。對使用擬南芥的AtU3/AtU6啟動子的靶點接頭也是同樣道理，但對接各啟動子的粘性末端不同（見Figure 3B）。3.3 Overlapping PCR法構(gòu)建sgRNA

19、表達盒的引物設(shè)計見4.1.2（與3.2相同目的，自由選擇用任一個方案）4. pYLCRISPR/Cas9打靶載體構(gòu)建原理4.1靶點引物接頭與sgRNA表達盒的連接和擴增4.1.1 sgRNA構(gòu)建方法1 (接頭連接擴增法，與3.2對應(yīng))：連接接頭后（連接操作見步驟5-5），有3種方法擴增sgRNA表達盒片段（Figure 4）：（1）直接用Golden Gate位置特異引物(Table S1)做一輪PCR擴增。此方案效果不那么穩(wěn)定，且不能避免擴增下圖的產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V。（2）做2輪巢式PCR，第一輪PCR用通用的U-F/gR-R做1個反應(yīng)（引物序列見附錄），第二輪PCR用位置特異引物擴增。此方案

20、擴增效果好且穩(wěn)定，但同樣不能避免擴增產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V（注1）。（3）做2輪巢式PCR，第一輪PCR做2個反應(yīng)，分別用U-F/接頭反向引物，和用接頭正向引物/gR-R；第二輪為Overlapping PCR,用位置特異引物擴增出表達盒產(chǎn)物。雖然此方案第一輪PCR需要做2個反應(yīng)，但效果最好且能避免擴增產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V，因此推薦使用此方法。Figure 4Generation of a sgRNA expression cassette by adaptor-ligation and PCR amplification在第一輪PCR加熱過程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和sgR

21、NA序列）先解離， U3/6和sgRNA序列3端（未解離）立即延伸補平，產(chǎn)生接頭引物互補結(jié)合位點。注1:為了提高接頭連接效率，本操作中使用較高濃度（0.05 M）的靶點接頭，實際上大部分產(chǎn)生線性單端連接(產(chǎn)物II, III)，而環(huán)狀(雙端)連接(產(chǎn)物I)較少。另外，過度酶切，星活性，過度連接等都可能產(chǎn)生破壞的平滑末端，有可能連接產(chǎn)生雙接頭產(chǎn)物或的空載產(chǎn)物（產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V）。4.1.2 sgRNA構(gòu)建方法2 （以O(shè)verlapping PCR 往sgRNA表達盒導(dǎo)入靶序列）這種方法不需要用Bsa I切sgRNA質(zhì)粒和連接反應(yīng)，更加簡便，不會產(chǎn)生上述的產(chǎn)物IV和V。即設(shè)計的2條靶點引物3端有15

22、-17 nt分別與U3/U6啟動子和sgRNA配對，用PCR擴增出片段后進行第二輪overlapping PCR。Figure 5. Procedures for generation of a sgRNA expression cassette containing a target sequence by overlapping PCR. The chimeric primers with target sequence strands are given in Table S2. The first PCR can be carried out in two separated reac

23、tions with U-F/U#T#- and gRT#+/gR-R primer pair, respectively, or in one reaction with the all 4 primers. U# in the primer names indicates a given promoter, and T#+ and T#- indicate forward and reverse strands of a target sequence, respectively.4.4靶標gRNA表達盒排列和擴增引物使用方法本系統(tǒng)目前使用水稻來源的4個small nuclear RNA啟

24、動子的表達水平為OsU6a>OsU6b >OsU6c > OsU3a。但打靶成功效率好像與sgRNA的表達水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性(即在水稻sgRNA水平不是限制性因素)。當連接靶點多于4個時，為了降低相同啟動子序列在農(nóng)桿菌發(fā)生同源重組的可能性，使相同啟動子間的距離盡量近（2個相鄰的同向重復(fù)序列間能夠發(fā)生同源配對的堿基對數(shù)少于該重復(fù)序列長度的1/2）。因此建議U3、U6ac啟動子的使用和排列方式為：1個靶點：LacZ-U6a2個靶點：LacZ-U6aU6b3個靶點：LacZ-U6aU6bU6c4個靶點：LacZ-U6aU6bU6cU35個靶點：LacZ-U6aU6aU6bU6cU

25、36個靶點：LacZ-U6aU6aU6bU6bU6cU37個靶點：LacZ-U6aU6aU6bU6bU6cU6cU38個靶點：LacZ-U6aU6aU6bU6bU6cU6cU3U3注：由于靶點接頭5端4個堿基形成的粘性末端是根據(jù)使用的不同啟動子而不同，要注意其對應(yīng)關(guān)系。sgRNA表達盒特定位置引物對的使用方法(T1，T2為靶序列；U#為各啟動子)：1 cassette: Pps-GGL/Pgs-GGR; 擴增相應(yīng)的U#-T1-gRNA2 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GGR;擴增相應(yīng)的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;3 casse

26、ttes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GGR; 擴增相應(yīng)的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA;4 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GG4, Pps-GG4/Pgs-GGR; 擴增相應(yīng)的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA5個或以上靶點：如此類推。4.5靶標sgRNA表達盒與pYLCRISPR/Cas9載體的連接方法本載體系統(tǒng)可采用Golden Gate clo

27、ning (Engler et al., 2008; 2009), Gibson assembly方法(Gibson, et al., 2009, 2010) 2種策略組裝Cas9載體和多個gRNA表達盒片段。Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的識別位點和切割位點不重疊的特性，可以設(shè)計出多種不同的且非回文結(jié)構(gòu)的粘性末端（256-16=240種，減去的16種是回文結(jié)構(gòu)；第6-7頁的PCR擴增引物使用了16種）。多個要連接的片段在連接點具有特異的互補末端可以連接（如圖6, 4個表達盒為例)，而非連接點的末端之間不互補

28、不能連接（相同末端分子間也不互補不能連接），因此連接反應(yīng)是向著目標單方向進行，效率很高。由于OsU6a-LacZ (AtU3b-LacZ) 附有LacZ標記基因(198 bp)，可在含有X-gal的培養(yǎng)基產(chǎn)生藍色菌斑篩選陽性克隆。Figure 6. Generation of a 4-target construct by Golden Gate cloning注：由引物Pps-GGL導(dǎo)入載體的唯一Spe I位點是特別留的一個“后門”。其用途是，在構(gòu)建好一組目的靶點sgRNA表達盒的載體的基礎(chǔ)上，如果情況需要再添加第二組其它靶點sgRNA表達盒，可以用Spe I將載體切成線狀，再用Gibson

29、 Assembly將第二組靶點sgRNA表達盒克隆進去。如果連接較多（4個或以上）的sgRNA表達盒的效率低（轉(zhuǎn)化不能獲得陽性克?。?，就以連接產(chǎn)物為模板，以引物PB-L/PB-R (見Table S1)擴增出連接的多個表達盒，再次與pYLCRISPR/Cas9載體酶切連接。5. 載體構(gòu)建操作方法：Figure 7. Workflow for preparation of multi-target CRISPR/Cas9 constructs（1）菌種活化和質(zhì)粒提取制備：將pYLCRISPR/Cas9菌種(TOP10F)和CRISPR/sgRNA vectors菌種(DH10B)分別在含有卡那霉

30、素（25 g/ml）和氨芐青霉素（50g/ml）平板培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)過夜，挑取單菌落培養(yǎng)1ml種子液，再擴大培養(yǎng)用于提取質(zhì)粒。用2-3U Bsa I試切150ng質(zhì)粒(10l反應(yīng))，電泳檢查是否切出690bp的ccdB條帶（未切的80ng質(zhì)粒為對照）。注：不要將保存的菌種直接接種！關(guān)鍵點：pYLCRISPR/Cas9載體較大（約1516.5 kb），拷貝數(shù)較低（pBR322復(fù)制子），用質(zhì)粒小型柱提取純化的回收率較低，因此最好用適合于較大質(zhì)粒提取的大柱純化試劑盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取純化（由于溶出的質(zhì)粒DNA可能含有殘留的洗液成分即乙醇，且體

31、積大濃度低，最好再做一次標準的乙醇沉淀操作以去除殘留乙醇和減少DNA溶液體積），或用普通堿裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（約0.5mg/l）保存。取部分質(zhì)粒稀釋成約100 ng/l冷凍保存，作為步驟（10）使用。關(guān)鍵點：由于接下來要用到的Bsa I是很容易失活的酶，有時新買的Bsa I也是失活的！在進行以下步驟之前，先檢測Bsa I活性：配制10 l Bsa I反應(yīng)液，含有5 U Bsa I, 100 ng pYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的質(zhì)粒)。37反應(yīng)15min后電泳檢查，以未切的相同質(zhì)粒為對照。pYLgRNA-U#的Bsa I圖譜見Figure 3。

32、為了盡可能保持酶活性，最好把Bsa I分裝成幾管冷凍保存。NEB公司的Bsa I-HF經(jīng)過修飾以降低星活性，推薦使用NEB Bsa I-HF和配套的CutSmart Buffer。l sgRNA表達盒構(gòu)建方法1:（2）靶點接頭制備：將接頭引物TE溶解成100 M母液，各取1 l加入到98 l 0.5x TE混合稀釋到1 M。約90 30 s，移至室溫冷卻完成退火。（3）sgRNA載體酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ等質(zhì)粒各1 g，在25 l反應(yīng)用10 U Bsa I酶切20min，冷凍保存。關(guān)鍵點：不要用太多酶和太長時間過度酶切?。?）sgRNA表達盒連接反應(yīng)：酶切過的pYLgRNA

33、-OsU3/LacZ等質(zhì)粒與各所對應(yīng)接頭連接反應(yīng)：成分加入量終濃度(量)10×T4 DNA ligase Buffer1 l1×pYLsgRNA-U#質(zhì)粒0.5 l1020 ng接頭0.5l0.05 MT4 DNA ligase(Takara)0.05 l18 UddH2O補足到 10 l室溫（20-28）連接約10-15 min關(guān)鍵點：過多DNA ligase和過長時間連接會產(chǎn)生較多第6頁所述產(chǎn)物IV &V。注：不同公司的T4 DNA ligase單位的定義和標定單位不同，如Takara的350U/l，NEB的400 U/l，但絕對活性單位/l都接近，即每1015

34、 l反應(yīng)大致使用0.050.1 l酶。上述步驟（3），（4）酶切和連接二步反應(yīng)可用一步酶切-連接反應(yīng)（邊切邊連法）替代：配制10 l 1x Bsa I酶切連接（Restriction-ligation）反應(yīng)液：在1x Bsa I-酶切Buffer中加入ATP至終濃度0.51.0 mM（此buffer對Bsa I和ligase都有效），加入約1020 ng pYLgRNA-U#質(zhì)粒（預(yù)先配好20 ng/l保存），0.5 l接頭（最終濃度0.05 M），35 U Bsa I，15 U T4 DNA ligase。如果實驗室沒有ATP，在1x內(nèi)切酶Buffer中加入0.5-1.0 l 10 x NE

35、B T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此優(yōu)先用NEB的）。注意：沒有加內(nèi)切酶buffer而單純加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不適合Bsa I酶切！）。用變溫循環(huán)儀（或PCR儀）循環(huán)反應(yīng)5循環(huán)：37 5 min，20 5 min。（5）第一輪擴增：每個sgRNA表達盒分為2個PCR反應(yīng)，各15 l反應(yīng)體系：取0.5 l連接產(chǎn)物為模板，使用第6頁引物U-F/接頭反向引物（反應(yīng)1），

36、和接頭正向引物/gR-R（反應(yīng)2），各0.2M,適量高保真PCR酶。25-28循環(huán)：94 10s，60 15s ，68 20 s。(任意) 取4 l電泳檢查（反應(yīng)2產(chǎn)物長度約140 bp，用2%瓊脂糖膠）。如果擴增產(chǎn)物較弱，也可以繼續(xù)第二輪PCR。注：雖然用第二輪PCR的位置特異引物直接從連接產(chǎn)物也可以擴增出目標產(chǎn)物，但用2輪PCR擴增可以更穩(wěn)定地得到特異性目標產(chǎn)物且能避免空載產(chǎn)物擴增，見Figure 4。關(guān)鍵點：最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性價比高，或KOD FX。不要使用能在產(chǎn)物3附加A堿基的DNA聚合酶，此A堿基使產(chǎn)物在第二輪PCR中不與互補鏈配對而不能延伸補

37、平）。（6）第二輪PCR：按附錄1通用引物所述，預(yù)先將位置特異引物對混合成10×工作液，每種1.5 M：引物組合1個靶點：PT1R；2個靶點：PT1，PT2R；3個靶點：PT1，PT2，PT3R;4個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4R;5個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5R;6個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6R；7個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7R；8個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，PT8R取第一輪PCR產(chǎn)物1 l用H2O稀釋10倍，各取1 l混合為模板。各表達盒20-50 l PCR

38、 (1個靶點50 l； 2-3個靶點各30 l；4個或以上靶點各20 l)。加入1/10量每種引物組合工作液（最終濃度0.15 M）。使用適量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。擴增17-20循環(huán)(實際情況調(diào)整)：95 10s，58 15s，68 20 s。取2 -3 l電泳檢查產(chǎn)物長度是否符合（注1），并估計樣品的大致濃度。注1：各種啟動子gRNA表達盒的長度為（括號為Bsa I切后）：單子葉表達盒PCR擴增產(chǎn)物長度（bp）BsaI酶切后長長度（bp）雙子葉表達盒PCR擴增產(chǎn)物長度（bp）BsaI酶切后長度（bp）LacZ-OsU6a-gRNA831801LacZ-AtU3d-gRNA48

39、6456OsU6a-gRNA629599AtU3d-gRNA284254OsU6b-gRNA515485LacZ-AtU3b-gRNA709679OsU6b-gRNA924894AtU3b-gRNA507477LacZ-OsU3-gRNA766736AtU6-1-gRNA487457OsU3-gRNA603573AtU6-29-gRNA502472（7）根據(jù)各樣品產(chǎn)物估算的量，把所有產(chǎn)物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR產(chǎn)物純化kit純化。關(guān)鍵點：此步驟是為了除去DNA聚合酶，以防止下面步驟Bsa I酶切產(chǎn)生的粘性末端被補平。l sgRNA表達盒構(gòu)建方法2 (Overlapping PCR

40、):（8）取2-5 ng pYLgRNA-OsU#質(zhì)粒為模板，在一個反應(yīng)中使用4種引物：U-F和gRT#+ 各0.2 M，U#T#-和gRT#+（Table S1）各0.1 M。25-28 循環(huán)：94 10s，58 15s ，68 20 s。 在擴增過程中，開頭的若干循環(huán)時U-F/U#T#-擴出U#-T#序列，gR-R/gRT#+擴出T#-sgRNA序列。后期的循環(huán)中通過overlapping PCR產(chǎn)生2個片段合并的sgRNA表達盒片段。(9) 取第一輪PCR產(chǎn)物1l用H2O稀釋10倍，取1 l為模板，按以上步驟（6）進行第二輪PCR。l 組裝sgRNA表達盒到pYLCRISPR/Cas9載

41、體 (策略I, Golden Gate cloning)：(10) 雙元載體與sgRNA表達盒的酶切-連接反應(yīng)試劑加入量（l）終濃度10×CutSmart Buffer1.51×10 mM ATP1.51 mMpYLCRISPR/Cas9質(zhì)粒60-80 ng4-6 ng/lsgRNA表達盒混合物每表達盒10-15 ng Bsa I-HF10 U0.1-0.2 U/lT4 DNA ligaseH2O35 U最終15l2-3 U/l注：每個靶點約10-15 ng (如1個靶點約10 ng、 2個靶點共20-30 ng、 3個共約40-50 ng、 4個共約60-70 ng、更多

42、靶點時每個片段的量適當增加（最多15 ng/片段）。這樣載體與每種插入片段摩爾比=1: 4-6。用變溫循環(huán)進行酶切連接約10-15循環(huán): 375 min；105 min，20 5 min；最后375 min。此方法簡便效率高，陽性克隆率高，推薦優(yōu)先使用。冷凍保存未用完的連接產(chǎn)物，有必要時做下一步擴增用。注：也可以用常規(guī)的先切后連法（供參考）：取約2-3 g pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在50 l（30U BsaI）酶切30 min, 用低熔點膠電泳回收酶切的質(zhì)粒片段（去除ccdB片段）（不要用太多酶或太長時間過度酶切）。用0.5x TE洗回收膠30分鐘，65 3 min熔解，在

43、40 加入Agarase（1U/100l膠， NEB)處理30分鐘后，分裝成每管40-60 ng（2-3 l）冷凍保存公用（一管做一次連接，以避免多次凍融）。在切好分裝（步驟2）的pYLCRISPR/Cas9 (約60-80ng）管中，加入已用Bsa I酶切好的PCR產(chǎn)物（每個靶點約10-15 ng），在10 l 連接反應(yīng)（加35 U連接酶）， 16 （或最好用變溫循環(huán): 10 5min，20 5 min；10-15循環(huán)）連接2-3 h（不要過長時間連接）。l 連接效率低的補救方法：（11） 如果連接較多（4個或以上）的sgRNA表達盒的效率低,即連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后不能獲得陽性克隆，就用步驟（

44、10）的0.2-0.5 l連接產(chǎn)物為模板(直接轉(zhuǎn)化得不到陽性克隆的連接產(chǎn)物也可以作為擴增模板，因為很少的連接分子就足夠被擴增了)，以Table S1的引物PB-L/PB-R擴增（40 l，用KOD FX）(如果使用舊說明書的位置特異引物，PB-L/PB-R要改為PB-Lo/PB-Ro (見Table S1說明)。為提高擴增特異性，用熱啟動：先不加引物，在反應(yīng)溫度達到80度以上時介入引物（最終0.2 M）。10循環(huán)：97°C 10 s; 60°C 20 s; 68°C 3-5 min (延伸時間按40 s/1 sgRNA或 1 min/1kb) ;再15循環(huán)（循環(huán)數(shù)

45、可調(diào)整）：97°C 10 s; 68°C 3-5 min。電泳回收目標片段（擴增產(chǎn)物可能會有非特異小片段）。取約20-30ng產(chǎn)物與50-60 pYLCRISPR/Cas9按以上步驟（10）再酶切與連接。注：PB-L/PB-R位于雙元載體與sgRNA表達盒的連接點(Figure 4)。（12）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化（電激法）：將連接產(chǎn)物滴載在懸浮式透析膜Millipore VSWP04700（0.025 m孔徑）對0.2 x TE透析1530 min（最好在4冷柜內(nèi)）透析脫鹽（注1）。取1-1.5 l連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化E. coli DH10B感受態(tài)細胞（注2），電激后加入1 ml S

46、OC，37培養(yǎng)1-1.5 h。涂板培養(yǎng)基為LB+ 25 g/ml Kan, 0.30.5 mM IPTG(注3)，適量X-gal。IPTG誘導(dǎo)沒有徹底切除ccdBs的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的ccdBs表達致死。而含有目標插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表達盒）的陽性克隆由LacZs表達產(chǎn)生藍色菌斑（注4）。注1：或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，風干溶在5 l 去離子水。注2：化學(xué)熱激法轉(zhuǎn)化也可以獲得陽性克隆，但效率較低。因此，有電激儀的實驗室應(yīng)該使用電激法。雖然其它菌株也可以用，但DH10B更適合高效率電激轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒。電激轉(zhuǎn)化感受體態(tài)細胞制備最好用SOB培養(yǎng)（不要用LB培養(yǎng)），以10 pg pUC1

47、8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化測試轉(zhuǎn)化效率（小質(zhì)粒用電激電壓1800 V/20l感受態(tài)細胞/1l電激杯），要求達到效率>109 colonies/1g pUC18(即電激10 pg質(zhì)粒，涂1/20 轉(zhuǎn)化細胞出500以上菌斑)。>15kb大質(zhì)粒的電激電壓為1500-1600 V/20l感受態(tài)細胞/1l電激杯（或2500V/40l感受態(tài)細胞/2l電激杯）；注3：使用Lac Iq基因型菌種用1.0 mM注4：注意：白色且生長大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破壞平端連接的空載克隆，或ccdBs功能突變（有約1/1000頻率發(fā)生）但未切除ccdB的空載克隆。（13）提取質(zhì)粒，Mlu I酶切電泳檢測sgRN

48、A表達盒連接片段。如果Mlu I酶切帶型有疑問，用Asc I酶切確認。（如果做以下步驟測序，可不做這個PCR檢測）取少量（13ng）質(zhì)粒為模板對所有靶點進行PCR檢測(也用空載質(zhì)粒做陰性對照)。引物配對形式為：SP-DL引物與第一靶點接頭反向引物配對；第一靶點接頭正向引物與第二靶點反向接頭引物配對；第二靶點正向接頭引物與第三靶點接頭反向引物配對；第三靶點接頭正向引物與第四靶點反向接頭引物配對；如此類推，最后靶點正向接頭引物與SP-R引物配對。這樣每個靶點的正反方向都檢測過一次。電泳確認其大小是否符合預(yù)期。（14）測序檢測(如果步驟13確認了，可以不做此測序)：利用各靶點引物的特異性，按下圖方式

49、對特定靶點進行測序。Figure 8. Strategy for sequencing of the linked sgRNA expression cassettes注：最好提醒測序公司，這是中低拷貝的較大質(zhì)粒，以便公司采取相應(yīng)措施。注：由于OsU6c比較長（742bp），用前一個靶點正向引物不一定能測通OsU6c到靶序列（T#），如果OsU6c是最后一個表達盒，要用SP-R (見第2頁)進行測序；如果U6c不是最后一個表達盒，用其后面的靶點反向引物測。（15）導(dǎo)入農(nóng)桿菌。獲得的克隆電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（EHA105）。在農(nóng)桿菌的穩(wěn)定性檢測（可以不做）：從農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒（農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒質(zhì)量較差，只

50、適合做PCR），取約2-5ng質(zhì)粒為模板再用所有靶點接頭正向引物和反向引物配對進行PCR確認?？蛇x步驟：或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10B，再挑取單克隆培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒酶切分析。(16) 獲得的陽性農(nóng)桿菌可用于侵染植物組織。(17) 獲得轉(zhuǎn)基因T0植株的打靶效果檢測：打靶成功的轉(zhuǎn)化體往往在靶點產(chǎn)生單堿基插入或者缺失若干堿基。以靶點為中心，在兩側(cè)各離開約200-300 bp處合成引物PCR擴增。關(guān)鍵點：在靶點上游約150-250bp處設(shè)計內(nèi)部引物為測序引物（這個距離的測序質(zhì)量最好，但不要少于100bp和不要大于400bp），對PCR產(chǎn)物直接測序（不要用PCR擴增使用過的引物再次用作測序，會產(chǎn)生高水平雜信號）

51、。如果從某個堿基以后全部是重疊峰峰，表明是雜合突變或雙等位突變，可按基于Ma et al., 2015 (Mol. Plant 2015, DOI: /10.1016/j.molp.2015.02.012)的DSD方法的Web程序DSDecode（注1：擬南芥T1代有相當多嵌合突變和雜合突變，后代分離可能不符合孟德爾分離比，還會出現(xiàn)新的突變。附錄1 本附錄列出了使用本載體系統(tǒng)所必需的部分材料。其它常規(guī)分子克隆需要的材料沒有列出。菌種：大腸桿菌Top10F，用于pYLCRISPR/Cas9系列載體的繁殖，如果我們已經(jīng)提供了含有質(zhì)粒的菌種，則不需要準備。大腸桿菌DH

52、10B或DH5a或其他常用克隆用菌種，用于克隆載體；農(nóng)桿菌EHA105或者其他農(nóng)桿菌，用于轉(zhuǎn)化水稻，擬南芥等植物；酶：BsaI-HF (NEB, cat. no. R3535);Mlu I (TAKARA, cat. no. D1071);KOD Plus (TOYOBO, cat. no. KOD-201); KOD FX (TOYOBO, cat. no. KFX-101);Golden Gate克隆通用引物：Table S1. Primers used for Golden Gate cloning of sgRNA expression cassettes. PositionPrime

53、rSequence (5-3)1st PCRU-FCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGgR-RCGGAGGAAAATTCCATCCAC2nd PCRSite B-LSite 2Pps-GGLTTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG2AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTCSite 2Site 3Pps-GG2TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG3AGCGTGggtctcGtcttcacTCCATCCACTCCAAGCTCSite 3Site 4P

54、ps-GG3TTCAGAggtctcTaagacttTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG4AGCGTGggtctcGagtccttTCCATCCACTCCAAGCTCSite 4Site 5Pps-GG4TTCAGAggtctcTgactacaTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG5AGCGTGggtctcGgtccacaTCCATCCACTCCAAGCTCSite 5Site 6Pps-GG5TTCAGAggtctcTggactagTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG6AGCGTGggtctcGcagatagTCCATCCACTCCAAGCTCSite 6S

55、ite 7Pps-GG6TTCAGAggtctcTtctgcaaTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG7AGCGTGggtctcGacctcaaTCCATCCACTCCAAGCTCSite 7Site 8Pps-GG7TTCAGAggtctcTaggtttcTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG8AGCGTGggtctcGagcgttcTCCATCCACTCCAAGCTCSite 8Site B-RPps-GG8TTCAGAggtctcTcgctgatTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GGRAGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCA

56、AGCTCFlankingPrimers PB-LPB-RGCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTATGGGCGCGCggtctcTACCGACGCGTATCC（1）The Bsa I-cutting non-palindromic ends with the same color are compatible for ligation.（2）ACTAGTandACGCGTare Spe I and Mlu I sites, respectively.（3）If more sgRNA expression cassettes are needed, new primer sets can be designed with distinct Bsa I-cleaving sites. （4）Table S1的位置特異引物與舊說明書的引物相比，改了引物名并有少量修改。舊說明書的引物可以繼續(xù)使用，但如果要PCR擴增連接產(chǎn)物，PB-L/PB-R要改為：PB-Lo: GGCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTG-3； PB-Ro: