《基因工程的基本操作程序》

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的獲?。ㄇ疤幔⒛康幕虻墨@?。ㄇ疤幔? 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）4 4、目的基因的檢測與鑒定（保證）、目的基因的檢測與鑒定（保證）一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取獲取目的基因的常用方法獲取目的基因的常用方法（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@?。? 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增（3 3）利用）利用人工合成人工合成（DNADNA合成儀）合成儀）概念：概念：基因文庫基因文庫 （gene library）基因組文

2、庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫（如（如cDNA文庫）文庫） 將含有某種將含有某種生物不同基因的生物不同基因的許多許多DNA片段片段,導(dǎo)導(dǎo)入受體菌的群體入受體菌的群體中儲存中儲存,各個受體各個受體菌分別含有這種菌分別含有這種生物的不同的基生物的不同的基因因,稱為基因文庫稱為基因文庫基因文庫中包含了一種生物基因文庫中包含了一種生物所有的基因所有的基因,這種基因文庫叫這種基因文庫叫做基因組文庫做基因組文庫. 基因文庫中包含了一種生基因文庫中包含了一種生物的一部分基因物的一部分基因,這種基因這種基因文庫叫做部分基因文庫文庫叫做部分基因文庫.(1)從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因基

3、因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？依據(jù)依據(jù) 基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)方法：方法：“鳥槍鳥槍法法”又名又名 “霰霰彈法彈法”-核酸探針核酸探針PCR技術(shù)技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項生物是一項生物體外復(fù)制體外復(fù)制特定特定DNA片段的核酸片段的核酸合成合成技術(shù)技術(shù)。通

4、過此技術(shù)，可獲取大量的目的。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因基因。 原理：原理： 前提：前提： 條件條件PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀DNA復(fù)制復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列（便于合成引物）一段已知目的基因的核苷酸序列（便于合成引物）方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，方式擴(kuò)增， 即即_（n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)指數(shù)2 2n n模板模板DNA；DNA引物；四種脫氧核引物；四種脫氧核苷酸（原料）；熱穩(wěn)定苷酸（原料）；熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；酶）；（2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因n 過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至加熱至9095雙鏈DNA解鏈

5、成為單鏈DNA退火：冷卻至冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至加熱至7075以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性變性退火退火延伸延伸v（3） 人工合成法人工合成法 DNADNA合成儀合成儀根據(jù)已知的氨基酸序列合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成mRNA 反轉(zhuǎn)錄單鏈DNA DNA聚合酶聚合酶雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：化學(xué)合成法：化學(xué)合成法：缺點：由于一種氨基酸可由多種密碼缺點

6、：由于一種氨基酸可由多種密碼子決定，故推測的基因可能為新基因，子決定，故推測的基因可能為新基因，專一性不強(qiáng)專一性不強(qiáng)優(yōu)點：操作簡單優(yōu)點：操作簡單缺點：缺點：mRNAmRNA生存時間短，生存時間短，技術(shù)要求高，操作麻煩技術(shù)要求高，操作麻煩優(yōu)點：專一性強(qiáng)，準(zhǔn)確優(yōu)點：專一性強(qiáng)，準(zhǔn)確從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增利用人工合成利用人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法2構(gòu)建載體二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出露出_。（2 2）用）用_切斷目

7、切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。（3 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同1.1.過程過程: :質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶表表達(dá)達(dá)載載體體同種同種1.1.過程過程: :（重組載體）（重組載體）2.2.基因表

8、達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？它們有什么作用？a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚合酶聚合酶識別和結(jié)合的部位，識別和結(jié)合的部位， 有了它才有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA.位于基因的末端位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞關(guān)鍵關(guān)鍵1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法特點特點:能感染能感染雙子葉植物雙子葉植物和和祼子植物祼子植物,

9、對對單子葉植物無感染能力單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒質(zhì)粒的的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因構(gòu)建構(gòu)建表表達(dá)達(dá)載載體體導(dǎo)入導(dǎo)入植植物物細(xì)細(xì)胞胞插入插入植物細(xì)胞染植物細(xì)胞染色體色體DNA表達(dá)表達(dá)新新性性狀狀轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌（2）基因槍法）基因槍法 基因槍法又稱基因槍法又稱微彈轟擊法微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。的基因與其整合并表達(dá)的方法。（

10、3）花粉管通道法）花粉管通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞方法方法: 顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)操作程序操作程序:提純含目的基提純含目的基因表達(dá)載體因表達(dá)載體取受精卵取受精卵顯微注射顯微注射移植到子宮移植到子宮

11、受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育新性狀動物新性狀動物注入注入3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法常用法：Ca2+處理處理常用菌常用菌：大腸桿菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：過程：Ca2+處理處理大腸桿菌大腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體與感受態(tài)與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)胞吸收胞吸收DNA( (四四) )目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定保證保證檢測檢測導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞 染色體染色體DNADNA上上方法方法D

12、NADNA分子雜交分子雜交表達(dá)檢測表達(dá)檢測轉(zhuǎn)錄檢測轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交分子雜交翻譯檢測翻譯檢測抗原抗體抗原抗體雜交雜交分分子子檢檢測測法法鑒定鑒定抗蟲鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定抗病鑒定活性鑒定等活性鑒定等個體水平的鑒定個體水平的鑒定知識延伸知識延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因?；蚧颉７蔷幋a區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子終止子終止子基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)啟動子啟動子原核原核真核真核原核細(xì)胞原核