熒光定量pcr原理ct值

1、熒光定量熒光定量pcr技術(shù)專題技術(shù)專題內(nèi)容概要內(nèi)容概要1 熒光定量熒光定量pcr的原理的原理1 熒光定量熒光定量pcr的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法1 熒光定量熒光定量pcr解析方法解析方法1 sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1tiangen公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南實時定量實時定量pcr技術(shù)：技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測pcr擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)與常規(guī) pcr技術(shù)比較：技術(shù)比較：對pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測熒光定量熒光定量pc

2、r原理原理定義定義+ 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線+ 熒光閾值熒光閾值+ ct值值熒光定量熒光定量pcr原理原理常用名詞概念常用名詞概念cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）baselinelogliner phaselogliner phase熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光定量熒光定量pcr原理原理擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）baselinelogliner phaselogliner phase1 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）1 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍1 手動設(shè)置：大于熒光背景值和

3、陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段1 真正的信號:熒光信號超過域值threshold熒光定量熒光定量pcr原理原理熒光域值熒光域值ct值的定義：值的定義： pcr擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)cycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）rn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）ct value 熒光定量熒光定量pcr原理原理ctct值值cycle numberck 104ck 102samplelog of dna concentration0 模板dna量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即ct值越小。0 log模板起始濃度與ct值呈線性關(guān)系。熒光定量熒光定量pcr原理原理ct

4、ct值與模板起始量的關(guān)系值與模板起始量的關(guān)系線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)no template controlno template control確認(rèn)確認(rèn)pcrpcr擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（e e）:0.8-1.2:0.8-1.235cycles35cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用如果采用sybrsybr檢測方法，檢測方法，30cycles30cycles內(nèi)內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35 cycles35 cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.

5、98熒光定量熒光定量pcr反應(yīng)性的確認(rèn)反應(yīng)性的確認(rèn). 定性分析研究：定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（snps）分析等. 絕對定量研究：絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量， gmo定量檢測等. 相對定量研究：相對定量研究：mrna表達(dá)量分析，sirna效果確認(rèn)，基因芯片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量熒光定量pcr技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用內(nèi)容概要內(nèi)容概要1 熒光定量熒光定量pcr的原理的原理1 熒光定量熒光定量pcr的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法1 熒光定量熒光定量pcr的解析方法的解析方法1 sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1 tiangen公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南公司

6、熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記 sybr green i特異性熒光標(biāo)記特異性熒光標(biāo)記 taqman probe常用熒光標(biāo)記方法常用熒光標(biāo)記方法sybr green i染料法染料法原理原理 sybr green i是一種結(jié)合于所有dsdna雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。sybr green i染料法染料法作用機(jī)理作用機(jī)理問題點：問題點： sybr green i與雙鏈與雙鏈dna進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如 果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將 同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果

7、不準(zhǔn)確。同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。sybr green i染料法染料法問題點與關(guān)鍵點問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：關(guān)鍵點： 設(shè)計合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！設(shè)計合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！原始圖譜原始圖譜對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜sybr green i染料法染料法融解曲線融解曲線融解曲線分析，單一峰融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光無非特異性熒光定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確光，因此定量不準(zhǔn)確sybr green i染料法染料法融解曲線融解曲線% 對對dna模板沒有選擇性模板沒有選擇性 適用于任何適用于任

8、何dna % 使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜 探針探針% 具有價格優(yōu)勢具有價格優(yōu)勢優(yōu)優(yōu) 點點% 容易與非特異性雙鏈容易與非特異性雙鏈dna結(jié)合，結(jié)合，產(chǎn)生假陽性產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件% 對引物特異性要求較高對引物特異性要求較高% 不能進(jìn)行多重定量不能進(jìn)行多重定量缺缺 點點sybr green i染料法染料法優(yōu)缺點優(yōu)缺點taqman探針法探針法原理原理+ 5端標(biāo)記有報告基團(tuán)(reporter, r) ，如fam、vic等 + 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (quencher, q)+ 探針完整，r發(fā)射的熒光能量被q基團(tuán)吸收

9、 ，無熒光， r與q分開，發(fā)熒光+ taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針taqman探針法探針法工作機(jī)理工作機(jī)理1、引物、探針的設(shè)計：、引物、探針的設(shè)計： 探針tm為68-70 ，30 bp, 5不能有g(shù)，g可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物tm為59-60 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20s 60，30-60s（taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小ct值，最大信號值，最大信號/背景比值背景比值 引物濃度：50-900nm 探針

10、濃度：50-250nm4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)pcr相同相同taqman探針法探針法pcr體系的建立體系的建立taqman探針法探針法熒光標(biāo)記物的選擇熒光標(biāo)記物的選擇% 高度特異性高度特異性% 重復(fù)性好重復(fù)性好% 可進(jìn)行多重定量可進(jìn)行多重定量優(yōu)優(yōu) 點點% 只適合一個特定的目標(biāo)只適合一個特定的目標(biāo)% 委托公司標(biāo)記，價格較高委托公司標(biāo)記，價格較高% 不易找到本底低的探針不易找到本底低的探針缺缺 點點taqman探針法探針法優(yōu)缺點優(yōu)缺點不同定量方法的比較不同定量方法的比較方法方法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點適用范圍適用范圍sybr green i sybr green i 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便

11、方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶易出現(xiàn)非特異性帶不能進(jìn)行多重定量不能進(jìn)行多重定量適合科研中對各種目的適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究組動植物的研究taqmantaqman 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定量價格高價格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥病原體檢測，疾病耐藥基因研究基因研究, ,藥物療效考核藥物療效考核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷內(nèi)容概要內(nèi)容概要1 熒光定量熒光定量pcr原理原理1 熒光定量熒光定量pcr的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法1 熒光定量熒光定量pc

12、r的解析方法的解析方法1 sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1 tiangen公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南絕對定量解析方法絕對定量解析方法sample25絕對定量的定義絕對定量的定義0 log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系0 根據(jù)樣品ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備pcrpcr目的基因克隆目的基因克隆質(zhì)粒質(zhì)?；蚪M基因組dnadna拷貝數(shù)的計算：拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）od26040稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)324待測樣本拷貝數(shù)（c

13、opies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量61014倍比梯度稀釋方法：倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算q 方方 法：法：從血液中提取病毒dna，以taqman探針法進(jìn)行熒光定量檢測q 試試 劑：劑：tiangen公司探針法試劑realmastermix（probe）（目錄號：fp203）q 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105 、104 、 103

14、；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照q 實驗步驟：實驗步驟：提取hbv dna； 設(shè)計特異引物； 設(shè)計taqman探針并標(biāo)記探針； 熒光定量擴(kuò)增； 結(jié)果分析：獲取血液樣品中hbv dna的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中hbvhbv的絕對定量的絕對定量samplesamplecopies/mlcopies/mlct1ct1ct2ct2mean ctmean ctstdstd標(biāo)準(zhǔn)品510328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品510425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品510522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品510618.6318.9218

15、.770.10未知樣品? ?20.5620.4520.50.05空白對照nonenone實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中hbvhbv的絕對定量的絕對定量擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（e）計算）計算 e=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用利用mean ct 作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y = -3.17x + 37.52 r2 = 0.9988絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中hbvhbv的絕對定量的絕對定量未知樣品拷貝數(shù)的計算未知樣品拷貝數(shù)的計算將ct值帶入線性方程

16、：20.5= -3.1726 x + 37.52quantityunknown=105.36 =229087 copies 絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中hbvhbv的絕對定量的絕對定量x=20.5-37.52-3.1726=5.36相對定量解析方法相對定量解析方法相對定量的必要性相對定量的必要性p p p p p p o o 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -ct法法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。表

17、達(dá)量。 相對值相對值= =校正值校正值= =目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值待測樣品的校正值對照樣品的校正值對照樣品的校正值公式：公式：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一檢測樣品檢測樣品管家基因管家基因h h目的基因目的基因x x定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)定量結(jié)果果校正值校正值相對量相對量對照樣品對照樣品6391.5

18、6391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待測樣品待測樣品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待測樣品待測樣品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)公式：公式：f = 22 2 法法優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：假定擴(kuò)增效率為缺點：假定擴(kuò)增效率為 100 %； 假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致； 實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中

19、最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一 待測組目的基因平均ct值待測組管家基因平均ct值對照組目的基因平均ct值對照組管家基因平均ct值ctct實驗數(shù)據(jù)：實驗數(shù)據(jù)：sample 處理前 處理后 jun(meanct)gapdh(meanct)e18161717.41.951.952 - ct法：法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%ct（處理前）18171 ct（處理后）1617.4=1.4ct=ct（處理后）ct（處理前）1.412.4比率（處理后/處理前）=2ct2（2.4） = 5.3 所

20、以所以junjun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高基因在處理后表達(dá)水平比處理前高5.35.3倍倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么，那么2ct可以修正為：可以修正為：ect，例如擴(kuò)增效率為，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計算公式可修正為，那么計算公式可修正為1.95ct2 -2 -ctct法法內(nèi)容概要內(nèi)容概要1 熒光定量熒光定量pcr的原理的原理1 熒光定量熒光定量pcr的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法1 熒光定量熒光定量pcr的解析方法的解析方法1 sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程

21、及注意事項1 tiangen公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析儀器介紹儀器介紹rt上機(jī)上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇分析方法分析方法樣品制備樣品制備環(huán)境要求環(huán)境要求模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析rt上機(jī)上機(jī)濃度確定濃度確定sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項無rnase環(huán)境使用無rnase耗材專用rnase-free工具分光光度計檢測電泳檢測rt反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體

22、系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)amvm-mlvquantsuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計引物設(shè)計濃度確定濃度確定環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制rt樣品制備樣品制備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（3次）設(shè)置空白和陰性對照gc：5060tm：5065單個堿基重復(fù)4個無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100200bp反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化rt樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積5ul，推薦2050ulmg2調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度pcr延伸時間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90110重復(fù)性：std0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：r0.99或r2 0.98sybr法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照技能要求技能要求誤差控制誤差控制儀器介紹儀器介紹上機(jī)上