食品微生物檢測(cè)方法

1、食品微生物檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品微生物檢測(cè)方法1 菌落總數(shù)1.1 培養(yǎng)基和試劑、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按GB/T4789.28-2003中4.7規(guī)定成分: 蛋白胨 10克、牛肉膏3克、氯化鈉5克、瓊脂1520克 、蒸餾水 1000ml制法： 將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入瓊脂,加熱煮沸,使用權(quán)瓊脂溶化.分裝燒訌,121高壓滅菌15分鐘.注:此培養(yǎng)基可供一般細(xì)菌培養(yǎng)之用,注平板或制成斜面.如用于菌落計(jì)數(shù),瓊脂量為1.5%;如作成平板或斜面,則應(yīng)為2%. 磷酸鹽緩沖液:按GB/T4789.28-2003中3.22規(guī)定.成分： 磷酸二氫

2、鉀 34克、1mol/l氫氧化鈉溶液175ml、蒸餾水825ml 、PH7.2制法: 先將磷酸鹽溶解于500ml蒸餾水中,用1mol/l氫氧化鈉溶液校正PH后,再用蒸餾水稀釋至1000 ml.稀釋液: 取儲(chǔ)存液1.25 ml ,用蒸餾水稀釋至1000 ml,或每管10ml,121高壓滅菌15分鐘. 明膠磷酸鹽緩沖液成分:明膠 2克、磷酸氫二鈉 4克、蒸餾水 1000ml、PH6.2制法:加熱溶解,校正PH,121高壓滅菌15分鐘. 0.85%滅菌生理鹽水 75%乙醇1.2 設(shè)備和材料 冰箱：04 恒溫培養(yǎng)箱36±1 恒溫水浴鍋46±1 均質(zhì)器或滅菌乳缽 架盤藥物天平：050

3、0克，精確至0.5克. 菌落計(jì)數(shù)器. 大鏡4× 滅菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度) 滅菌錐形瓶:500ml 滅菌玻璃珠:直徑約5mm 滅菌培養(yǎng)皿直徑約90mm 滅菌試管16mm×160mm 滅菌刀、剪子、鑷子等。1.3 檢驗(yàn)程序（ 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1） 1.4 操作步驟 檢樣稀釋及培養(yǎng)a. 以無菌操作將檢樣25克(ml)剪碎放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中以8000r/min10000r/mi

4、n的速度處理1min,做成1：10的均勻稀釋液。b. 用1ml的滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)（注意吸管不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。c. 另取1ml滅菌吸管，按上條操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml吸管。d. 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。e. 吸稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可放置46±1水浴

5、鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15ml 并轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對(duì)照。f. 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h. 菌落計(jì)數(shù)方法做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告a. 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余

6、一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時(shí)（菌落間無明顯界線），若僅有一條鏈?？梢暈橐粋€(gè)菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。b. 稀釋度的選擇1. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乖以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例1）。2. 若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字，（見表1中例2及例3）。3. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以箕釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例4）。4. 若所有稀釋度的

7、平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋找最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例5）。5. 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例6）。6. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例7）。c. 菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后在的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示（見表1）。表1稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g）

8、報(bào)告方式（cfu/g(ml)）10-110-210-31多不可計(jì)1642016400160002多不可計(jì)29546.637750380003多不可計(jì)271602.227100270004多不可計(jì)多不可計(jì)3133130003100005271152702706000<1×10<107多不可計(jì)3051230500310002 大腸菌群的檢測(cè)2.1 大腸菌群的測(cè)定2.1.1 設(shè)備和材料恒溫培養(yǎng)箱：36±1。冰箱：04。恒溫水浴鍋：44.5±0.5。架盤藥物天平:0500g,精確至0.5g。顯微鏡10×100×。均質(zhì)器或乳缽。平皿：直徑為9

9、0mm。試管16mm× 160mm。吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL。玻璃珠：直徑約5mm。載玻片。酒精燈。試管架。 滅菌刀、剪子、鑷子2.1.2 培養(yǎng)基和試劑 乳糖膽鹽發(fā)酵管：成分：蛋白胨：20g 豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）：5g 乳糖：10g 0.04%溴甲酚紫水溶液：25ml 蒸餾水：1000ml PH：7.4制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水，校正PH，加入指示劑，分裝每管10ml，并放入一個(gè)小倒管，115高壓滅菌15min. 注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。 伊紅美藍(lán)瓊脂平板成分：蛋白胨：10g 乳

10、糖：10g 磷酸氫二鉀：2g 瓊脂：17g 2%伊紅Y溶液：20 ml 0.65%美藍(lán)溶液：10 ml 蒸餾水：1000ml PH：7.1制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正ph，分裝于燒瓶內(nèi)，121高壓滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷卻至5055,加入伊紅和閏藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。 乳糖發(fā)酵管成分：蛋白胨：20g 乳糖：10g 0.04%溴甲酚紫水溶液：25ml 蒸餾水：1000ml Ph：7.4制法：將蛋白胨及乳糖溶于水中，校正ph，加入指示劑，按檢驗(yàn)要求分裝30ml、10ml、或3ml ,并放入一個(gè)小倒管，115高壓滅菌15min。注1：雙料乳糖發(fā)酵管除

11、蒸餾水外，其他成分加倍。注2：30ml和10ml乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗(yàn)用,3ml乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。 EC肉湯成分：胰蛋白胨：20g 3號(hào)膽鹽（或混合膽鹽）：1.5g 乳糖：5g 磷酸氫二鉀：4g 磷酸二氫鉀：1.5g 氯化鈉：5g 蒸餾水：1000ml 制法：將上述成分混合，溶解后，分裝有發(fā)酵倒管的試管中，121 高壓滅菌15min，最終ph為6.9±0.2. 磷酸鹽緩沖液成分：磷酸二氫鉀：34g1mol/l氫氧化鈉溶液：175 ml蒸餾水：825mlPH：7.2制法：先將磷酸溶解于500ml蒸餾水中，用1mol/l氫氧化鈉溶液校正PH后，再用蒸餾水稀釋至1000

12、ml.稀釋液 取儲(chǔ)存液1.25ml，用蒸餾水稀釋至1000ml,分裝每瓶100ml或每管10ml，121；高壓滅菌15min。0.85%滅菌生理鹽水 革蘭氏染色液成分：結(jié)晶紫：1g95%乙醇：20ml 1%草酸銨水溶液：80ml 將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液法混合革蘭氏碘液成分：碘：1g 碘化鉀：2g蒸餾水：300ml將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml沙黃復(fù)染液成分：沙黃：0.25g95%乙醇;10ml 蒸餾水：90ml將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。染色法：a 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水先。b 滴加

13、革蘭氏碘液，作用1min，水洗。c 滴加95%乙醇脫色，約 30S；或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾無能為力，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s.d 水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗 ，待干，鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。注：亦可用 1：10稀釋石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時(shí)間公需10s.2.1.3 操作步驟2.1.3.1 檢樣稀釋a以無菌操作將檢樣25mL(或g)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成110的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8 00010000r/min的速度處理1min

14、，做成110的均勻稀釋液。b用1mL滅菌吸管吸取110稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1100的稀釋液。c另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。 d根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。2.1.3.2乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌

15、群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。2.1.3.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。2.1.3.4證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。2.1.3.5報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。見附錄A。2.1.4 糞大腸菌群(faecal colifor

16、m)2.1.4.1用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物(見7.2條)轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置44.5±0.2水浴箱內(nèi)(水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面)，培養(yǎng)24±2h，經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1培養(yǎng)1824h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。2.1.4.2結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。2.3 霉菌和酵母菌2.3.1 培養(yǎng)基和試劑 滅菌蒸餾水 虎紅(孟加拉紅)培養(yǎng)基 成分： 蛋白

17、胨 5g 葡萄糖 10g 磷酸二氫鉀 1g 硫酸鎂(含7H2O) 0.5g 瓊脂 20g 1/3000虎紅溶液 100mL (四氯四碘熒光素) 蒸餾水 1000mL 氯霉素 100mg 制法： 將上述前5種成分加入蒸餾水中溶解后，再加入虎紅溶液。分裝后，103.43kPa，20min高壓滅菌。另用少量乙醇溶解氯霉素，過濾除菌后，加入培養(yǎng)基中，若無氯霉素，可用鏈霉素代替，每1000mL培養(yǎng)基加鏈霉素30mg。馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，附加抗菌素馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)成分：馬鈴薯(去皮切塊)300g 葡萄糖20g 瓊脂20g 蒸餾水1000mL制法:將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸

18、1020min。用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1000mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。2.3.2 儀器 冰箱：04 恒溫培養(yǎng)箱25-28 恒溫振蕩器 顯微鏡:10×100× 架盤藥物天平：0500克，精確至0.5克. 菌落計(jì)數(shù)器. 大鏡4× 滅菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度) 滅菌具塞錐形瓶:300ml 滅菌廣口瓶:500ML 滅菌培養(yǎng)皿直徑約90mm 滅菌試管16mm×160mm 滅菌刀、金屬勺等。 載玻片、蓋玻片、 滅菌牛皮紙袋、塑料袋2.3.3 操作步驟 以無菌操作取檢樣25克（ML），

19、放放含有225ML滅菌水的具玻塞錐形瓶中，振搖30分鐘，即為1：10稀釋液。 用滅菌吸管吸取1：10稀釋液10ML，注入滅菌試管中，另1ML滅菌吸管反復(fù)吸取款50次，使霉菌孢子充爭散開。 用1ml的滅菌吸管吸取1：10的稀釋液注入含有9ml滅菌水的試管內(nèi)，另取一支取1ML滅菌吸管吹吸五次，此液為1：100的稀釋液。 按上述操作順序做工10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1ML滅菌吸管，根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時(shí)，吸取1ML稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做二個(gè)平皿，然后將晾置45度左右的培養(yǎng)基注入平皿中，并轉(zhuǎn)動(dòng)使之與樣液混勻，待瓊脂凝固后，倒置于2

20、528度的溫箱中，三天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察五天。 計(jì)算方法：通常選擇菌落數(shù)在10150之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，同稀釋度的兩個(gè)平皿的菌落數(shù)平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌。稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式可參考GB/T4789。2 報(bào)告：每克（或亳升）食品所含霉菌和酵母菌數(shù)以cfu/g（ml）計(jì)。2.4 沙門氏菌檢測(cè)方法2.4.1 前增菌和增菌 以無菌操作取25g（ml）樣品，加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣口瓶內(nèi)。固體產(chǎn)品先用乳缽加滅菌砂磨碎，于36±1培養(yǎng)4h，移植10ml轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液內(nèi)，于42培養(yǎng)18h-24h。同時(shí)，另取10ml轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36±1培養(yǎng)18h-24h。2.4.2 分離 取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂平板和一個(gè)DHL瓊脂平板（或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板），兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于36±1分別培養(yǎng)18h-24h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落，如發(fā)現(xiàn)疑似沙門桿菌的送權(quán)威質(zhì)檢部門測(cè)定。2.5 志賀氏菌檢測(cè)方法2.5.1 增菌以無菌操作取25g（ml）樣品，加在裝有225mlGN增菌液的廣口瓶內(nèi)。固體產(chǎn)品先用乳缽加滅