第七章工業(yè)微生物誘變育種

1、1第七章第七章工業(yè)微生物誘變育種工業(yè)微生物誘變育種概述概述 誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作 誘變育種步驟和方法誘變育種步驟和方法 突變株的分離與篩選突變株的分離與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選22 2 概述概述（一）誘變育種技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展（一）誘變育種技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展 工業(yè)與工程需求：工業(yè)與工程需求：發(fā)酵工業(yè)尤其是抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株選發(fā)酵工業(yè)尤其是抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株選育工作的需要；育工作的需要； 理論與技術(shù)基礎(chǔ)：理論與技術(shù)基礎(chǔ)：thomthom和和steinbergsteinberg（19391939）用）用x x射線在真射線在真菌中首次誘發(fā)基因突變成

2、功；菌中首次誘發(fā)基因突變成功； 問題探索與技術(shù)發(fā)展：?jiǎn)栴}探索與技術(shù)發(fā)展：davisdavis對(duì)各種誘變篩選程序的統(tǒng)計(jì)對(duì)各種誘變篩選程序的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較；學(xué)比較；calamcalam對(duì)各種誘變劑量下的產(chǎn)量分步曲線的比較；對(duì)各種誘變劑量下的產(chǎn)量分步曲線的比較；dahldahl等人對(duì)篩選工作可能誤差的分析；各種自動(dòng)化和高通等人對(duì)篩選工作可能誤差的分析；各種自動(dòng)化和高通量篩選技術(shù)出現(xiàn)量篩選技術(shù)出現(xiàn)34（二）誘變育種技術(shù)在育種工作的作用（二）誘變育種技術(shù)在育種工作的作用 提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量； 改善菌種特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量，簡(jiǎn)化工藝條件；改善菌種特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量，簡(jiǎn)化工藝條件； 開發(fā)新產(chǎn)品

3、；開發(fā)新產(chǎn)品； 給代謝調(diào)控育種提供技術(shù)手段給代謝調(diào)控育種提供技術(shù)手段45（三）高產(chǎn)菌株誘變育種的特點(diǎn)（三）高產(chǎn)菌株誘變育種的特點(diǎn) 產(chǎn)量是一種數(shù)量性狀，數(shù)量性狀的特性和基因產(chǎn)量是一種數(shù)量性狀，數(shù)量性狀的特性和基因突變的特點(diǎn)決定了高產(chǎn)菌株的誘變選育一般具有突變的特點(diǎn)決定了高產(chǎn)菌株的誘變選育一般具有以下一些特點(diǎn)以下一些特點(diǎn)： 盲目性大；盲目性大； 篩選工作繁瑣，工作量大；篩選工作繁瑣，工作量大； 工作效率低，周期長(zhǎng)；工作效率低，周期長(zhǎng)； 難以集合多個(gè)優(yōu)良性狀難以集合多個(gè)優(yōu)良性狀5第一節(jié)第一節(jié) 誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作在誘變育種試驗(yàn)設(shè)計(jì)之前，要進(jìn)一步了解高產(chǎn)菌株誘變育在

4、誘變育種試驗(yàn)設(shè)計(jì)之前，要進(jìn)一步了解高產(chǎn)菌株誘變育種的特點(diǎn)，為以后試驗(yàn)工作提供依據(jù)。種的特點(diǎn)，為以后試驗(yàn)工作提供依據(jù)。誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整是決定誘變育種成敗的三個(gè)方面，在育種開展之前，根據(jù)是決定誘變育種成敗的三個(gè)方面，在育種開展之前，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康木o緊圍繞三個(gè)環(huán)節(jié)制定試驗(yàn)方案。試驗(yàn)?zāi)康木o緊圍繞三個(gè)環(huán)節(jié)制定試驗(yàn)方案。在誘變育種前，應(yīng)該對(duì)大生產(chǎn)的設(shè)備和工藝具有相當(dāng)?shù)闹谡T變育種前，應(yīng)該對(duì)大生產(chǎn)的設(shè)備和工藝具有相當(dāng)?shù)闹R(shí)和全面的了解，制定菌種選育的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，方能使識(shí)和全面的了解，制定菌種選育的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，方能使選育出來

5、的菌種推廣到大生產(chǎn)中去。選育出來的菌種推廣到大生產(chǎn)中去。6一、一、誘變前對(duì)出發(fā)菌株的了解誘變前對(duì)出發(fā)菌株的了解1.區(qū)分不同菌落類型區(qū)分不同菌落類型表表- -土霉素產(chǎn)生菌不同菌落類型的形態(tài)及在不同培養(yǎng)基中的效價(jià)土霉素產(chǎn)生菌不同菌落類型的形態(tài)及在不同培養(yǎng)基中的效價(jià)3065030650凸起處有白色或淺凸起處有白色或淺灰色氣生菌絲灰色氣生菌絲中間凸起中間凸起淺棕色淺棕色約約0.70.7草帽型草帽型5 528900289001850018500先在中圈有白色或先在中圈有白色或淺灰色氣生菌絲淺灰色氣生菌絲分成兩圈分成兩圈約約0.70.7年輪型年輪型4 416500165001870018700氣生菌絲只占

6、菌落氣生菌絲只占菌落中間中間0.3cm0.3cm淺棕色淺棕色0.5-0.60.5-0.6顆粒型顆粒型3 3不長(zhǎng)不長(zhǎng)1418014180白色有放射線氣生白色有放射線氣生菌絲蓋滿全菌落菌絲蓋滿全菌落淺棕色淺棕色0.70.7梅花型梅花型2 2不長(zhǎng)不長(zhǎng)37303730淺灰淺灰 淺黃淺黃棕色棕色0.80.8龜背型龜背型1 1培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基搖瓶效價(jià)搖瓶效價(jià)/(u/ml)/(u/ml)菌落特征菌落特征氣生菌絲氣生菌絲菌落形狀菌落形狀和大小和大小/cm/cm菌落類型菌落類型7注：培養(yǎng)基注：培養(yǎng)基(%):(%):淀粉淀粉8 8、糊精、糊精4 4、黃豆餅粉、黃豆餅粉2 2、玉米漿、玉米漿0.40.4、硫

7、酸銨、硫酸銨1.21.2、碳酸鈣、碳酸鈣1.21.2、氯化鈉氯化鈉0.40.4、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀0.010.01、氯化鈷、氯化鈷10g/ml10g/ml、玉米油、玉米油2.52.5；培養(yǎng)基；培養(yǎng)基(%):(%):除糊精除糊精7 7、硫酸銨硫酸銨1.41.4、碳酸鈣、碳酸鈣1.41.4、合成消泡劑、合成消泡劑0.02-0.030.02-0.03代替玉米油，其他成分與培養(yǎng)基代替玉米油，其他成分與培養(yǎng)基相相同。同。2.出現(xiàn)不同菌落類型原因出現(xiàn)不同菌落類型原因遺傳因素決定遺傳因素決定培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件等的改變，引起菌落形態(tài)的變化培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件等的改變，引起菌落形態(tài)的變化區(qū)分和識(shí)別不同菌落

8、類型的生物學(xué)特征及其生產(chǎn)能力對(duì)生區(qū)分和識(shí)別不同菌落類型的生物學(xué)特征及其生產(chǎn)能力對(duì)生產(chǎn)用菌和提供改良的出發(fā)菌株尤為重要。產(chǎn)用菌和提供改良的出發(fā)菌株尤為重要。8二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系多方面考查菌種的生活史，了解它們的形態(tài)、生理、生化多方面考查菌種的生活史，了解它們的形態(tài)、生理、生化等生物學(xué)特性，以及這些特性與代謝產(chǎn)物合成的關(guān)系。等生物學(xué)特性，以及這些特性與代謝產(chǎn)物合成的關(guān)系。研究菌種的某些生物學(xué)特性與產(chǎn)量合成的相關(guān)性。研究菌種的某些生物學(xué)特性與產(chǎn)量合成的相關(guān)性。三、了解影響菌種生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素三、了解影響菌種生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素 菌種選育過

9、程中，要不斷進(jìn)行移接、培養(yǎng)，如果不了菌種選育過程中，要不斷進(jìn)行移接、培養(yǎng)，如果不了解試驗(yàn)菌株培養(yǎng)過程中影響其生長(zhǎng)代謝的主要因素，那么，解試驗(yàn)菌株培養(yǎng)過程中影響其生長(zhǎng)代謝的主要因素，那么，即使擺在眼前的高產(chǎn)菌株也因某些因素的干擾而掩蓋原有即使擺在眼前的高產(chǎn)菌株也因某些因素的干擾而掩蓋原有的形態(tài)和其他生物學(xué)特性，結(jié)果造成漏篩或高產(chǎn)特性難以的形態(tài)和其他生物學(xué)特性，結(jié)果造成漏篩或高產(chǎn)特性難以發(fā)揮，甚至發(fā)生變異、退化。發(fā)揮，甚至發(fā)生變異、退化。92.培養(yǎng)基斜面制備技術(shù)培養(yǎng)基斜面制備技術(shù)一個(gè)好的培養(yǎng)基配方固然很重要，但忽視配制技術(shù)也會(huì)造成一個(gè)好的培養(yǎng)基配方固然很重要，但忽視配制技術(shù)也會(huì)造成菌種生長(zhǎng)不良，甚

10、至發(fā)生變異、退化，直接影響菌種質(zhì)量和生產(chǎn)菌種生長(zhǎng)不良，甚至發(fā)生變異、退化，直接影響菌種質(zhì)量和生產(chǎn)水平。水平。注意藥品的原材料質(zhì)量、規(guī)格，要相對(duì)穩(wěn)定。注意藥品的原材料質(zhì)量、規(guī)格，要相對(duì)穩(wěn)定。培養(yǎng)基蒸汽消毒時(shí)，壓力、時(shí)間要適宜，不能超壓、超時(shí)滅菌。培養(yǎng)基蒸汽消毒時(shí)，壓力、時(shí)間要適宜，不能超壓、超時(shí)滅菌。1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基這是影響菌種和孢子形成的重要因素之一，其中碳、氮這是影響菌種和孢子形成的重要因素之一，其中碳、氮源的種類、濃度影響很大。源的種類、濃度影響很大。對(duì)孢子菌來說，營(yíng)養(yǎng)是個(gè)控制生對(duì)孢子菌來說，營(yíng)養(yǎng)是個(gè)控制生長(zhǎng)和孢子形成的主要因素，長(zhǎng)和孢子形成的主要因素，營(yíng)養(yǎng)過于豐富無益于孢子的形成，營(yíng)養(yǎng)過

11、于豐富無益于孢子的形成，尤其是氮源，太豐富時(shí)促使菌絲大量生長(zhǎng)，卻不利于孢子產(chǎn)尤其是氮源，太豐富時(shí)促使菌絲大量生長(zhǎng)，卻不利于孢子產(chǎn)生。生。104.溫度溫度3.移種的密度移種的密度對(duì)絲狀菌來說，密度控制尤為重要。對(duì)絲狀菌來說，密度控制尤為重要。接種量過密，不同菌接種量過密，不同菌落間的菌絲交織在一起，容易吻合產(chǎn)生異核體，變異菌株增多，落間的菌絲交織在一起，容易吻合產(chǎn)生異核體，變異菌株增多，菌種發(fā)生退化，生產(chǎn)能力下降。菌種發(fā)生退化，生產(chǎn)能力下降。加入瓊脂數(shù)量因條件不同靈活變動(dòng)。加入瓊脂數(shù)量因條件不同靈活變動(dòng)。培養(yǎng)基加入到試管中的量不能過多，瓊脂平板不能過厚。培養(yǎng)基加入到試管中的量不能過多，瓊脂平板不

12、能過厚。斜面培養(yǎng)基表面冷凝水不宜過多。斜面培養(yǎng)基表面冷凝水不宜過多。 溫度對(duì)菌種影響很大，在培養(yǎng)過程中溫度高、生長(zhǎng)快，溫度對(duì)菌種影響很大，在培養(yǎng)過程中溫度高、生長(zhǎng)快，但超過適應(yīng)范圍會(huì)使生產(chǎn)能力顯著下降，甚至引起變異，但超過適應(yīng)范圍會(huì)使生產(chǎn)能力顯著下降，甚至引起變異，對(duì)菌種優(yōu)良性狀的影響，高溫永遠(yuǎn)比低溫要大。對(duì)菌種優(yōu)良性狀的影響，高溫永遠(yuǎn)比低溫要大。116.藥品和原材料質(zhì)量藥品和原材料質(zhì)量5.濕度濕度濕度對(duì)菌種生長(zhǎng)和孢子形成的影響也不可忽視，相對(duì)濕度濕度對(duì)菌種生長(zhǎng)和孢子形成的影響也不可忽視，相對(duì)濕度高了，生長(zhǎng)慢；相對(duì)濕度低，則生長(zhǎng)快。高了，生長(zhǎng)慢；相對(duì)濕度低，則生長(zhǎng)快。四、了解菌種有效產(chǎn)物中的各

13、種組分在代謝合成過程中與培四、了解菌種有效產(chǎn)物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條件的關(guān)系養(yǎng)條件的關(guān)系由棘孢小單孢菌產(chǎn)生的慶大霉素，其中由棘孢小單孢菌產(chǎn)生的慶大霉素，其中c1是有效的組分；是有效的組分；c2是無效的。是無效的。另外發(fā)酵周期中的不同階段，有效組分和無效組分合成另外發(fā)酵周期中的不同階段，有效組分和無效組分合成的比例也有較大的差異。的比例也有較大的差異。12六、研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件六、研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一個(gè)優(yōu)良菌種的獲得往往要花費(fèi)巨大的人力、物力和時(shí)一個(gè)優(yōu)良菌種的獲得往往要花費(fèi)巨大的人力、物力和時(shí)間，是非常不容易的，不能隨便采用某個(gè)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件間，是

14、非常不容易的，不能隨便采用某個(gè)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和保藏方法進(jìn)行培養(yǎng)和保藏。和保藏方法進(jìn)行培養(yǎng)和保藏。五、建立一個(gè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)產(chǎn)物的方法五、建立一個(gè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)產(chǎn)物的方法由于誘發(fā)突變頻率極低，需要從相當(dāng)數(shù)量的誘變分離菌由于誘發(fā)突變頻率極低，需要從相當(dāng)數(shù)量的誘變分離菌株中篩選，才有可能獲得較理想的突變株。限制篩選量的主株中篩選，才有可能獲得較理想的突變株。限制篩選量的主要因素，除了搖瓶量之外，檢測(cè)方法也是重要因素，所以建要因素，除了搖瓶量之外，檢測(cè)方法也是重要因素，所以建立一個(gè)適應(yīng)于大規(guī)模篩選的有效的檢測(cè)方法是十分必要的。立一個(gè)適應(yīng)于大規(guī)模篩選的有效的檢測(cè)方法是十分必要的。13第二節(jié)

15、第二節(jié) 誘變育種的步驟與方法誘變育種的步驟與方法出發(fā)菌株出發(fā)菌株 純化、活化、前培養(yǎng)（同步培養(yǎng)）純化、活化、前培養(yǎng)（同步培養(yǎng)） 培養(yǎng)液培養(yǎng)液 離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾） 單細(xì)胞或單孢子懸液?jiǎn)渭?xì)胞或單孢子懸液 活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn) 誘變處理誘變處理 活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算 后培養(yǎng)（中間培養(yǎng)）后培養(yǎng)（中間培養(yǎng)） 平板分離平板分離 變異率計(jì)算變異率計(jì)算 初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)保藏及擴(kuò)大試驗(yàn) 誘變育種的一般步驟誘變育種的一般步驟14一、出發(fā)菌株一、出發(fā)菌株1.1

16、.對(duì)一般出發(fā)菌株的要求對(duì)一般出發(fā)菌株的要求（1 1）從自然界樣品中分離篩選出來的野生菌株，雖然產(chǎn)量）從自然界樣品中分離篩選出來的野生菌株，雖然產(chǎn)量較低，但對(duì)誘變因素敏感，變異幅度大，正突變高；較低，但對(duì)誘變因素敏感，變異幅度大，正突變高；（2 2）在生產(chǎn)中使用的，具有一定生產(chǎn)能力，并且在生產(chǎn)過）在生產(chǎn)中使用的，具有一定生產(chǎn)能力，并且在生產(chǎn)過程中經(jīng)過自然選育的菌株；程中經(jīng)過自然選育的菌株；（3 3）采用具有有利性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求）采用具有有利性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株；低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株；用于每代誘變的試驗(yàn)菌株用于每代誘變的試驗(yàn)菌株15（4

17、4）由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會(huì)提高對(duì)其他誘變因）由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會(huì)提高對(duì)其他誘變因素的敏感性，故有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為素的敏感性，故有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株。出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌株中，曾發(fā)現(xiàn)以分泌黃色例如，在金霉素生產(chǎn)菌株中，曾發(fā)現(xiàn)以分泌黃色色素的菌株作出發(fā)菌株時(shí)，只會(huì)使產(chǎn)量下降，而以失去色素色素的菌株作出發(fā)菌株時(shí)，只會(huì)使產(chǎn)量下降，而以失去色素的變異菌株作出發(fā)菌株時(shí)，則產(chǎn)量會(huì)不斷提高；的變異菌株作出發(fā)菌株時(shí)，則產(chǎn)量會(huì)不斷提高；（5 5）采用一類被稱為）采用一類被稱為“增變菌株增變菌株”的變異菌株，它們對(duì)誘的變異菌株，它們對(duì)誘變劑的

18、敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株；變劑的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株；16（6 6）在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮至少）在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮至少能累計(jì)少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的能累計(jì)少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。選育菌種的目的，是將優(yōu)良菌種推廣到工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)此，選育菌種的目的，是將優(yōu)良菌種推廣到工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)此，在選擇出發(fā)菌株

19、時(shí)還要注意如下幾個(gè)方面：在選擇出發(fā)菌株時(shí)還要注意如下幾個(gè)方面：2.2.選擇具備一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作為出選擇具備一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作為出發(fā)菌株發(fā)菌株3.3.選擇純種作為出發(fā)菌株選擇純種作為出發(fā)菌株174.4.選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性5.5.連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株由于突變株的產(chǎn)量是數(shù)量遺傳，只能逐步累加，一次性大由于突變株的產(chǎn)量是數(shù)量遺傳，只能逐步累加，一次性大幅度提高發(fā)酵水平不太容易。在選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)挑選每幅度提高發(fā)酵水平不太容易。在選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)挑選每代誘變處理后均有一些表型上改變的菌株，如發(fā)

20、酵單位有一代誘變處理后均有一些表型上改變的菌株，如發(fā)酵單位有一定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過一次變異或產(chǎn)生過回復(fù)突變的定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過一次變異或產(chǎn)生過回復(fù)突變的菌株等，以利于突變率的增加。菌株等，以利于突變率的增加。例如灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青例如灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉霉d-756變株（表變株（表7.2）和頭孢菌素）和頭孢菌素c產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌c-20變株（表變株（表7.3），它們的系譜中充分表明這一點(diǎn)。），它們的系譜中充分表明這一點(diǎn)。18表表-7.2灰黃霉素高產(chǎn)菌灰黃霉素高產(chǎn)菌d-756誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系菌號(hào)菌號(hào)誘變代數(shù)

21、誘變代數(shù)菌落大小菌落大小/cm/cm菌落表面菌落表面結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)菌落顏色菌落顏色 可溶性色可溶性色素素變株效價(jià)變株效價(jià)提高提高/%/%454145417104671046b-53b-53c-04c-04d-756d-7561 110101111自然分離后自然分離后13131.31.30.80.80.60.60.50.50.40.4平滑疏松平滑疏松平滑緊密平滑緊密平滑緊密平滑緊密平滑緊密平滑緊密平滑緊密平滑緊密龜背灰綠龜背灰綠白白白白白白白白赭石赭石灰泥棕灰泥棕海螺橙海螺橙淡可可棕淡可可棕魚鰓紅魚鰓紅1001002011201126422642354735476911691119表表-7.3頭孢菌素

22、頭孢菌素c產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌c-20誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系菌株編號(hào)菌株編號(hào)抗生素抗生素產(chǎn)量產(chǎn)量/%表型特征表型特征菌落直菌落直徑徑/mm基質(zhì)菌絲顏色基質(zhì)菌絲顏色其他其他c-1c-1c-2 uvc-2 uvc-3 nmc-3 nmc-4 xc-4 x射線射線c-7 uv+lc-7 uv+lc-8 uvc-8 uvc-15 ntgc-15 ntgc-17 emsc-17 emsc-19 nsc-19 nsc-20 emsc-20 ems100100213213548548829829112011201610161026302630302830283223

23、3223400040008-11.58-11.57-87-86-86-84-54-54.5-5.24.5-5.28-98-98-98-9乳白乳白檸檬黃檸檬黃檸檬黃檸檬黃檸檬黃檸檬黃鵝黃鵝黃鵝黃（邊緣檸檬黃）鵝黃（邊緣檸檬黃）乳黃乳黃粉玉色粉玉色組織松，生長(zhǎng)速度快組織松，生長(zhǎng)速度快組織緊密，生長(zhǎng)速度較慢組織緊密，生長(zhǎng)速度較慢生長(zhǎng)速度快生長(zhǎng)速度快菌落表面不規(guī)則紋密集菌落表面不規(guī)則紋密集沉沒培養(yǎng)形成菌團(tuán)沉沒培養(yǎng)形成菌團(tuán)菌苔變厚，紋變疏菌苔變厚，紋變疏菌落邊緣不規(guī)則，生長(zhǎng)較慢菌落邊緣不規(guī)則，生長(zhǎng)較慢菌苔稍增厚菌苔稍增厚菌苔厚，邊緣規(guī)則，放射紋疏菌苔厚，邊緣規(guī)則，放射紋疏菌苔扁薄，邊齊，放射紋密菌苔扁薄

24、，邊齊，放射紋密206. 6. 選擇出發(fā)菌株的其他因素選擇出發(fā)菌株的其他因素 要選擇具有產(chǎn)孢子較多、不產(chǎn)或少產(chǎn)色素、生活能力強(qiáng)、要選擇具有產(chǎn)孢子較多、不產(chǎn)或少產(chǎn)色素、生活能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、黏度小等性生長(zhǎng)速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、黏度小等性狀的菌株作為出發(fā)菌株，總之，要盡量符合育種所需要的生狀的菌株作為出發(fā)菌株，總之，要盡量符合育種所需要的生物學(xué)和代謝的特性。物學(xué)和代謝的特性。7. 7. 采用多出發(fā)菌株采用多出發(fā)菌株沒有詳細(xì)研究特定出發(fā)菌株敏感性的條件下，應(yīng)選擇多種遺沒有詳細(xì)研究特定出發(fā)菌株敏感性的條件下，應(yīng)選擇多種遺傳類型的菌株作為出發(fā)菌株傳類型的菌

25、株作為出發(fā)菌株；誘變育種工作中，一般采用誘變育種工作中，一般采用34個(gè)出發(fā)菌株，在逐代處理后，個(gè)出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株；將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株；當(dāng)一個(gè)菌株經(jīng)長(zhǎng)期誘變后，產(chǎn)量仍然得不到明顯的提高，應(yīng)當(dāng)一個(gè)菌株經(jīng)長(zhǎng)期誘變后，產(chǎn)量仍然得不到明顯的提高，應(yīng)考慮更換或重新篩選野生型菌株，或許會(huì)收到更大的效果?？紤]更換或重新篩選野生型菌株，或許會(huì)收到更大的效果。218. 8. 菌種代謝特點(diǎn)菌種代謝特點(diǎn) 了解菌種代謝特點(diǎn)有助于選擇有效的出發(fā)菌株。了解菌種代謝特點(diǎn)有助于選擇有效的出發(fā)菌株。如，有人曾研究過肌苷酸產(chǎn)生菌的代謝特性，發(fā)現(xiàn)肌苷酸的生

26、如，有人曾研究過肌苷酸產(chǎn)生菌的代謝特性，發(fā)現(xiàn)肌苷酸的生物合成過程與肌苷、肌苷酸降解酶及核苷酸、磷酸化酶的活性物合成過程與肌苷、肌苷酸降解酶及核苷酸、磷酸化酶的活性有關(guān)，如果從產(chǎn)生肌苷酸野生型的枯草桿菌中篩選到降解酶活有關(guān)，如果從產(chǎn)生肌苷酸野生型的枯草桿菌中篩選到降解酶活性低而磷酸化酶活性強(qiáng)的作為誘變出發(fā)菌株，一般能得到良好性低而磷酸化酶活性強(qiáng)的作為誘變出發(fā)菌株，一般能得到良好的誘變效果。的誘變效果。22二、出發(fā)菌株的純化二、出發(fā)菌株的純化確定誘變出發(fā)菌株之后，就要進(jìn)行純化。因?yàn)榇_定誘變出發(fā)菌株之后，就要進(jìn)行純化。因?yàn)槲⑸镂⑸锶菀装l(fā)生變異和染菌；一般絲狀菌的野生菌株為異核體；容易發(fā)生變異和染

27、菌；一般絲狀菌的野生菌株為異核體；生產(chǎn)菌在不斷移代過程中，菌絲間接觸、吻合后，易產(chǎn)生生產(chǎn)菌在不斷移代過程中，菌絲間接觸、吻合后，易產(chǎn)生異核體、部分結(jié)合子、雜合二倍體及自然突變產(chǎn)生變株等。異核體、部分結(jié)合子、雜合二倍體及自然突變產(chǎn)生變株等。這些都會(huì)造成遺傳性狀不穩(wěn)定。這些都會(huì)造成遺傳性狀不穩(wěn)定。常用劃線分離法、稀釋分離法、單孢子分離法常用劃線分離法、稀釋分離法、單孢子分離法在誘變育種中，出發(fā)菌株的純化雖然是輔助手段，但在誘變育種中，出發(fā)菌株的純化雖然是輔助手段，但它是不可缺少的技術(shù)步驟，其效果是顯著的，它是不可缺少的技術(shù)步驟，其效果是顯著的，例如從表例如從表7.2中看到，灰黃霉素變種中看到，灰黃

28、霉素變種b-53，經(jīng)過自然分離，獲得的變株，經(jīng)過自然分離，獲得的變株c-04的產(chǎn)量比前者顯著提高。的產(chǎn)量比前者顯著提高。23三、單孢子（或單細(xì)胞）懸液的制備三、單孢子（或單細(xì)胞）懸液的制備1.供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯2.菌懸液制備方法菌懸液制備方法細(xì)菌，細(xì)菌，最好在誘變處理前進(jìn)行搖瓶振蕩預(yù)培養(yǎng)；最好在誘變處理前進(jìn)行搖瓶振蕩預(yù)培養(yǎng)；產(chǎn)孢子的菌類進(jìn)行誘變，產(chǎn)孢子的菌類進(jìn)行誘變，處理的材料是孢子，而不是菌處理的材料是孢子，而不是菌絲，因?yàn)殒咦右话闶菃魏说模ㄈ缜嗝购秃谇梗z絲，因?yàn)殒咦右话闶菃魏说模ㄈ缜嗝购秃谇梗?，菌絲是多核的。是多核的。不產(chǎn)孢子的真菌，

29、不產(chǎn)孢子的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處可直接采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理。有三種方法：第一，菌絲尖端法。第二，處理單菌理。有三種方法：第一，菌絲尖端法。第二，處理單菌落周圍尖端菌絲。第三，混合處理法。此法常用于化學(xué)落周圍尖端菌絲。第三，混合處理法。此法常用于化學(xué)誘變劑。誘變劑。2412選擇合適的介質(zhì)：選擇合適的介質(zhì)：物理誘變常采用生理鹽水作分散物理誘變常采用生理鹽水作分散介質(zhì)，而化學(xué)誘變則需要用緩沖液作介質(zhì)。介質(zhì)，而化學(xué)誘變則需要用緩沖液作介質(zhì)。 使細(xì)胞或孢子要處于良好的分散狀態(tài)：使細(xì)胞或孢子要處于良好的分散狀態(tài)：利于與誘變利于與誘變劑解除；便于篩選劑解除；便于篩選 玻璃株打散，脫脂

30、棉或擦鏡紙（雙層）過濾玻璃株打散，脫脂棉或擦鏡紙（雙層）過濾 調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募?xì)胞或孢子密度調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募?xì)胞或孢子密度 酵母細(xì)胞、霉菌孢子：酵母細(xì)胞、霉菌孢子：10106 610107 7個(gè)個(gè)/ml/ml； 細(xì)菌細(xì)胞、放線菌孢子：細(xì)菌細(xì)胞、放線菌孢子：10108 8個(gè)個(gè)/ml /ml 估計(jì)：估計(jì)：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或odod法法 計(jì)數(shù)：平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)：平板菌落計(jì)數(shù)253.制備原生質(zhì)體作誘變材料制備原生質(zhì)體作誘變材料以原生質(zhì)體作為材料進(jìn)行誘變有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：以原生質(zhì)體作為材料進(jìn)行誘變有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：（1）在絲狀真菌中，由于菌絲有不同程度的分化，去壁后的原）在絲狀真菌中，由于菌絲

31、有不同程度的分化，去壁后的原生質(zhì)體是異質(zhì)的，即各原生質(zhì)體的生理、生化、分化程度等相生質(zhì)體是異質(zhì)的，即各原生質(zhì)體的生理、生化、分化程度等相異，為育種提供了各式各樣的誘變?cè)牧?，增加了突變的可能異，為育種提供了各式各樣的誘變?cè)牧?，增加了突變的可能性。性。?）微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，其中的一些成分，如黑色素會(huì)吸）微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，其中的一些成分，如黑色素會(huì)吸收紫外線、收紫外線、射線和射線和x射線的能量，進(jìn)而減緩了這些因子對(duì)細(xì)胞射線的能量，進(jìn)而減緩了這些因子對(duì)細(xì)胞的損傷作用，降低了誘變效果。的損傷作用，降低了誘變效果。（3）有些絲狀菌在一般培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生孢子，育種時(shí)只能以）有些絲狀菌在一般培養(yǎng)

32、條件下不產(chǎn)生孢子，育種時(shí)只能以多核菌絲體及碎片作為材料。用這些材料進(jìn)行誘變，往往因遺多核菌絲體及碎片作為材料。用這些材料進(jìn)行誘變，往往因遺傳分離而產(chǎn)生不純或不穩(wěn)定現(xiàn)象。傳分離而產(chǎn)生不純或不穩(wěn)定現(xiàn)象。對(duì)這類微生物采用原生質(zhì)體對(duì)這類微生物采用原生質(zhì)體作為誘變材料，可能會(huì)增強(qiáng)誘變效應(yīng)。作為誘變材料，可能會(huì)增強(qiáng)誘變效應(yīng)。26四、誘變劑及誘變劑量四、誘變劑及誘變劑量（一）誘變劑種類的選擇（一）誘變劑種類的選擇1.選擇誘變劑選擇誘變劑誘變劑主要對(duì)誘變劑主要對(duì)dna分子上基因的某一位點(diǎn)發(fā)生作用。根分子上基因的某一位點(diǎn)發(fā)生作用。根據(jù)誘變劑作用機(jī)制，再結(jié)合菌種特性來考慮選擇哪種誘變劑據(jù)誘變劑作用機(jī)制，再結(jié)合菌種

33、特性來考慮選擇哪種誘變劑進(jìn)行誘變。進(jìn)行誘變。例如，灰黃霉素野生菌使用氯化鋰和紫外線，取得驚人例如，灰黃霉素野生菌使用氯化鋰和紫外線，取得驚人誘變效果；頭孢菌素誘變效果；頭孢菌素c產(chǎn)生菌有效的誘變劑是紫外線、氯化產(chǎn)生菌有效的誘變劑是紫外線、氯化鋰、甲基磺酸乙酯；博萊霉素、四環(huán)素族產(chǎn)生菌常用一些具鋰、甲基磺酸乙酯；博萊霉素、四環(huán)素族產(chǎn)生菌常用一些具有氨基、硝基、亞硝基還原性質(zhì)的亞硝酸、羥胺、氯化鋰等有氨基、硝基、亞硝基還原性質(zhì)的亞硝酸、羥胺、氯化鋰等誘變劑，突變率較高；青霉素生產(chǎn)菌以亞硝基胍、氮芥、乙誘變劑，突變率較高；青霉素生產(chǎn)菌以亞硝基胍、氮芥、乙烯亞胺等具有活潑烷化基團(tuán)的烷化劑更為適合。烯亞

34、胺等具有活潑烷化基團(tuán)的烷化劑更為適合。272.根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑對(duì)遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株對(duì)遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株最好采用以前未使用過的、最好采用以前未使用過的、突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，使突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，使dnadna結(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，造成大的變異，構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，造成大的變異，然后再采用一些作用較緩的然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理；誘變劑處理；對(duì)遺傳性不穩(wěn)定的出發(fā)菌株（它們的遺傳背景是復(fù)對(duì)遺傳性不穩(wěn)定的出發(fā)菌株（它們的遺傳背景是復(fù)雜的）雜的）首先進(jìn)行自然分離，劃分菌落類型，從中選擇首先進(jìn)行自

35、然分離，劃分菌落類型，從中選擇效價(jià)高的、性能好的一類菌落作為誘變處理的效價(jià)高的、性能好的一類菌落作為誘變處理的出發(fā)菌株。出發(fā)菌株。采用采用溫和誘變劑或?qū)υ擃惥谡T變史上曾經(jīng)是有效的誘變劑進(jìn)行繼溫和誘變劑或?qū)υ擃惥谡T變史上曾經(jīng)是有效的誘變劑進(jìn)行繼續(xù)處理，使續(xù)處理，使dnadna結(jié)構(gòu)發(fā)生微小突變，結(jié)構(gòu)發(fā)生微小突變，從中篩選突變體。從中篩選突變體。并結(jié)合并結(jié)合自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類型不斷增加，成自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類型不斷增加，成為正常型菌落。為正常型菌落。283.參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來選擇誘變劑參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來選擇誘變劑誘變之前要考查出發(fā)菌株

36、的誘變系譜，詳細(xì)分析、誘變之前要考查出發(fā)菌株的誘變系譜，詳細(xì)分析、總結(jié)規(guī)律性?？偨Y(jié)規(guī)律性。為了成功地選育具有某種特性的生產(chǎn)菌種，就要選擇一種最佳為了成功地選育具有某種特性的生產(chǎn)菌種，就要選擇一種最佳的誘變劑。對(duì)此，事先需要做預(yù)備實(shí)驗(yàn)，可采用生產(chǎn)能力分類的誘變劑。對(duì)此，事先需要做預(yù)備實(shí)驗(yàn)，可采用生產(chǎn)能力分類法來直接比較其效果。法來直接比較其效果。通常做法是：取幾種誘變劑，各取不同劑量做一系列誘變?cè)囼?yàn)，通常做法是：取幾種誘變劑，各取不同劑量做一系列誘變?cè)囼?yàn)，挑選處理后的菌落上千個(gè)，進(jìn)行生產(chǎn)能力的測(cè)定，作出生產(chǎn)能挑選處理后的菌落上千個(gè)，進(jìn)行生產(chǎn)能力的測(cè)定，作出生產(chǎn)能力分布狀況。然后分別統(tǒng)計(jì)它們的正突

37、變株、負(fù)突變株和穩(wěn)定力分布狀況。然后分別統(tǒng)計(jì)它們的正突變株、負(fù)突變株和穩(wěn)定株的頻率。株的頻率。也有人在青霉素菌種選育過程中發(fā)也有人在青霉素菌種選育過程中發(fā)現(xiàn)，凡能誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變劑，往往也是高現(xiàn)，凡能誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變劑，往往也是高產(chǎn)菌株良好的誘變劑。產(chǎn)菌株良好的誘變劑。29（二）最適誘變劑量的選擇（二）最適誘變劑量的選擇高產(chǎn)菌株在高產(chǎn)菌株在低劑量低劑量時(shí)效果較好，而對(duì)多核細(xì)胞、孢時(shí)效果較好，而對(duì)多核細(xì)胞、孢子、低產(chǎn)菌株或質(zhì)量性狀處理劑量不宜過低。子、低產(chǎn)菌株或質(zhì)量性狀處理劑量不宜過低。 經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理來激

38、活；一次較高劑量的強(qiáng)誘變后，通常接著進(jìn)行來激活；一次較高劑量的強(qiáng)誘變后，通常接著進(jìn)行23次較低劑量的溫和誘變，以利于菌株遺傳性狀的穩(wěn)定。次較低劑量的溫和誘變，以利于菌株遺傳性狀的穩(wěn)定。 在一次誘變中，可以分別采用不同劑量處理出發(fā)菌在一次誘變中，可以分別采用不同劑量處理出發(fā)菌株，從中選出最佳劑量株，從中選出最佳劑量 30誘變劑量的控制方法誘變劑量的控制方法 化學(xué)誘變劑：誘變劑的濃度、處理時(shí)間和處理?xiàng)l件；化學(xué)誘變劑：誘變劑的濃度、處理時(shí)間和處理?xiàng)l件；物理誘變劑：照射距離、照射時(shí)間和照射條件物理誘變劑：照射距離、照射時(shí)間和照射條件31形態(tài)突變型形態(tài)突變型 負(fù)突變型負(fù)突變型 正突變型正突變型 x-x-

39、射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株3939# #變異變異的關(guān)系的關(guān)系 32紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293293# #變異變異的關(guān)系的關(guān)系 33五、誘變劑的處理方式五、誘變劑的處理方式單一誘變劑處理單一誘變劑處理; 復(fù)合處理復(fù)合處理：兩種或兩種以上誘變劑同時(shí)處理、兩種或兩種以上誘變劑同時(shí)處理、不同的誘變劑交替處理、同一誘變劑連續(xù)處理不同的誘變劑交替處理、同一誘變劑連續(xù)處理以及紫外線與光復(fù)活交替處理等以及紫外線與光復(fù)活交替處理等( 注意！注意！)1- 對(duì)照；對(duì)照； 2-乙烯亞胺（濃度乙烯亞胺（

40、濃度1:7000）；）； 3, 5, 7, 9-紫外線；紫外線； 4, 6, 8, 10-乙烯亞胺加紫外線乙烯亞胺加紫外線 紫外線的劑量（紫外線的劑量（erg/mm2）：）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000 乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果 34 誘變育種中，誘變處理的方式有多種，常用的誘變育種中，誘變處理的方式有多種，常用的有下面幾種方式：有下面幾種方式： 直接處理：直接處理：在緩沖液或無菌生理鹽水體系中對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)在緩沖液或無菌生理鹽水體系中對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，然后涂平板分離突變株；行誘變處理，然后涂

41、平板分離突變株； 生長(zhǎng)過程處理生長(zhǎng)過程處理：在搖瓶培養(yǎng)基或固體平板中加入誘變劑，：在搖瓶培養(yǎng)基或固體平板中加入誘變劑，在菌體生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行誘變處理。在菌體生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行誘變處理。 35六、影響突變率的因素六、影響突變率的因素（一）菌種遺傳特性不同（一）菌種遺傳特性不同（二）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（二）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（三）環(huán)境條件的影響（三）環(huán)境條件的影響1.誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)2.溫度、溫度、ph、氧氣等外界條件對(duì)誘變效應(yīng)的影響、氧氣等外界條件對(duì)誘變效應(yīng)的影響3.平皿密度效應(yīng)平皿密度效應(yīng)36前培養(yǎng)的目的：前培養(yǎng)的目的： p對(duì)數(shù)中后期：對(duì)數(shù)中后期：生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞濃度較高，對(duì)誘變劑敏感

42、； p同步培養(yǎng)物：同步培養(yǎng)物：誘變劑處理時(shí)，群體中變化一致； p細(xì)胞內(nèi)應(yīng)具有豐富的內(nèi)源性堿基：細(xì)胞內(nèi)應(yīng)具有豐富的內(nèi)源性堿基：dna被誘變劑作用后所造成的損傷能快速通過復(fù)制而形成突變，可以獲得較高的突變率。 前培養(yǎng)的培養(yǎng)基：前培養(yǎng)的培養(yǎng)基：嘌呤、嘧啶堿基嘌呤、嘧啶堿基含量要豐富 后培養(yǎng)：后培養(yǎng)：將誘變處理過的細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行將誘變處理過的細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使突變基因穩(wěn)定、純合并表達(dá)。培養(yǎng)，使突變基因穩(wěn)定、純合并表達(dá)。 目的：目的：消除表型延遲消除表型延遲 后培養(yǎng)培養(yǎng)基：后培養(yǎng)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)要求豐富，酪素水解液營(yíng)養(yǎng)要求豐富，酪素水解液( (或蛋白胨或蛋白胨) )可提供大量

43、氨基酸，酵母膏可提供各種生長(zhǎng)因子?？商峁┐罅堪被?，酵母膏可提供各種生長(zhǎng)因子。 372.溫度、溫度、ph、氧氣等外界條件對(duì)誘變效應(yīng)的影響、氧氣等外界條件對(duì)誘變效應(yīng)的影響溫度的影響是隨著菌種特性和誘變劑種類不同而異?；瘻囟鹊挠绊懯请S著菌種特性和誘變劑種類不同而異?；瘜W(xué)誘變因子的反應(yīng)速度在一定范圍內(nèi)隨著溫度的提高而加學(xué)誘變因子的反應(yīng)速度在一定范圍內(nèi)隨著溫度的提高而加速。速?；瘜W(xué)誘變劑與細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)作用時(shí)，需要在最適化學(xué)誘變劑與細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)作用時(shí)，需要在最適的、穩(wěn)定的、穩(wěn)定ph值范圍才表現(xiàn)出良好的誘變效應(yīng)。值范圍才表現(xiàn)出良好的誘變效應(yīng)。一些輻射因子和紫外線的誘變效應(yīng)與供氧有密切的關(guān)一些輻射因

44、子和紫外線的誘變效應(yīng)與供氧有密切的關(guān)系，如系，如x射線輻射大腸桿菌時(shí)，在相同的劑量條件下，供氧射線輻射大腸桿菌時(shí)，在相同的劑量條件下，供氧充足時(shí)，與充足時(shí)，與dna作用劇烈，損傷力大，反之則損傷小。作用劇烈，損傷力大，反之則損傷小。為為此，用于輻射的菌懸液液層易薄不易厚，或盡可能采用攪此，用于輻射的菌懸液液層易薄不易厚，或盡可能采用攪拌提供氧氣。拌提供氧氣。383.平皿密度效應(yīng)平皿密度效應(yīng)誘變處理后的菌懸液分離在平皿上的密度要適誘變處理后的菌懸液分離在平皿上的密度要適中，不能過密。實(shí)驗(yàn)證明，隨著加入到平皿中原養(yǎng)中，不能過密。實(shí)驗(yàn)證明，隨著加入到平皿中原養(yǎng)型菌數(shù)的增加，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變體機(jī)率

45、將減型菌數(shù)的增加，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變體機(jī)率將減少。密度過大，還會(huì)影響突變體的檢出。少。密度過大，還會(huì)影響突變體的檢出。第三節(jié)第三節(jié) 突變株的分離及篩選突變株的分離及篩選 一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)大多死亡大多死亡少數(shù)存活少數(shù)存活存活率存活率多數(shù)未變多數(shù)未變少數(shù)突變少數(shù)突變突變率突變率多數(shù)負(fù)變多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變少數(shù)正變正變率正變率多數(shù)幅度小多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大少數(shù)幅度大高產(chǎn)率高產(chǎn)率投產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)出發(fā)菌株出發(fā)菌株計(jì)算出計(jì)算出誘變誘變40二、篩選的程序二、篩選的程序篩選程序分為常規(guī)法和簡(jiǎn)便法篩選程序分為常規(guī)法和簡(jiǎn)便法1.常規(guī)篩選程序常規(guī)

46、篩選程序第一代：第一代：出發(fā)菌株出發(fā)菌株誘變誘變挑選菌落挑選菌落分離到平皿上分離到平皿上初篩初篩50株株復(fù)篩復(fù)篩35株株（提供第二代誘（提供第二代誘變出發(fā)菌株）變出發(fā)菌株）（有時(shí)還結(jié)合指（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或示劑，呈色劑或底物等）底物等）200個(gè)個(gè) 1瓶瓶/株株第二代：第二代：出發(fā)菌株出發(fā)菌株4株株分離到平皿上分離到平皿上誘變誘變（有時(shí)還結(jié)合指（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或示劑，呈色劑或底物等）底物等）挑菌落挑菌落100個(gè)菌落個(gè)菌落100個(gè)菌落個(gè)菌落100個(gè)菌落個(gè)菌落100個(gè)菌落個(gè)菌落初篩初篩50株株復(fù)篩復(fù)篩35株株（提供第三代誘（提供第三代誘變出發(fā)菌株）變出發(fā)菌株）第三代、第三代、 第四

47、代第四代直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。412.2.簡(jiǎn)便篩選程序簡(jiǎn)便篩選程序在常規(guī)篩選法基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)：在常規(guī)篩選法基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)：一方面，一方面，分離在平皿上的菌落采用瓊脂塊法，每代誘變處分離在平皿上的菌落采用瓊脂塊法，每代誘變處理后打理后打10003000塊瓊脂菌落，甚至更多；塊瓊脂菌落，甚至更多；另一方面，另一方面，初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析，采用簡(jiǎn)便、快速初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析，采用簡(jiǎn)便、快速的瓊脂平板測(cè)定法或其他簡(jiǎn)便方法。的瓊脂平板測(cè)定法或其他簡(jiǎn)便方法。42第一代：第一代：出發(fā)菌株出發(fā)菌株分離在平皿上分離在平皿上誘變誘變打瓊脂塊菌落打瓊脂塊菌落1000

48、3000檢定板上挑取檢定板上挑取5%10%透明圈、成色圈、抑菌透明圈、成色圈、抑菌圈大的菌落圈大的菌落初篩初篩12瓶瓶/株株3050株株復(fù)篩復(fù)篩35瓶瓶/株株35株株（提供第二代誘（提供第二代誘變的出發(fā)菌株）變的出發(fā)菌株）第二代：第二代：出發(fā)菌株出發(fā)菌株4株株誘變誘變分離在平皿上分離在平皿上打瓊脂塊菌落打瓊脂塊菌落10003000個(gè)菌株個(gè)菌株檢定板上挑取檢定板上挑取5%10%透明圈、成色圈、抑菌透明圈、成色圈、抑菌圈大的菌落圈大的菌落初篩初篩12瓶瓶/株株3050株株初篩初篩35瓶瓶/株株35株株（提供（提供第三代誘變的出第三代誘變的出發(fā)菌株）發(fā)菌株）第三代、第三代、 第四代第四代直到選育到符

49、合要求的優(yōu)良菌株。直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。43三、分離和篩選三、分離和篩選（一）隨機(jī)篩選（一）隨機(jī)篩選主要是隨機(jī)挑選的平板菌落進(jìn)行搖瓶篩選。主要是隨機(jī)挑選的平板菌落進(jìn)行搖瓶篩選。具體做法：具體做法：將誘變處理后的菌體分離在瓊脂平板上，培養(yǎng)將誘變處理后的菌體分離在瓊脂平板上，培養(yǎng)后隨機(jī)挑選菌落，一個(gè)菌落移入一只斜面，然后一個(gè)斜面后隨機(jī)挑選菌落，一個(gè)菌落移入一只斜面，然后一個(gè)斜面的菌體接入一只錐形三角瓶，搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定產(chǎn)物活的菌體接入一只錐形三角瓶，搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定產(chǎn)物活性的高低，決定取舍。性的高低，決定取舍。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不管種子或發(fā)酵過程的生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l件如何，不管種子或發(fā)酵過程的

50、生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l件如何，都與發(fā)酵大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。都與發(fā)酵大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。在突變概率小的情況下，如果菌落挑取少了，很難篩選到在突變概率小的情況下，如果菌落挑取少了，很難篩選到理想的突變株。高產(chǎn)菌株概率愈低篩選菌落數(shù)量就越大，理想的突變株。高產(chǎn)菌株概率愈低篩選菌落數(shù)量就越大，如果突變頻率為如果突變頻率為1%，那么初篩挑選菌落起碼要，那么初篩挑選菌落起碼要200個(gè)。個(gè)。44（二）平板菌落預(yù)篩（二）平板菌落預(yù)篩在誘變育種中，育種工作者常常根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，在誘變育種中，育種工作者常常根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，在瓊脂平板上設(shè)計(jì)許多巧妙的篩選方法和活性粗側(cè)方法。在瓊脂平

51、板上設(shè)計(jì)許多巧妙的篩選方法和活性粗側(cè)方法。大量菌落經(jīng)過平板預(yù)篩，可保留大量菌落經(jīng)過平板預(yù)篩，可保留5%10%的初篩菌株（約的初篩菌株（約200株），再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，復(fù)證被篩選菌株的重演性，同株），再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，復(fù)證被篩選菌株的重演性，同時(shí)從時(shí)從200株優(yōu)良菌株中篩選出更高產(chǎn)量的突變株。株優(yōu)良菌株中篩選出更高產(chǎn)量的突變株。1.根據(jù)形態(tài)篩選變株根據(jù)形態(tài)篩選變株部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性。理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性。在菌落形態(tài)變化方面還有這樣的趨向：原來具有較高發(fā)酵水在菌

52、落形態(tài)變化方面還有這樣的趨向：原來具有較高發(fā)酵水平的菌種作為出發(fā)菌株時(shí)，由突變引起形態(tài)劇烈變化的菌落是一平的菌種作為出發(fā)菌株時(shí)，由突變引起形態(tài)劇烈變化的菌落是一些代謝嚴(yán)重失調(diào)的菌株，常常負(fù)突變菌株占多數(shù)，而突變的高產(chǎn)些代謝嚴(yán)重失調(diào)的菌株，常常負(fù)突變菌株占多數(shù)，而突變的高產(chǎn)菌株其菌落形態(tài)往往處在常態(tài)的正常范圍內(nèi)，因?yàn)樗鼈兊倪z傳物菌株其菌落形態(tài)往往處在常態(tài)的正常范圍內(nèi)，因?yàn)樗鼈兊倪z傳物質(zhì)僅受到微小損傷，還保留了正常代謝的基本功能。質(zhì)僅受到微小損傷，還保留了正常代謝的基本功能。45經(jīng)長(zhǎng)期多代誘變后，高產(chǎn)菌株與其最原始的親代在經(jīng)長(zhǎng)期多代誘變后，高產(chǎn)菌株與其最原始的親代在形態(tài)特征上還是有顯著差異的，如菌

53、落生長(zhǎng)速度變慢，形態(tài)特征上還是有顯著差異的，如菌落生長(zhǎng)速度變慢，菌落直徑逐漸變小，菌落表面由平坦變成皺折或相反、菌落直徑逐漸變小，菌落表面由平坦變成皺折或相反、孢子由多變少，孢子顏色由一種變成另一種顏色。孢子由多變少，孢子顏色由一種變成另一種顏色。2.根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株通過瓊脂平板上的透明圈、呈色圈、抑菌圈及混濁圈等生通過瓊脂平板上的透明圈、呈色圈、抑菌圈及混濁圈等生化反應(yīng)來篩選水解圈、有機(jī)酸及抗生素等有益代謝產(chǎn)物。這些化反應(yīng)來篩選水解圈、有機(jī)酸及抗生素等有益代謝產(chǎn)物。這些方法可直接在瓊脂平板上定性和半定量檢測(cè)出微生物產(chǎn)物，它方法可直接在瓊脂平板上定性和半

54、定量檢測(cè)出微生物產(chǎn)物，它們不僅可用于野生種的篩選，而且也可用于誘變后高產(chǎn)突變株們不僅可用于野生種的篩選，而且也可用于誘變后高產(chǎn)突變株的篩選。的篩選。463.采用冷敏感菌篩選抗生素變株采用冷敏感菌篩選抗生素變株giuseppesatta等從人的病原菌中經(jīng)誘變分離出低溫敏感菌等從人的病原菌中經(jīng)誘變分離出低溫敏感菌變異株（稱冷敏菌）。在變異株（稱冷敏菌）。在20下這種冷敏菌不能生長(zhǎng)，但一般產(chǎn)下這種冷敏菌不能生長(zhǎng)，但一般產(chǎn)生抗生素的放線菌則能良好地生長(zhǎng)。生抗生素的放線菌則能良好地生長(zhǎng)。作為檢驗(yàn)菌的冷敏菌和誘變后的放線菌孢子懸浮液混合，分作為檢驗(yàn)菌的冷敏菌和誘變后的放線菌孢子懸浮液混合，分離在同一培養(yǎng)基

55、平板上，置于離在同一培養(yǎng)基平板上，置于20培養(yǎng)培養(yǎng)34d，抗生素產(chǎn)生菌生，抗生素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)不受干擾，能正常形成菌落。而冷敏菌不生長(zhǎng)或極微弱生長(zhǎng)。長(zhǎng)不受干擾，能正常形成菌落。而冷敏菌不生長(zhǎng)或極微弱生長(zhǎng)。當(dāng)放線菌菌落已經(jīng)成熟，并且抗生素產(chǎn)量已達(dá)高峰，將培養(yǎng)皿移當(dāng)放線菌菌落已經(jīng)成熟，并且抗生素產(chǎn)量已達(dá)高峰，將培養(yǎng)皿移至冷敏菌生長(zhǎng)最適得溫度（至冷敏菌生長(zhǎng)最適得溫度（37）下培養(yǎng)）下培養(yǎng)1820h，冷敏菌迅，冷敏菌迅速生長(zhǎng)，而此時(shí)在抗生素產(chǎn)生菌菌落周圍的冷敏菌因生長(zhǎng)受到抗速生長(zhǎng)，而此時(shí)在抗生素產(chǎn)生菌菌落周圍的冷敏菌因生長(zhǎng)受到抗生素的抑制而形成抑菌圈。根據(jù)菌落直徑與抑菌圈直徑之比的有生素的抑制而形成抑菌圈

56、。根據(jù)菌落直徑與抑菌圈直徑之比的有效值，可以直接篩選出抗生素高產(chǎn)突變株。效值，可以直接篩選出抗生素高產(chǎn)突變株。474.濃度梯度法濃度梯度法5.應(yīng)用復(fù)印技術(shù)快速篩選變株應(yīng)用復(fù)印技術(shù)快速篩選變株應(yīng)用復(fù)印技術(shù)從平板上可直接篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含應(yīng)用復(fù)印技術(shù)從平板上可直接篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含量的突變株，是產(chǎn)脂微生物的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法。采用該方法時(shí)，平量的突變株，是產(chǎn)脂微生物的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法。采用該方法時(shí)，平板上的單個(gè)菌落必須具備高脂含量，然后尋找一種可選擇的染色板上的單個(gè)菌落必須具備高脂含量，然后尋找一種可選擇的染色方法，使染料既不能被細(xì)胞吸收利用，又能滲入細(xì)胞的油滴內(nèi)，方法，使染料既不能被細(xì)胞吸

57、收利用，又能滲入細(xì)胞的油滴內(nèi)，同時(shí)可指示脂肪累積的濃度。同時(shí)可指示脂肪累積的濃度。下面介紹下面介紹euans等用復(fù)印技術(shù)測(cè)定不同酵母菌落胞內(nèi)脂肪含等用復(fù)印技術(shù)測(cè)定不同酵母菌落胞內(nèi)脂肪含量的簡(jiǎn)單定量法。采用該法時(shí)要注意篩選培養(yǎng)基的合理設(shè)計(jì)，因量的簡(jiǎn)單定量法。采用該法時(shí)要注意篩選培養(yǎng)基的合理設(shè)計(jì)，因?yàn)橐话惝a(chǎn)脂酵母只有在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中氮素耗盡并且有過量碳素用為一般產(chǎn)脂酵母只有在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中氮素耗盡并且有過量碳素用于脂類合成時(shí)，才能在細(xì)胞內(nèi)累積較多的脂類。于脂類合成時(shí)，才能在細(xì)胞內(nèi)累積較多的脂類。復(fù)印和染色方法如下：復(fù)印和染色方法如下：采用誘變產(chǎn)脂的限氮培養(yǎng)基制成平采用誘變產(chǎn)脂的限氮培養(yǎng)基制成平板，接種

58、菌體后置于板，接種菌體后置于30溫度下培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)34d，至菌落完全成熟和，至菌落完全成熟和足夠大小，約足夠大小，約23mm（稱母皿）；（稱母皿）；48在母皿上覆蓋一張濾紙（直徑在母皿上覆蓋一張濾紙（直徑9cm，1號(hào)），用號(hào)），用“絲絨印絲絨印模?！陛p輕一壓，然后取出已復(fù)印菌落的濾紙，置于輕輕一壓，然后取出已復(fù)印菌落的濾紙，置于50，干，干燥燥20min；將濾紙浸入含有蘇丹黑（質(zhì)量體積比為將濾紙浸入含有蘇丹黑（質(zhì)量體積比為0.08%，溶劑，溶劑95%乙醇）溶液的平皿內(nèi)，使其染色乙醇）溶液的平皿內(nèi)，使其染色20min；取出濾紙，在放入盛有取出濾紙，在放入盛有95%乙醇的平皿中洗去多余染料，乙醇

59、的平皿中洗去多余染料，輕輕搖動(dòng)輕輕搖動(dòng)3min；再將濾紙放入第三只含有再將濾紙放入第三只含有95%乙醇平皿中，使其脫色乙醇平皿中，使其脫色5min；使濾紙干燥，高脂酵母菌落呈現(xiàn)深藍(lán)色或紫色，而低脂菌使濾紙干燥，高脂酵母菌落呈現(xiàn)深藍(lán)色或紫色，而低脂菌落為淺藍(lán)色或無色。落為淺藍(lán)色或無色。該法能直接顯示微生物細(xì)胞脂的含量，它不僅可以篩選該法能直接顯示微生物細(xì)胞脂的含量，它不僅可以篩選自然界存在的不同產(chǎn)脂微生物。而且同樣可以篩選高脂的突自然界存在的不同產(chǎn)脂微生物。而且同樣可以篩選高脂的突變株和雜交的重組體，能適用于大規(guī)模高脂酵母或其他微生變株和雜交的重組體，能適用于大規(guī)模高脂酵母或其他微生物變株初篩。

60、物變株初篩。496.瓊脂塊大通量篩選變株瓊脂塊大通量篩選變株50抗藥性突變株的篩選抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)突變株抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)突變株濃度梯度法濃度梯度法梯度平板法梯度平板法弱抗性中抗性強(qiáng)抗性不含異煙肼接敏感菌含突變株52產(chǎn)量突變株的篩選 春日霉素生產(chǎn)菌的篩選春日霉素生產(chǎn)菌的篩選瓊脂塊培養(yǎng)法瓊脂塊培養(yǎng)法瓊脂塊大通量篩選變株該法是日本學(xué)者八木建立的，而該法是日本學(xué)者八木建立的，而ichilawa等在春等在春雷霉素選育中得到應(yīng)用，取得令人滿意的效果。雷霉素選育中得到應(yīng)用，取得令人滿意的效果。在我國也廣泛應(yīng)用于抗生素和酶類等突變株的篩在我國也廣泛應(yīng)用于抗生素和酶類等突變株的篩選。選。由于瓊脂塊法應(yīng)用