凝膠過濾中的脫鹽柱的使用

1、廖紅軍是一種由限制分子通過多孔基質(zhì)，按分子大小分離混合分子的技術；凝膠過濾主要可以用在兩個領域：1、組群分離，根據(jù)大小的范圍將樣品的成分分成兩個主要組群，主要應用于除去樣品中高分子量或低分子量污染物（如細胞培養(yǎng)液中酚紅）、脫鹽或更換buffer；2、生物分子高分辨組分的收集（根據(jù)生物分子的分子量差距進行分離）；sephadex g-10，非常適合于分離生物分子，如從小分子（分子量大于100）中分離肽段（分子量大于700）；sephadex g-25，主要用于球蛋白組群分離，尤其適合分子量大于5kd的脫鹽或其他小分子污染物的去除；sephadex g-50，適合從小分子（1.5kd）中分離大分子

2、（30kd）物質(zhì)。sephadex是由3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷(epichlorohydrin) 和葡聚糖交聯(lián)加工成珠狀的介質(zhì)。下圖是sephadex的部分結構：交聯(lián)度不同產(chǎn)生了不同的sephadex填料，影響了他們的溶脹程度和對特定分子大小的選擇性處理量：30%總柱體積；樣品濃度一般不超過70mg/ml，粘度過大，粘度的變化與溫度有關；柱高：10cm；一般生物大分子的分子量比鹽等小分子大許多倍，用凝膠過濾方法為生物產(chǎn)品脫鹽十分簡單、可靠；層析方法可透過紫外和電導檢測器監(jiān)控整個層析脫鹽的過程、產(chǎn)品的純度和回收率，又可以連續(xù)自動進樣和收集，自動化程度高，容易放大；運行周期短，大多數(shù)蛋白回收率95

3、%；sephadex在所有常用的緩沖體系中穩(wěn)定，以及添加劑，如離子和非離子去污劑、變性劑（8m尿素或6m鹽酸胍）；在短鏈醇類中穩(wěn)定，如乙醇、甲醇、丙醇，但是超過25%濃度不經(jīng)常使用；注意： sephadex在醇類中填料會收縮；一般保存在425 20%乙醇中，不要冰凍，或者0.01m naoh中， naoh是抑菌的，該溶液非常好去除，而且填料不會收縮。sephadex g-25有粗、中、細、超細四種不同顆粒大小可選擇；顆粒越小分辨率越高，但流速也越慢；樣品在粒徑粗的介質(zhì)中更容易擴散，所以 sephadexg-25 coarse (粗) 的上樣量在四種介質(zhì)中最少；粗顆粒介質(zhì)流速快，sephadex

4、 g-25 coarse 在每個單位時間、單位柱床體積所純化的產(chǎn)品，即生產(chǎn)率最高；選擇最合適的脫鹽介質(zhì)，主要是要達到分辨率與生產(chǎn)率的最佳結合。脫鹽、緩沖液置換。傳統(tǒng)實驗室樣品脫鹽常用透析方法時間長、緩沖液消耗量大，又容易損失寶貴的樣品；保護親合層析洗脫樣品，親合層析有時會用較劇烈的洗脫條件，時間一長，洗脫的目標蛋白便失去活性，若在洗脫時串聯(lián)一根脫鹽柱，可以將目標蛋白快速置換到穩(wěn)定緩沖液中；其它實驗室常規(guī)工作應用： 1. 親合層析洗脫液中所含的在紫外有強烈吸收的小分子會干擾往后的檢測工作。如組氨酸融合蛋白，需用咪唑從螯合了鎳離子的層析介質(zhì)上洗脫，sephadex g-25可以將咪唑去除。 2. 在生物分子偶聯(lián)反應中去除小分子反應副產(chǎn)物。 3. 終止酶反應，去除小分子輔助因子、抑制劑等。 4. 從標記生物分子中去除游離的同位素標記，如i125。 5. 在進行陰離子交換層析前，從培養(yǎng)基中去除苯酚紅。不同生產(chǎn)規(guī)模的天然生物制品及基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中使用sephadex g-25介質(zhì)的例子有很多。包括植物中抽提的過敏源蛋白