聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)polymerase chain reaction 常立功2014-09-29-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- pcr的起源與發(fā)展 pcr基本原理 普通pcr過程與分析 熒光定量pcr過程與分析-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- pcr的最大特點(diǎn)，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的dna，就能用pcr加以放大，進(jìn)行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。 dna在復(fù)制時，其中兩條以氫鍵結(jié)合的互補(bǔ)鏈必須先行分開，才能各自作為復(fù)制的模板；而打開雙螺旋的最簡單方法就是加熱。在高溫下，雙股dna鏈會分離成

2、單股，等溫度降低后，互補(bǔ)的兩條dna鏈又可以恢復(fù)成雙股。雖然dna分子能耐高溫，但進(jìn)行dna復(fù)制所需的聚合酶是蛋白質(zhì)，在高溫下會失去活性。這也是之前的研究人員不認(rèn)為這種方法可行的原因之一。再有，要在千萬條dna當(dāng)中，以一小段已知序列制成的引物，“釣”出所需的片段，進(jìn)行復(fù)制，也跟大海撈針差不多，這是另一個讓人卻步的理由。 -學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 1953年，dna被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞里攜帶遺傳信息的分子。 1956年，第一個細(xì)胞內(nèi)用來復(fù)制dna所需的聚合酶（此時的基因擴(kuò)增僅在實(shí)驗(yàn)室，小規(guī)模的擴(kuò)增，操作繁復(fù)，成本高）。 1973年，臺灣人錢嘉韻在黃石公園里熱泉中發(fā)現(xiàn)的嗜熱菌中并分離出耐熱的taq聚合酶。 1

3、984年，美國人k. mullis (穆里斯 )和日本人才木共同奠定了現(xiàn)代pcr技術(shù)的基礎(chǔ)，使pcr技術(shù)進(jìn)入普通實(shí)驗(yàn)室，前者在1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎 -學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室大多使用rt-pcr技術(shù)檢測某個基因的表達(dá)。 逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription rt）是將rna轉(zhuǎn)錄成cdna的過程。 為什么要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄？ 為什么要提取rna而非dna？-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 逆轉(zhuǎn)錄示意圖逆轉(zhuǎn)錄示意圖-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 逆轉(zhuǎn)錄體系逆轉(zhuǎn)錄體系-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 1.oligo(dt)18 ： 能與mrna的poly(a)尾巴可以發(fā)生特異性結(jié)合，適合真核生物mrna的轉(zhuǎn)錄,尤

4、其是新鮮的組織或細(xì)胞，當(dāng)所提取的rna片段長度小于2kb,無復(fù)雜三級結(jié)構(gòu) 隨機(jī)六聚體引物：適用于mrna內(nèi)含抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性的終止序列，適合提取無poly(a)尾巴的rna、石蠟和破碎組織內(nèi)提取的rna，特別是當(dāng)提取片段超過2kb，內(nèi)部有復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)的， 特異性引物：用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cdna，導(dǎo)致更為特異的pcr擴(kuò)增。 逆轉(zhuǎn)錄引物區(qū)別逆轉(zhuǎn)錄引物區(qū)別-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 普通pcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系5533d.ntpstaq 酶primers5353535353535353反應(yīng)組分反應(yīng)組分變變 性性535353535353 普通 pcr示意圖示意圖延延 伸伸53535353353taqt

5、aq55重重 復(fù)復(fù)退退 火火5353535355335353循環(huán)循環(huán)2x2個拷貝個拷貝循環(huán)循環(huán)3x3個拷貝個拷貝53535353535353535353533553535353-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動-pcrpcr反應(yīng)模式反應(yīng)模式 -學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動-普通普通pcrpcr結(jié)果分析結(jié)果分析 -學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動-熒光定量熒光定量pcrpcr5533d.ntpstaq酶primers5353535353535353反應(yīng)組分反應(yīng)組分變變 性性535353535353熒光染料法原理熒光染料法原理sybr green itaqidlid延延 伸伸53535353檢測激發(fā)的熒光檢測激發(fā)的熒光535355taqta

6、q353taqtaq55退退 火火ididididididididididlllll5533d.ntpstaq酶primers5353535353535353反應(yīng)體系變 性535353535353taql53rqprobe53rqtaqman探針原理探針原理535353rq退 火531. 鏈取代taq3qr5533qtaqr52. 水 解3. 聚 合53qtaqr354. 檢測熒光533qtaqr5l-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)-c(t)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法unknown104103-學(xué)術(shù)活動學(xué)術(shù)活動- 無需制備標(biāo)準(zhǔn)品(2 -c(t) 法法)，但需要內(nèi)參照基因，且要求內(nèi)參與目的基因