實驗植物DNA提取及檢測經典實用

1、實驗 植物dna提取及檢測植物基因組 dna的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗 植物dna提取及檢測一一 、實驗目的、實驗目的 學習提取和純化高等植物總學習提取和純化高等植物總dna的方法，理解其原理。的方法，理解其原理。實驗 植物dna提取及檢測n脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(dna)(dna)、核糖核酸、核糖核酸(rna)(rna) n與蛋白質結合在一起以核蛋白（與蛋白質結合在一起以核蛋白（dnpdnp）的形式存在。）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋白釋放出來。白釋放出來。n植物總植物總dnadna包括細胞核包括細胞核dnadna和細胞

2、核外和細胞核外dna,dna,前者存前者存在于細胞核內，后者存在于細胞質中有半自主性在于細胞核內，后者存在于細胞質中有半自主性復制活性的細胞器內，例如線粒體復制活性的細胞器內，例如線粒體dna(mtdna)dna(mtdna)和和葉綠體葉綠體dna(ctdna)dna(ctdna)。二、實驗原理二、實驗原理實驗 植物dna提取及檢測細胞破碎細胞破碎 抽提去蛋白質抽提去蛋白質 沉淀核酸沉淀核酸基本過程基本過程實驗 植物dna提取及檢測 機械方法：機械方法： 超聲波處理法、超聲波處理法、研磨法、研磨法、勻漿法；勻漿法； 化學試劑法：化學試劑法：用用sdssds處理細胞；處理細胞； 酶解法：酶解法：

3、 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。 細胞破碎細胞破碎 實驗 植物dna提取及檢測usdssds法法 sdssds是有效的陰離子去垢劑是有效的陰離子去垢劑, , 細胞中細胞中dnadna與蛋與蛋白質之間白質之間 常借靜電引力或配位鍵結合常借靜電引力或配位鍵結合, , sdssds能夠能夠破壞這種價鍵。破壞這種價鍵。uctabctab法法 ctabctab是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的與脂膜，使細胞中的dna-dna-蛋白質復合物釋放出來，蛋白質復合物釋放出來，并使蛋白質變性，使并使蛋白質變性，使dnadna與蛋白

4、質分離。與蛋白質分離。dnadna提取提取實驗 植物dna提取及檢測u 蛋白質蛋白質 常用苯酚：氯仿：異戊醇（常用苯酚：氯仿：異戊醇（2525：2424：1 1）或氯仿：異戊醇（或氯仿：異戊醇（2424：1 1）抽提）抽提。u rna rna 常選用常選用rnasernase消化消化 ，或是用，或是用licllicl來消除大來消除大分子的分子的rnarna。u 酚類物質酚類物質 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。的材料。dnadna純化（去雜質）純化（去雜質）實驗 植物dna提取及檢測實驗材料實驗材料植物葉片植物葉片( (去葉脈去葉脈) )試劑試劑 2 2

5、ctabctab抽提液（抽提液（ctabctab、tris-hcltris-hcl、edtaedta、naclnacl）te te 緩沖液緩沖液(ph=8.0) (ph=8.0) 氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇(24:1)(24:1)巰基乙醇巰基乙醇異丙醇異丙醇70%70%乙醇乙醇 三、材料與試劑三、材料與試劑實驗 植物dna提取及檢測離心機離心機 水浴鍋水浴鍋研缽研缽 微量移液器微量移液器儀器用具儀器用具實驗 植物dna提取及檢測移液器量程的選擇移液器量程的選擇實驗 植物dna提取及檢測1取取 2g 清洗涼干的植物幼嫩葉片于研缽中，加清洗涼干的植物幼嫩葉片于研缽中，加 入液氮，迅速研磨。入液氮，迅

6、速研磨。將將2ctab抽提液與抽提液與2ml巰基乙醇在提取前混合后于巰基乙醇在提取前混合后于65水浴中水浴中加熱加熱30分鐘。分鐘。2將將 0.5ml 研磨液轉入研磨液轉入 1.5ml 離心管中，加入離心管中，加入1ml ctab提取液，提取液，置于置于65水浴中保溫水浴中保溫 30min，其間顛倒混勻，其間顛倒混勻23次。次。破碎細胞破碎細胞3. 加入等體積氯仿：異戊醇（加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻）混合液，充分顛倒混勻20分鐘，分鐘，防止成團。防止成團。8000r/min，離心，離心 5min，取上清。，取上清。抽提去蛋白抽提去蛋白4將上清液移入新的將上清液移入新

7、的1.5ml離心管內，加離心管內，加 等體積異丙醇（預冷）。等體積異丙醇（預冷）。顛倒混勻，可見顛倒混勻，可見 dna 絮狀沉淀。絮狀沉淀。沉淀核酸沉淀核酸58000r/min，離心，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。 將沉將沉淀回溶于無菌水或淀回溶于無菌水或 te 緩沖液待測。緩沖液待測。四、操作步驟四、操作步驟實驗 植物dna提取及檢測1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與 ctab 抽提液充分抽提液充分混勻；混勻；2)若提取產物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質，添加巰基若提取產物有顏

8、色，可能是材料中含有較多的多酚類物質，添加巰基乙醇（乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集）收集 ctab 與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。核酸降解酶類的降解。五、注意事項五、注意事項實驗 植物dna提取及檢測六、作業(yè)六、作業(yè) 為了獲

9、得高質量的植物總為了獲得高質量的植物總dna，在分離，在分離提取過程中應注意那些問題？提取過程中應注意那些問題？實驗 植物dna提取及檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測dna一、實驗一、實驗目的目的 學習瓊脂糖凝膠電泳檢測學習瓊脂糖凝膠電泳檢測dna的方法和技術。的方法和技術。實驗 植物dna提取及檢測dnadna分子在高于等電分子在高于等電點的點的phph溶液中帶負溶液中帶負電荷，在電場中向電荷，在電場中向正極移動。在一定正極移動。在一定電場強度下，電場強度下，dnadna分分子的遷移速度與相子的遷移速度與相對分子質量的對數(shù)對分子質量的對數(shù)成反比。成反比。二、實驗原理二、實驗原理實驗

10、植物dna提取及檢測瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。實驗 植物dna提取及檢測三、實驗儀器和試劑三、實驗儀器和試劑 儀器儀器 電泳儀電泳儀 電泳槽電泳槽 灌膠模具等灌膠模具等實驗 植物dna提取及檢測tris-硼酸（硼酸（tbe） tris-乙酸（乙酸（tae） tris-磷酸（磷酸（tpe）常用電泳緩沖液常用電泳緩沖液 實驗 植物dna提取及檢測電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400組成上樣緩沖液

11、。組成上樣緩沖液。 作用：作用：增加樣品比重，以確保增加樣品比重，以確保dnadna均勻沉入加樣孔內。均勻沉入加樣孔內。形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液上樣緩沖液實驗 植物dna提取及檢測溴化乙錠（溴化乙錠（ebeb） 是一種熒光染料，是一種熒光染料，ebeb分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與dnadna的含量成正的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品比。

12、據(jù)此可粗略估計樣品dnadna濃度。瓊脂糖凝膠濃度。瓊脂糖凝膠ebeb染色，肉眼可染色，肉眼可見核酸電泳帶，其見核酸電泳帶，其dnadna量一般量一般5ng5ng。 ebeb是致癌物質，切勿用手是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。接觸，更不要污染環(huán)境。goldviewtm: 是一種可代替溴化乙錠（是一種可代替溴化乙錠（ebeb）的新型核酸染料，采用瓊脂）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測糖電泳檢測dnadna時，時，goldviewtmgoldviewtm與核酸結合后能產生很強的熒光與核酸結合后能產生很強的熒光信號，其靈敏度與信號，其靈敏度與ebeb相當，使用方法與之完全相同。在紫外透相

13、當，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈射光下雙鏈dnadna呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈dnadna呈紅色熒光。呈紅色熒光。goldviewgoldview不僅能染不僅能染dnadna，也可用于染，也可用于染rnarna。 核酸染色劑核酸染色劑實驗 植物dna提取及檢測dnadna分子量標準分子量標準實驗 植物dna提取及檢測不同種類不同種類dna marker實驗 植物dna提取及檢測1.1.凝膠制備凝膠制備 制備制備1%1%瓊脂糖凝膠。稱取瓊脂糖凝膠。稱取0.8g0.8g瓊脂糖加入瓊脂糖加入 80ml 180ml 1taetae，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至，加熱至瓊脂糖

14、全部熔化，冷卻至50-60 50-60 時，加入時，加入 ebeb或或goldviewtmgoldviewtm 10ul10ul。緩慢倒入膠板，待膠。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。凝固后拔出梳子。2.2.加樣加樣 取取1515l dnal dna樣液與樣液與 2 2l l 上樣上樣 buffeer buffeer 混勻，混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。用微量移液器小心加入樣品槽。3.3.電泳電泳 接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓為為15v/cm15v/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）（長度以兩個電極之間的距離計算）, ,待溴酚待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。蘭移動到一定位置，停止電泳。4.4